Artykuł metodologiczny

Testy toksyczności rozwojowej oparte na monitorowaniu sygnału czynnika wzrostu fibroblastów w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych w czasie rzeczywistym

956 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68910

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Engineering, Yokohama National University, 2Division of Cellular & Molecular Toxicology, Center for Biological Safety & Research, National Institute of Health Sciences, 3Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 4Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology (KISTEC)

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu przedstawiamy test in vitro komórkowy do identyfikacji teratogenicznych substancji chemicznych. Dynamikę sygnalizacji czynników wzrostu fibroblastów (FGF)/współczynnika odpowiedzi surowicy (SRF) mierzono w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych (iPS), a ryzyko teratogenności oceniano poprzez kwantyfikację chemicznego zakłócenia tego szlaku sygnalizacyjnego.

Streszczenie

Toksyczność rozwojowa (Devtox) jest zazwyczaj oceniana w modelach zwierzęcych. Jednak istnieją wyzwania związane z zapewnieniem dokładności, takie jak fałszywie negatywne wyniki wynikające z różnic międzygatunkowych oraz kwestie etyczne dotyczące dobrostanu zwierząt. Dlatego istnieje potrzeba nowych systemów testowych do oceny ludzkiego Devtox i pomocy w rozwiązywaniu tych problemów. Wysunęliśmy hipotezę, że teratogeny zakłócają szlaki sygnalizacyjne związane z Devtoxem, niezbędne do morfogenezy, niezależnie od ich celów molekularnych. Aby przetestować tę hipotezę, opracowaliśmy system raportu fibroblastowego czynnika wzrostu (FGF) wykorzystujący ludzkie indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPS). System ten umożliwia ilościowe określenie zakłóceń sygnału spowodowanych przez chemikalia, osiągając dokładność 83% dla znanych związków teratogenicznych i nieteratogenicznych. Ponieważ aktywność sygnalizacji Devtox zmienia się w czasie, ważne jest, aby rejestrować jej dynamikę w ciągu ciągłości, a nie mierzyć ją w jednym punkcie końcowym. Użycie systemu pomiaru luminescencji w czasie rzeczywistym jest opcjonalne, ale zwiększa rozdzielczość czasową przy mniejszym wysiłku. Cały test można zakończyć w ciągu tygodnia, od zasiewania komórek w płytce hodowlowej po pozyskanie danych luminescencyjnych.

Wprowadzenie

Niektóre substancje chemiczne powodują toksyczność rozwojową (Devtox), w tym opóźnienia wzrostu, deformacje, deficyty funkcjonalne oraz śmierć1. Ocena Devtox jest niezbędna, aby zapewnić bezpieczeństwo farmaceutyków i pestycydów2. Obecne testy Devtox zazwyczaj opierają się na wielu modelach zwierzęcych. Jednak ze względu na różnice międzygatunkowe, modele zwierzęce mają wrodzone ograniczenia przy ekstrapolacji wyników na ludzi3. Talidomid, znany toksyn rozwojowy, został po raz pierwszy przepisany kobietom w ciąży pod koniec lat 50. XX wieku w celu złagodzenia porannych mdłości. Chociaż teratogenność nie zaobserwowano u gryzoni, na całym świecie zgłaszano poważne malformacje kończyn u noworodków. Ta tragedia uwypukliła ograniczenia testów bezpieczeństwa na zwierzętach i skłoniła międzynarodowe działania na rzecz wprowadzenia i aktualizacji wytycznych dotyczących testów Devtox4. Ponadto istnieją obawy dotyczące dobrostanu zwierząt oraz znacznego czasu i kosztów wymaganych na testy zwierząt. Dlatego potrzebne są alternatywne testy in vitro, które mogą dokładnie przewidzieć Devtox u ludzi.

Tutaj proponujemy test in vitro do oceny toksycznych substancji rozwojowych na podstawie zakłóceń szlaków sygnalizacyjnych kluczowych dla rozwoju embrionalnego 6,7,8. Test przeprowadzany jest przy użyciu ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) genetycznie modyfikowanych do ekspresji lucyferazy NanoLuc (Nluc), luminescencyjnego genu reportera, pod kontrolą elementu odpowiedzi surowicy (SRE). SRE jest miejscem wiązania czynnika odpowiedzi surowicy (SRF), który jest czynnikiem transkrypcyjnym w szlaku sygnalizacji fibroblastowego czynnika wzrostu (FGF). SRF integruje sygnały z wielu ligandów i reguluje ekspresję ponad 200 genów, które odgrywają istotną rolę w różnorodnych procesach biologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym9.

