Artykuł metodologiczny

Prosty i skuteczny zabieg na hemostazę w tętnicach myszy

390 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

28 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego badania jest opracowanie skutecznej metody osiągania hemostazy w tętnicach myszy.

Streszczenie

Podczas nakłucia tętniczego lub kanilowacji u myszy często wymagana jest stała podwiązanie tętnicy ze względu na trudności z osiągnięciem hemostazy po wycofaniu igły. Prowadzi to do trwałego uszkodzenia niedokrwiennego w obszarze tkanek. Takie miejscowe niedokrwienie często powoduje powikłania wtórne, co kompromituje wyniki eksperymentów w modelach zwierzęcych. Obecna metoda ma na celu uszczelnienie miejsca nakłucia po zabiegu, przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowego przepływu krwi, co zapobiega niedokrwieniu pooperacyjnemu. Metoda ta polega na pobraniu fragmentu tkanki tłuszczowej od samego zwierzęcia doświadczalnego, wykonaniu nakłucia tętnic standardowymi technikami, a następnie owinięciu miejsca nakłucia tłuszczową poduszką, aby osiągnąć hemostazę przy jednoczesnym zachowaniu przepływu krwi. W tym badaniu wykonano obustronne nakłucie zwykłej tętnicy szyjnej u myszy, a następnie hemostazę z użyciem techniki owijania tłuszczu. Laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI) nie wykazało różnic w zmianach przepływu krwi w mózgu między grupą myszy z grupy myszy z operacją i operacją, a także nie zaobserwowano istotnych zmian w pomiarach przepływu krwi mózgowej przed operacją i po operacji. Ocena histologiczna przeprowadzona w 7, 14 i 28 dniach po operacji wykazała: (1) zachowała architekturę mózgu (barwienie H&E), (2) nienaruszoną morfologię neuronów bez zmian degeneracyjnych (barwienie Nissl) oraz (3) brak patologicznych zmian w przekrojach mózgu. Ta technika krwawienia tętniczego wykorzystuje elastyczność tkanki tłuszczowej oraz mechanizmy fizjologicznej krzepnięcia. Procedura polega na: (1) owinięciu autologicznego tłuszczu wokół miejsca nakłucia, (2) zabezpieczeniu go szwami w celu zapewnienia optymalnego kontaktu z przystankiem tętniczymi oraz (3) umożliwieniu uciekającej krwi przenikania styku tłuszczowo-tętnicowego, gdzie dochodzi do krzepnięcia. Ten mechanizm potrójnego działania zapewnia niezawodną hemostazę, jednocześnie zachowując przechodność tętnic i zapobiegając powikłaniom niedokrwiennym po operacji. Metoda wykazuje znaczącą prostotę proceduralną, skuteczność kliniczną oraz doskonały potencjał translacyjny.

Wprowadzenie

W modelach zwierzęcych tworzenie urazu tętnic jest szeroko stosowanym eksperymentalnym podejściem do modelowania różnych schorzeń patologicznych, w tym modeli niedokrwienia mózgu i reperfuzji, modeli miażdżycy szyjnej (CCA) lub aortalnej (AO) oraz modeli niedokrwienia rdzenia kręgowego.

Biorąc za przykład model mózgowo-niedokrwienno-reperzuyjnej (MCAO) u myszy, obecne standardowe podejściemodelowania 1,2,3 polega na: izolacji tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), podwiązaniu jej dalszego końca, zaciskaniu bliższego ECA klipsem tętniczym przy jednoczesnym założeniu szwu utrzymającego, tworzeniu otworu kłucia między tymi punktami, wprowadzeniu filamentu wstecznie przez CCA, zabezpieczenie naczynia i włókna szwem stójowym, przecięcie ECA między miejscem nakłucia a podwiązaniem dystalnym, uwolnienie klipsa tętnicowego, przekierowanie filamentu do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) w celu zatkania środkowej tętnicy mózgowej, a po wycofaniu filamentu podwiązanie bliższego ECA.