W tym teście komórki reporterowe były wystawione na działanie chemikalia testowego i stymulowane FGF, aby aktywować sygnalizację i wzmocnić wszelkie zakłócenia ze strony substancji. Kluczową cechą tego testu jest uchwycenie dynamiki aktywności sygnalizacyjnej w miarę zmian intensywności luminescencji. Ponieważ aktywność sygnalizacji zmienia się w czasie, pomiary punktów końcowych w jednym punkcie czasowym mogą być niedokładne10. Rzeczywiście, pomiary w siedmiu punktach czasowych w ciągu 24 godzin wykazały poprawę dokładności predykcyjnej, z wartością powierzchni pod krzywą (AUC) wynoszącą 0,837.

Chemikalia testowe mogą być stosowane w szerokim zakresie stężeń, od 0,01 ng/mL do 1000 μg/mL, w zależności od cytotoksyczności i rozpuszczalności. Do zasiewania jednej płyty z 96 dołkami potrzeba około 1,4× 10 4 komórek. Ograniczeniem tego testu jest to, że teratogeniczne substancje chemiczne mogą nie być wykrywalne, jeśli działają przez cele niewyrażane w niezróżnicowanych ludzkich komórkach iPS. Ponadto test ten może nie wykryć metabolitów teratogenicznych. Ponadto nie zawiera szczegółowych mechanizmów leżących u podstaw toksyczności teratogennej ani jej konkretnych skutków.

Zastosowanie systemu monitorowania luminescencji w czasie rzeczywistym dodatkowo poprawia rozdzielczość czasową, zmniejsza pracę wymaganą do ciągłych pomiarów oraz minimalizuje artefakty wynikające z wielokrotnego kontaktu z płytami hodowlanymi. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół dla testu Devtox opartego na zakłóceniach sygnału. Cały zabieg można zakończyć w ciągu tygodnia. To podejście można zautomatyzować, co nadaje się do badań chemicznych i przyczynia się do zmniejszenia liczby testów na zwierzętach.

Protokół

W badaniu wykorzystano ludzkie komórki iPS (201B7), przy czym gen Nluc był kontrolowany przez element odpowiedzi surowicy (SRE) wbity do locus Adeno-Associated Virus Integration Site 1 (AAVS1) za pomocą systemu CRISPR-Cas9 (Rysunek 1A). Szczegóły edycji genów dla komórek reporterskich (SRE-Nluc-knocked-in ludzkich komórek iPS) zostały podane w innych miejscach6. Protokół zasadniczo dzieli się na trzy etapy: 1) badanie cytotoksyczności substancji chemicznej w celu określenia jej maksymalnego stężenia narażenia, 2) testy zakłóceń sygnału oraz 3) analiza danych.

Aby zminimalizować wpływ parowania ośrodka, wszystkie eksperymenty hodowli komórkowej wykonuj na centralnych 60 studniach płyty 96-dołowej oraz dodawaj wodę do najbardziej zewnętrznych studni i przestrzeni między odwiertami. Podczas inkubacji przykryj płytę przepuszczalną folią uszczelniającą, aby jeszcze bardziej ograniczyć parowanie.

1. Przygotowanie komórek

  1. Komórki reporterów hodowli przez co najmniej 2 tygodnie po rozmrożaniu mrożonego materiału. Utrzymuj komórki w 7-dniowym powtarzalnym harmonogramie i używaj komórek z dnia 7 do testu. Zoptymalizuj gęstość siewu do ~80% zbiegu w dniu przepływu.
  2. Rozstrzygnij pojedyncze komórki w dawce 2,0 × 105 komórek /dołek w sześciodołowej płytce powlekanej ECM, z 2 mL świeżego medium podtrzymującego uzupełnionym inhibitorem ROCK o stężeniu 10 μM.
  3. Po 24 godzinach zamień podłoże na 2 mL/dołek świeżego podłoża konserwacyjnego.
  4. Po 72 godzinach zbieraj komórki za pomocą enzymatycznego reagenta dysocjacyjnego, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Nasiona o pojemności 1,0 ×10 5 komórek/dołek w płytkach z sześcioma dołkami pokrytą ECM, z 2 ml świeżego podłoża konserwacyjnego uzupełnionym inhibitorem ROCK o stężeniu 10 μM.
  5. Po 24 godzinach zamień medium na 4 mL/well świeżego medium konserwacyjnego.
  6. Po 96 godzinach zbieraj komórki jako zawiesinę pojedynczą komórkę za pomocą enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego. Użyj tych komórek do testu reportera.

2. Badanie cytotoksyczności

  1. Test wstępny
    1. Rozstrzygnij pojedyncze komórki w 2,0 ×10 4 komórek /dołek w płytkach z powłoką ECM z 96 dołkami z 200 μL świeżego podłoża podtrzymującego i uzupełnionym inhibitorem ROCK o stężeniu 10 μM. Uszczelnij płytę warstwą przepuszczalną dla gazów.
    2. Po 24 godzinach zamień medium na 200 μL/włążek świeżego medium konserwacyjnego i ponownie uszczelnij płytę filmem przepuszczającym gazy.
    3. Po 72 h zastąpić medium medium o pojemności 100 μL/włon i ponownie uszczelnić płytę warstwą przepuszczalną dla gazów.
    4. Po 96 godzinach zastąpić podłoże 100 μL/dołek podłoża testowego.
      UWAGA: Jeśli nie osiągniesz 100% konflugencji, przerwij badanie. Ponieważ tempo wzrostu może się różnić w zależności od linii komórkowej, zoptymalizuj gęstość siewienia, aby zapewnić pełne zbieganie się w dniu badania.
    5. Rozpuść substancję testową w medium testowym do maksymalnej rozpuszczalności.
      UWAGA: Gdy jako rozpuszczalnik używa się dimetylosulfoksydu (DMSO), końcowe stężenie DMSO nie może przekraczać 0,1%.
    6. Przygotuj pięciopunktowe, pięciokrotne seryjne rozcieńczenie substancji testowej w medium testowym, używając roztworu z etapu 2.1.5.
    7. Dodaj 11 μL/dołek roztworów chemicznych z etapu 2.1.6. Do sterowania pojazdem dodaj 11 μL/włon medium testowego zawierającego to samo stężenie DMSO.
    8. Po 48 godzinach inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 30 minut.
    9. Dodaj 111 μL/dołek prewyrównanego odczynnika na bazie luminescencyjnych komórek luminescencyjnych w temperaturze 25 °C. Dla pustego środka przygotuj dołek zawierający 111 μL medium testowego i 111 μL odczynnika.
    10. Potrząsaj płytą przy 300 obr./min przez 2 minuty, używając mikropłytowego shakera.
    11. Przelej 200 μL mieszaniny na czarną płytkę do pomiaru luminescencji. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
    12. Zmierz intensywność luminescencji, aby oszacować liczbę komórek.
    13. Oblicz żywotność komórek według następującego wzoru:
      Żywotność komórek (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
      UWAGA: Określ kolejne kroki na podstawie żywotności komórek. Jeśli żywotność wynosi >50% przy wszystkich testowanych stężeniach, przejdź do kroku 2,2 z maksymalnym stężeniem rozpuszczalności. Jeśli żywotność przekracza 50% w przebiegu testu, przystąpi się do testu determinacyjnego z użyciem najwyższego stężenia o żywotności >50%. Jeśli żywotność wynosi <50% przy wszystkich stężeniach, powtórz test wstępny, zaczynając od niższego stężenia.
  2. Test determinacji
    1. Rozstrzygnij pojedyncze komórki w dawce 2,0 × 104 komórek/dołek w płytce 96-dołkowej pokrytej ECM, z 200 μL świeżego medium podtrzymującego uzupełnionym inhibitorem ROCK o stężeniu 10 μM. Uszczelnij płytę warstwą przepuszczalną dla gazów.
    2. Po 24 godzinach zamień medium na 200 μL/włążek świeżego medium konserwacyjnego i ponownie uszczelnij płytę filmem przepuszczającym gazy.
    3. Po 72 h zastąpić medium medium o pojemności 100 μL/włon i ponownie uszczelnić płytę warstwą przepuszczalną dla gazów.
    4. Po 96 godzinach zastąpić podłoże 100 μL/dołek podłoża testowego.
      UWAGA: Jeśli nie osiągniesz 100% konflugencji, przerwij badanie. Zoptymalizuj gęstość siewu, aby zapewnić pełne zbieganie się już 4 dnia.
    5. Rozpuść substancję testową w medium testowym zgodnie z wynikami testu wstępnego (Krok 2.1).
    6. Przygotuj dziewięciopunktowe, dwukrotne rozcieńczenie seryjne substancji testowej w medium testowym, używając roztworu ze Kroku 2.2.5.
    7. Dodaj 11 μL/dołek roztworów chemicznych od etapu 2.2.6. Do sterowania pojazdem dodaj 11 μL/włon medium testowego zawierającego to samo stężenie DMSO.
    8. Po 48 godzinach inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 30 minut.
    9. Dodaj 111 μL/dołek prewyrównanego odczynnika na bazie luminescencyjnych komórek luminescencyjnych w temperaturze 25 °C. Dla pustego środka przygotuj dołek zawierający 111 μL medium testowego i 111 μL odczynnika.
    10. Potrząsaj płytą przy 300 obr./min przez 2 minuty, używając mikropłytowego shakera.
    11. Przelej 200 μL mieszaniny na czarną płytkę do pomiaru luminescencji. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
    12. Zmierz intensywność luminescencji, aby oszacować liczbę komórek.
    13. Oblicz żywotność komórek według następującego wzoru:
      Żywotność komórek (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
    14. Wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź na podstawie danych z dziewięciu stężeń i oblicz IC50 na podstawie krzywej.