Chociaż zabieg ten prowadzi reperfuzję, jedynie przywraca przepływ krwi między wspólnym a ICA, pozostawiając ECA trwale odłączone. To przecięcie ECA powoduje uszkodzenia niedokrwienne w obszarach twarzy po stronie włócznej, co jest niezamierzonym urazem, który nie tylko utrudnia zabieg chirurgiczny, ale także wprowadza urazy doświadczalne, potencjalnie zaburzając wyniki badań. Co bardziej niepokojące, w niektórych protokołach eksperymentalnych 4,5 badacze wykonują bezpośrednie nakłucie CCA, wprowadza się szew w celu ustanowienia MCAO, a następnie natychmiast usuwa, po czym następuje trwałe podwiązanie obu końców miejsca nakłucia w celu hemostazy. Jednak ta metoda bezpośrednio podnosi ciśnienie naczyniowe, co podnosi obciążenie serca i potencjalnie prowadzi do niewydolności serca6.

Na przykładzie modelu uszkodzenia śródbłonka myszy CCA lub AO z dietą wysokotłuszczową do wykazania miażdżycy, konwencjonalna metoda 7,8,9,10 polega na nakłuciu tętnic w CCA, aortze brzusznej (AA) lub tętnicy udowej (CFA), włożeniu cewnika balonowego w celu wywołania denudacji śródbłonka oraz osiągnięciu hemostazy poprzez trwałe podwiązanie obu końców miejsca nakłucia. To standardowe podejście wiąże się z kilkoma kluczowymi ograniczeniami: obowiązkowa ligacja powoduje miejscową niedokrwienie dystalnie od miejsca zatkania. Co gorsza, nagromadzenie lipidów zachodzi w miejscach podwiązania. Ważność modelu kompromisowego jest zmieniana przez wpływ na lokalną hemodynamikę, która zakłóca dostarczanie leku w celu celu zmian i zniekształca wyniki oceny farmakologicznej.

W modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego u myszy procedura polega na nakłuciu tętnic (poprzez dostęp CCA, AA lub CFA), po czym następuje wprowadzenie cewnika balonowego, aby wywołać niedokrwienie w docelowych miejscach11. Po wycofaniu balonu konwencjonalna hemostaza jest osiągana przez trwałe podwiązanie miejsca nakłucia po obu stronach.