3. Analiza reportera w czasie rzeczywistym (Rysunek 1B)

  1. Rozstrzygnij pojedyncze komórki w dawce 2,0 × 104 komórek/dołek w płytkach 96-dołkowej pokrytej ECM, z 200 μL świeżego podłoża podtrzymującego uzupełnionym inhibitorem ROCK o stężeniu 10 μM. Uszczelnij płytę warstwą przepuszczalną dla gazów.
  2. Po 24 godzinach zamień medium na 200 μL/włążek świeżego medium konserwacyjnego i ponownie uszczelnij płytę filmem przepuszczającym gazy.
  3. Po 72 h zastąpić medium medium o pojemności 100 μL/włon i ponownie uszczelnić płytę warstwą przepuszczalną dla gazów.
  4. Po 96 h zastąpić podłoże 100 μL/dołek podłożem testowym zawierającym 1% luminescencyjnego podłoża.
    UWAGA: Jeśli nie osiągniesz 100% konflugencji, przerwij badanie. Ponieważ tempo wzrostu może się różnić w zależności od linii komórkowej, zoptymalizuj gęstość siewów, aby zapewnić pełne zbieganie się już 4 dnia.
  5. Rozpuszcz substancję testową w medium testowym w stężeniu określonym w Sekcji 2.
  6. Przygotuj ośmiopunktowe, dwukrotne seryjne rozcieńczenie substancji testowej w medium testowym, zaczynając od roztworu przygotowanego w kroku 3.5.
  7. Dwie godziny po wymianie medium w kroku 3.4 dodaj 11 μL/dołek roztworów chemicznych ze kroku 3.6. Do sterowania pojazdem dodaj 11 μL/włon medium testowego zawierającego to samo stężenie DMSO.
  8. Godzinę po rozpoczęciu ekspozycji chemicznej (Krok 3.7) dodaj 12 μL/dołek medium testowego zawierającego bFGF do końcowego stężenia 2 ng/mL.
  9. Mierz luminescencję nieprzerwanie przez 48 godzin za pomocą systemu pomiaru luminescencji w czasie rzeczywistym w nawilżonej atmosferze, 5% CO2 w 37 °C.
    UWAGA: Ustaw czas 0 w punkcie dodawania FGF (patrz Rysunek 1B).

4. Analiza danych (Rysunek 1C)

  1. Oblicz log2-krotną zmianę (LogFC) intensywności luminescencji, normalizując grupę testową do sterowania pojazdem:
    LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle)
  2. Integruj LogFC na 48-godzinnym szeregu czasowym, aby oszacować obszar między krzywymi (ABC) dla grup testowych i kontrolnych pojazdów.
  3. Suma wartości ABC dla wszystkich stężeń w celu ilościowego określenia ogólnego zakresu zakłóceń sygnału spowodowanych przez badającą substancję.
  4. Wykonaj analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), aby określić próg klasyfikacji Detox.

Wyniki

Z naszego doświadczenia wynika, że morfologia komórek jest przydatna do określenia, czy test został wykonany poprawnie. Rysunek 2A przedstawia typowe obrazy komórek mikroskopią konfokalną bezpośrednio przed i po ekspozycji chemicznej. Na końcu badania niemal cała powierzchnia dołków jest pokryta komórkami. Rysunek 2B przedstawia obrazy barwienia żywych/martwych komórek. Liczba martwych komórek barwionych jodkiem propidium (PI) wzrasta po ekspozycji chemicznej; jednak żywotność komórek wynosi co najmniej 50%, a niemal wszystkie komórki są barwione kalcein-AM.

Tabela 1 przedstawia chemikalia testowe użyte w naszych poprzednich badaniach 7,8. Badania te pokazują, że chemikalia Devtox można rozróżnić z większą dokładnością na podstawie zakłócenia sygnału FGF w ludzkich komórkach iPS. Kluczowym odkryciem jest to, że ciągłe monitorowanie aktywności sygnalizacyjnej jest kluczowe, ponieważ zmienia się ona dynamicznie w czasie. Zastosowanie systemu pomiaru luminescencji w czasie rzeczywistym zapewnia znacznie wyższą rozdzielczość czasową przy mniejszym wysiłku pomiarowym. Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący system monitorowania w czasie rzeczywistym.

Rysunek 3A pokazuje zmiany intensywności luminescencji w ciągu 48 godzin w sześciu odwiertach replikujących się w tych samych warunkach bez użycia substancji testowej. Sześć krzywych jest niemal wyrównanych, co wskazuje na dobrą powtarzalność od dołnego do dobrego. Chociaż nie zostały one wyraźnie zidentyfikowane w 24-godzinnych pomiarach ręcznych w naszych poprzednich badaniach, dwa wyraźne szczyty — początkowy szczyt bezpośrednio po dodaniu ligandu FGF oraz drugi szczyt około 24 godziny — pojawiają się w pomiarach w czasie rzeczywistym na 48 godzin. Rysunek 3B pokazuje zmiany intensywności luminescencji po ekspozycji na kwas walproinowy (VPA), dobrze znany toksyn rozwojowy. VPA to inhibitor deacetylazy histonowej, który powoduje defekty w cewiewie nerwowej, sercu i kończynach¹¹. VPA zakłóca sygnalizację FGF w sposób zależny od koncentracji. Zautomatyzowany system pomiarów w czasie rzeczywistym rejestrował dynamikę sygnału dokładniej niż pomiary ręczne.