We wszystkich trzech wymienionych modelach hemostaza po punkcii jest jednolicie osiągana poprzez obustronną ligację miejsca nakłucia. Choć skuteczne w kontroli krwawienia, to podejście nieuchronnie prowadzi do miejscowej niedokrwienia, prowadząc do powikłań wtórnych, które ostatecznie podważają wiarygodność modelu. Utrzymanie przechodności naczyniowej podczas zabiegów hemostatycznych jest zatem istotne fizjologicznie i eksperymentalnie. Dlatego ten artykuł wprowadza innowacyjną, prostą i skuteczną metodę hemostazy tętnic do eksperymentów na myszy. Zabieg polega najpierw na zaciskaniu obu końców miejsca nakłucia za pomocą naczyń tętnicowych, a następnie owinięciu tętnicy poduszką tłuszczową o grubości 3 mm × 3 mm × 1 mm, aby zakryć nakłucie. Poduszka tłuszczowa jest zabezpieczona szwem więzowym wokół tętnicy. Klipsy tętnicze są stopniowo zwalniane, a napięcie wiązy jest dostosowywane w zależności od krwawienia, aż do osiągnięcia pełnej hemostazy. Takie podejście przywraca przepływ krwi, utrzymuje prawidłową hemodynamikę i zapobiega uszkodzeniom niedokrwiennym tkanek wokół ciała spowodowanym trwałą ligacją naczyń. Jest to szczególnie korzystne dla długoterminowej obserwacji stanów myszy po modelowaniu oraz oceny interwencji farmakologicznych, co znacząco zwiększa rygor eksperymentalnych badań przedklinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane w ścisłej zgodności z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użycia zwierząt laboratoryjnych (Protokół Zatwierdzający nr SNLL25040501; Licencja na używanie zwierząt nr SYXK(Liao)2021 - 0010) ustanowiona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) Uniwersytetu Rolniczego Shenyang. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Szczegóły i dokumentacja dotycząca zwierząt: Dokumentuj wszystkie dane z badań na zwierzętach zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Badania na zwierzętach: raportowanie eksperymentów in vivo). Używaj samców myszy Balb/C w wieku 6-8 tygodni, ważących 22 g ± 4 g. Utrzymuj warunki mieszkaniowe na poziomie 24 ± 2 °C przy wilgotności względnej 55% ± 5% w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulać myszy za pomocą waporyzatora izofluranowego (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Indukuj znieczulenie 4% izofluranem, a następnie utrzymuj znieczulenie 2% izofluranem. Stosuj maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec suchości podczas znieczulenia. Po wprowadzeniu znieczulenia podawaj karprofen w dawce 5 mg/kg podskórnie myszom w celu leczenia przeciwbólowego śródoperacyjnego i pooperacyjnego.
    2. Po znieczuleniu należy depilować okolice szyjki i czaszki oraz zdezynfekować odsłoniętą skórę jodem povidonowym, a następnie użyć 75% etanolu, aby usunąć resztki.
    3. Umieść myszy na termoforze o temperaturze 37 °C podczas wszystkich kolejnych procedur eksperymentalnych.
  3. Pomiar wyjściowego przepływu krwi w mózgu u myszy
    1. Ustaw myszy w pozycji leżącej. Potwierdź plan znieczulenia chirurgicznego przed rozpoczęciem operacji przy odpowiednim monitorowaniu (np. uszczypnięcie palca). Wykonaj nacięcie na głowie w linii środkowej, aby odsłonić kości ciemieniowe. Ostrożnie rozczłonkuj i usuń pokrywę powięzi z powierzchni czaszki.
    2. Dostosuj system LSCI do skanowania odsłoniętej kości ciemieniowej myszy pod 10-krotnym powiększeniem i zapisuj podstawowe dane przepływu krwi w mózgu.
  4. Pobierz poduszkę tłuszczową i wykonaj nakłucie tętnic
    1. Przestaw myszy na plecach. Zrób nacięcie szyjki pośrodkowej. Pobierz przeszczep tkanki tłuszczowej o grubości 3 mm × 3 mm × 1 mm do późniejszego użytku.