figure-results-1
Rysunek 1: Test zakłóceń sygnału FGF/SRF. (A) Inżynieria genetyczna ludzkich komórek iPS w celu generowania komórek sygnałowych FGF/SRF. Skonstruowano plazmid zawierający Nluc poniżej elementu odpowiedzi surowicowej, homologiczne ramiona do ukierunkowanego knock-inu oraz gen oporności na puromycynę pod kontrolą ludzkiego promotora kinazy fosfoglicerianowej. Po selekcji puromycyny utworzono komórki reporterowe SRE-Nluc. (B) Harmonogram testu. Komórki reportera zostały zasiane w płycie z 96 dołkami i uprawiane przez 4 dni, aby pokryć całą powierzchnię. Podłoże luminescencyjne i substancja testowa zostały dodane odpowiednio 3 i 1 godzinę przed rozpoczęciem pomiaru. Czas dodawania ligandów FGF został ustawiony na 0 godzin, a intensywność luminescencji była nieprzerwanie mierzona przez kolejne 48 godzin (C) Analiza danych. Dynamika sygnału była rejestrowana w komórkach narażonych i nienarażonych na chemikalia testowe, a następnie normalizowana do sterowania pojazdem, aby oszacować pole między krzywymi jako stopień jako miara zakłóceń sygnału spowodowanych przez substancję chemiczną. Dla każdego związku, w różnym stężeniu, uzyskano wartości ABC i obliczono ich sumę. Analiza krzywej charakterystyki pracy odbiornika została przeprowadzona przy użyciu wszystkich znanych toksycznych substancji rozwojowych w celu określenia progu. Skróty: iPS = indukowane pluripotentne komórki macierzyste; RLU = jednostka względnej światła; AUC = Powierzchnia pod krzywą; FGF = czynnik wzrostu fibroblastów; SRF = współczynnik odpowiedzi surowicy; SRE = element odpowiedzi surowicowej; HA = ramię homologiczne; L = lewo; R = prawo; PuroR = gen oporności na puromycynę; hPGK = kinaza fosfoglicerania człowieka; Nluc = lucyferaza nanoLuc; ROC = charakterystyka działania odbiornika; ABC = powierzchnia między krzywymi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Morfologia komórek i barwienie żywych/martwych komórek. (A) Konfokalne mikroskopowe obrazy komórek przed (dzień 4) i po (dzień 6) ekspozycji na środek testowy. Pozostały komórki pokrywające niemal całą powierzchnię otworów po teście są wskaźnikiem udanego testu. Prawie pełne pokrycie dołku na końcu testu wskazuje na udany przebieg. (B) Barwienie żywych/martwych komórek przed i po ekspozycji na substancję testową. Żywe komórki były barwione na zielono kalcein-AM, a martwe komórki barwione na czerwono jodkiem propidiu (PI). były barwione kalceiną-AM (zieloną), a martwe komórki jodkiem propidium (PI, czerwony). Udział martwych komórek powinien być mniejszy niż < 50% wszystkich komórek. Skala = 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-3
Rysunek 3: Typowe przykłady dynamiki intensywności luminescencji. (A) Luminescencja w czasie zmienia bieg świetlenia po stymulacji ligandów FGF, mierzony za pomocą systemu pomiaru luminescencji w czasie rzeczywistym. Intensywność luminescencji monitorowano co 22 minuty przez 48 godzin. Sześć kolorowych linii reprezentuje sygnały z różnych studni. (B) Porównanie ręcznych i rzeczywistych pomiarów luminescencji z kwasem walproinowym. Zakłócenia sygnału obserwowano obiema metodami pomiaru, podczas gdy monitorowanie w czasie rzeczywistym wyraźniej rejestrowało wzmocniony sygnał przy drugim szczycie. Skróty: RLU = Jednostka względnej światła; VPA = kwas walproinowy; FGF = czynnik wzrostu fibroblastów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Chemikalia testoweSkrótCas NIE.Badania na zwierzętach
(poprzednie badanie)		Badanie in vitro
(to studium)		Suma wartości ABCMaksymalna koncentracja
(μg/mL)
Kwas całkowicie trans-retinoowyATRA302-79-4PP65.90.0100
HydroksyureaHU127-07-1PP63.3149
Kwas metaksyoctowyMAA625-45-6PP225683
Chlorek metylortęciMeHg115-09-3PP77.71.20
Metotreksat hydratowanyMTX133073-73-1PP80.55.00
Salicylan soduSkojarzenie zabezpieczeń54-21-7PP38.7666
Kwas walproinowyVPA99-66-1PP63.3100
6-Aminonikotynamid6-AN329-89-5PN24.91.00
Kwas borowyBA10043-35-3PN24.2250
5-Bromo-2'-deoksyurydynaBrdU59-14-3PP83.950.0
5,5-Dimetylo-2,4-oksazolidionDMO695-53-4PP50.3840
Kloridy lituLiCl7447-41-8PN29.8250
5-Fluorouracyl5-FU51-21-8PP92.42.65
Monohydrat cyklofosfamiduCPA6055-19-2PN19.1400
Imatinib mesylanIMA220127-57-1PP42.412.5
LenalidomidLEN191732-72-6PP94.735.0
PomalidomidPOM19171-19-8PP50.92.50
TalidomidTHA50-35-1PP53.312.0
AkrylamidACA79-06-01NN37.1454
D-CamphorKRZYWKA464-49-3NN27.550.0
Chlorek difenhydraminyDHM147-24-0NP68.2262
DimetyloftalanDMP131-11-3NN24.4100
Penicylina G sól sodowaPeng69-57-8NN22.11000
Sacharyna soduSAC82385-42-0NN34.01000
ParacetamolAPAP103-90-2NN22.320.0
Amoksycylina trihydratowaAMX61336-70-7NN28.425.0
CymetydynaCENTYMETR51481-61-9NN25.330.0
ErytromycynaERY114-07-8NN20.015.0
HydrochlorotiazyduHCTZ58-93-5NN21.920.0
SulfasalazynaSSZ599-79-1NN30.8100
ChemicznyAUCPrógCzułośćSpecyficznośćDokładność
30 substancji0.81937.90.7780.9170.833

Tabela 1: Substancje Devtox i nie-Devtox klasyfikowane w eksperymentach na zwierzętach oraz wyniki oszacowane z zakłóceniami sygnału FGF i bez nich. Skróty: P = dodatnia (Devtox); N = ujemne (nie-Devtox).