    2. Wykonaj tępe rozwarstwienie gruczołu podżuchwy, mięśnia mostkowego oraz mięśnia mostkowo-dwu-naczyniowego. Eksponuj oba CCA.
    3. Uwolnić CCA, by ujawnić ICA i ECA.
    4. Załóż zacisk naczyniowy 1 na dalszy koniec CCA i załóż zacisk naczyniowy 2 na końcu bliższym.
    5. Przekłuj CCA między dwoma zaciskami igłą 23G.
  5. Nakładanie tłuszczowej poduszki
    1. Po usunięciu igły owiń CCA w miejscu nakłucia powierzchnią przeciętej (nie-serosa) poduszki tłuszczowej.
    2. Pod obszarem owiniętym tłuszczem umieść szew 4-0; następnie delikatnie przywiąż pojedynczy rzut na powierzchni tłuszczu, aby wywierać nacisk zapewniający bezpieczny kontakt między poduszką tłuszczową a ścianą naczynia; Na koniec stopniowo dostosowuj ligaturę, aby osiągnąć równowagę ciśnieniową podczas hemostazy.
    3. Podnieś dystalne CCA wilgotnym patyczkiem do kostymu. Zwolnij uchwyt naczyniowy nr 1 i powoli wyjmij wymaz, aby umożliwić stopniowy przepływ krwi w kierunku miejsca nakłucia.
    4. Sprawdź przepływ krwi; jeśli zaobserwowano aktywne krwawienie, należy ponownie zacisnąć dystalne CCA zaciskiem naczyniowym 1.
    5. Odczekaj 1 minutę, potem powoli zwolnij zacisk naczyniowy 1; jeśli pojawi się krwawienie, przesuń poduszkę tłuszczową lub lekko dokręć pojedynczy rzut ligatury, aby zwiększyć nacisk; Kontynuuj te korekty aż do osiągnięcia pełnej hemostazy.
    6. Podnieś proximalny CCA za pomocą nawilżonego wacika. Zwolnij ukrycie naczyniowe nr 2 i stopniowo wyciągnij wymaz, aby umożliwić kontrolowany przepływ krwi w kierunku miejsca nakłucia.
    7. Jeśli pojawi się krwawienie, ponownie zaciskaj dalszy CCA zaciskiem naczyniowym 2.
    8. Delikatnie dokręć pojedynczy ruch szwu, aby zwiększyć ciśnienie; odczekaj 1 minutę, następnie podniesiej bliższy CCA i zwolnij zacisk naczyniowy 2; powoli toczył nawilżony wacik w kierunku miejsca nakłucia.
    9. Jeśli krwawienie się utrzyma, powtórz dwa poprzednie kroki, aż osiągniesz pełną hemostazę.
    10. Dodatkowo załóż przy szwie, aby utworzyć podwójny węzeł na początkowym, co lepiej przymocuje poduszkę tłuszczową do ściany naczynia i osiąga hemostazę dzięki zrównoważonym ciśnieniom wewnątrznaczyniowym i zewnętrznym.
    11. Potwierdź, że wspólne tętnice szyjne po obu stronach poduszki tłuszczowej były wypełnione i wykazują stałą średnicę naczyń; Traktuj to jako udane przywrócenie przepływu krwi i hemostazy.
    12. Powtórz ten sam zabieg, aby wykonać hemostazę kłucia na przeciwległej tętnicy szyjnej wspólnej.
    13. Odsłonięcie obustronnych wspólnych tętnic szyjnych u myszy pozorowanych bez przeprowadzania nakłucia tętnic czy owijania tłuszczowej poduszki, przy zachowaniu wszystkich pozostałych procedur identycznych jak w grupie operowanej.
    14. Zszyj nacięcie chirurgiczne szyjki i nałóż środek odkażający.
  6. Przeprowadzenie pooperacyjnej oceny przepływu krwi w mózgu
    1. Po zakończeniu obustronnej hemostazy CCA u myszy, dostosuj system LSCI, aby skanować odsłoniętą kość ciemieniową i uzyskać obrazy 10-krotnie powiększone; Następnie zapisz zmiany przepływu krwi w mózgu.
    2. Zszyj nacięcie na skórze głowy i nałóż antyseptyk, pozwól myszom na poduszce grzewcze o temperaturze 37 °C, zanim odłożysz je do klatki w celu dalszej opieki.
  7. Wykonywanie monitorowania pooperacyjnego i pobierania tkanek
    1. Codziennie monitoruj i rejestruj stan przeżycia, aktywność ruchową oraz wszelkie oznaki krwawienia w okolicy szyjki i kości myszy w okresie pooperacyjnym.
    2. W dniach 7, 14 i 28 po operacji uśpij myszy dwutlenkiem węgla (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi) i utrwalaj tkanki mózgowe w 4% paraformaldehydu.