Dyskusja

Rozwój embrionalno-płodowy jest ściśle regulowany przez sieci sygnalizacyjne12. Chociaż sprzężenie zwrotne w tych sieciach zapewnia odporność na zakłócenia wewnętrzne i zewnętrzne, wysunęliśmy hipotezę, że chemikalia Devtox mogą wywierać efekty wykraczające poza samo buforowanie. Przedstawiamy tutaj protokół szacowania chemikaliów Devtox na podstawie nadmiernego zakłócenia sygnalizacji FGF/SRF. To podejście nie dostarcza żadnych informacji o molekularnych mechanizmach odpowiedzialnych za Devtox, takich jak docelowe białka substancji chemicznej, i koncentruje się wyłącznie na sygnalizacji FGF/SRF. Mimo to możliwe było efektywne sklasyfikowanie chemikaliów Devtox, z dokładnością 83% i AUC 0,819 (Tabela 1). Prawdopodobnie wynika to z faktu, że każda ścieżka sygnalizacji jest ściśle powiązana z innymi i tworzy gęste sieci sygnalizacyjne, a zakłócenia w tych sieciach powodują zakłócenia sygnału FGF/SRF.

Przy tworzeniu komórek reporterów należy pokonać kilka wyzwań technicznych. Nluc jest około 100 razy jaśniejszy niż konwencjonalne lucyferazy pochodzące z świetlików lub Renilli, co pozwala na ciągłe, długoterminowe monitorowanie zmian sygnału13. Nluc zawierający sekwencję PEST został użyty do dokładniejszego oddania dynamiki aktywności sygnalizacyjnej. Sekwencja PEST sprzyja degradacji białek. Podczas gdy białko Nluc jest stabilne z okresem półtrwania dłuższym niż 6 h, tag PEST przyspiesza rozkład przez szlak ubikwityny-proteasom, skracając jego okres półtrwania do 10-30 minut. Ponadto gen reportera został wtopiony w locus AAVS1, genomową "bezpieczną przystanię", zapewniającą, że ekspresja nie jest uciszana i że niezbędne geny nie są przypadkowo zakłócane.

W ocenie metod testowania kluczowe jest dobór substancji referencyjnych dla Devtox i nie-Devtox. Wybraliśmy substancje referencyjne z list w międzynarodowym badaniu walidacyjnym ECVAM, wytycznych ICH S5 (w tym talidomidu) oraz badań na zwierzętach7. Wymieniliśmy 30 substancji Devtox i nie-Devtox, ale trzeba dodać i przetestować więcej substancji pochodzących z wiarygodnych źródeł. Dlatego próg ROC (suma ABC = 37,9) podany tutaj powinien być traktowany jako wstępny i będzie wymagał weryfikacji za pomocą większego, niezależnego zestawu związków, aby zapewnić statystyczną odporność. Cyklofosfamid (CPA) był jednym z trzech związków chemicznych z fałszywie ujemnymi wynikami. CPA jest hydroksylowany w wątrobie do 4-hydroperoksycyklofosfamidu, a CPA i jego produkty degradacji są teratogenne15. Testy in vitro, w tym nasze podejście, zazwyczaj nie uwzględniają metabolizmu i nie wykrywają substancji chemicznych indukujących Devtox poprzez metabolizm. To ograniczenie proponowanego podejścia. Oprócz fałszywie negatywnych wyników zależnych od metabolizmu (np. CPA), zaobserwowaliśmy także fałszywie pozytywny wynik przy użyciu chlorowodorku difenhydraminy (DHM). Dowody epidemiologiczne nie potwierdzają silnego związku przyczynowego między DHM a wrodzonymi wadami, jednak kilka badań in vitro sklasyfikowało go jako toksyn rozwojowy; To prawdopodobnie przyczyniło się do błędnej klasyfikacji w naszym badaniu. Natomiast 6-aminonikotynamid (6-AN) nie zakłócał sygnalizacji FGF/SRF i został błędnie sklasyfikowany, co sugeruje, że mechanizm toksyczności rozwojowej może przebiegać przez szlaki niewychwycone przez tego reportera. Razem te przykłady wspierają rozszerzenie panelu testowego o dodatkowe szlaki sygnalizacji rozwojowej, które zmniejszają zarówno fałszywie pozytywne, jak i fałszywie negatywne wyniki.