2. Badanie patologiczne

  1. Po 24-godzinnej fiksacji odwodnij tkanki mózgowe przez gradient etanolowy, przeczyszczony ksylenem i osadzony w parafinie do sekcjonowania.
  2. Wykonaj barwienie H&E na przekrojach hipokampa i zbadaj morfologię tkanki mózgowej pod mikroskopem.
  3. Wykonaj barwienie Nissl na przekrojach hipokampa i zbadaj architekturę neuronów pod mikroskopem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza danych z laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym przed i pooperacyjnym oraz pomiarów perfuzji względnej zarówno w grupie pozorowanej, jak i operowanej nie wykazały istotnych zmian, co wykazało, że ta technika hemostazy tętnicy skutecznie uszczelniła wspólne miejsce nakłucia tętnicy szyjnej bez utraty przepływu krwi w mózgu (Rysunek 1).

Myszy w operowanej grupie były nieprzerwanie monitorowane przez 28 dni po operacji, nie zaobserwowano śmiertelności....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W modelach MCAO zachowanie ECA lepiej odzwierciedla patologię kliniczną, zapobiegając uszkodzeniom niedokrwiennemu twarzy związanym z podwiązywaniem i przecięciem ECA. Choć konwencjonalne podejście polegające na wszczepieniu filamentu przez nakłucie CCA oferuje techniczną prostotę, wymaga obustronnej ligacji miejsca nakłucia, co skutkuje perfuzją mózgową zależną od krążenia bocznego Circle of Willis, co jest suboptymalnym odzwierciedleniem prawdziwej patofizjologii udaru. Technika hemostazy poduszki tłuszczowej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Prace te zostały wsparte przez Celny Generalny Grant Badawczy (Grant nr 2025HK006) pod nazwą "Badania i rozwój oraz zastosowanie technologii wykrywania patogenów multipleksowych dla chorób zakaźnych przenoszonych przez wektory na obszarach przygranicznych północnych Chin". Prace te były również wspierane przez Narodowy Kluczowy Program R&D Chin (Grant nr 2022YFC2302700) oraz Międzynarodowy Program Współpracy Naukowo-Technologicznej Ministerstwa Nauki i Technologii (Grant nr KY201901014). Udane opracowanie tej metody hemostazy tętniczej zawdzięcza głęboką wdzięczność profesorowi Perry'emu (redaktorowi naczelnemu The Perry Manual of Mouse Experiments) za jego fachowe wsparcie oraz firmie RWD Life Science Co., Ltd. (Shenzhen) za dostarczenie systemu obrazowania kontrastu z laserowym spektrum. Serdeczne podziękowania złożono profesorowi Han Xiaohu, naszemu mentorowi, oraz Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd. za ich bezcenne wsparcie. Serdeczne podziękowania składamy również wszystkim współpracownikom, którzy umożliwili realizację tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-0 z igłą do szycia z niciąShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd
Mysz Balb/CBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd6-8 tygodni, mężczyzna
Piekarnik do podgrzewania i suszenia serii DHGShanghai Yiheng Technology Co., LtdDHG-9123A
Hematoksylina i eozyna (H& E) Zestaw do bejcowania w wysokiej rozdzielczościServicebioG1076-500ML
IzofluranShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR510-22
Laserowy analizator plamkowyShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdRFLSI ZW
Roztwór barwnika NisslServicebioG1036-100ML
Maszyna do osadzania organizacjiLeicaHistoCore Arcadia H
System obrazowania ze szkiełkamiShenzhen Shengqiang Technology Co., LtdSQS-40R
Aparat do znieczulenia dla małych zwierzątShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR500
Suszarka tkankowaLeicaPerła HistoCore
System Ultraczystej WodyThermo50132370
Ultracienki półautomatyczny mikrotomLeicaHistoCore MULTICUT

Bibliografia

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hemostaza t tniczaowijanie t uszczemnak ucie t tnicy mysiejt tnica szyjna wsp lnaautologiczny przeszczep t uszczowyzachowanie przep ywu krwiobrazowanie laser specklem zgowy przep yw krwizapobieganie niedokrwieniuocena histologiczna

Powiązane artykuły