Na ten test wpływa wiele czynników. Jednym z takich czynników jest przygotowanie komórek przed testem. Aby to zminimalizować, komórki były utrzymywane w 7-dniowym powtarzalnym harmonogramie, aby mieć pewność, że komórki użyte w testie są pobierane w tych samych warunkach wzrostu. Komórki są zasiewane w poniedziałek, przepuszczane w czwartek, a część jest wykorzystywana do testu i zasiewana do kolejnego przejścia. Kolejnym czynnikiem jest gęstość komórek w momencie ekspozycji na substancję testową. Test przeprowadzono dopiero wtedy, gdy komórki osiągnęły 100% zbieżności w dniu ekspozycji chemicznej. Efekty brzegu w płytkach 96-dołkowych są dobrze znane. W tym badaniu użyto jedynie wewnętrznych 60 dołków płyty 96-dołkowej, aby uniknąć efektu krawędzi. Oprócz ogólnych kwestii, podczas badania może wystąpić zmienność techniczna. Częstym problemem była niestabilna intensywność luminescencji wśród dołków w grupie kontrolnej pojazdu, która mogła być spowodowana nierównym zasiewem komórek lub nieoptymalną jakością komórek. Zalecamy utrzymywanie komórek na około 80% zbiegu się, aby zminimalizować tę zmienność oraz weryfikować jednolity wzrost w dołkach dzień po siewie. Regulacja gęstości zasiewów iPSC może również zwiększyć powtarzalność testu. Ponadto nadmierna śmierć komórek może prowadzić do niespecyficznych fluktuacji luminescencji niezwiązanych z sygnałem eksperymentalnym. Dlatego na końcu testu należy ocenić morfologię komórek, aby upewnić się, że komórki są w odpowiednim stanie podczas pomiaru. W testach ręcznych usuwanie płytki z inkubatora w każdym momencie naraża komórki na krótkotrwałe zmiany temperatury i poziomuCO2. Aby ograniczyć te wahania środowiskowe, pomiary powinny być wykonywane szybko i konsekwentnie.

Test ten można wykonać ręcznie lub za pomocą systemu pomiarów w czasie rzeczywistym. Podejście ręczne nie wymaga specjalistycznego sprzętu, ale system pomiarów w czasie rzeczywistym umożliwia dokładniejsze wykrywanie dynamiki sygnału. Chociaż nie było to zidentyfikowane w ręcznych pomiarach, system pomiarów w czasie rzeczywistym wyraźnie rejestrował dwa szczyty sygnału luminescencji. W pomiarach ręcznych w nocy wystąpiła 12-godzinna przerwa w pozyskiwaniu danych, co mogło prowadzić do zaniżenia lub utraty drugiego szczytu. Te dwa szczyty mogą być spowodowane ujemnym sprzężeniem zwrotnym z sygnalizacji FGF oraz obecnością termicznie stabilnego ligandu FGF. Co warte odnotowania, zakłócenia sygnału FGF przez substancję chemiczną czasami wydawały się większe w drugim piku niż w pierwszym (rysunek 3B).

Protokół ten stanowi obiecujące podejście do chemicznego przesiewu Devtox z wykorzystaniem testu reporter opartego na ludzkim iPSC do ilościowej oceny zakłóceń sygnału FGF. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano kilka alternatywnych testów in vitro dotyczących toksyczności rozwojowej, w tym test na embrionalne komórki macierzyste myszy (mEST)16, test na embrionalne komórki macierzyste oparte na Hand1 (Hand1-EST)17 oraz ReProGlo18. W porównaniu z tymi konwencjonalnymi testami, ta metoda wykazała wyższą dokładność predykcyjną. W ostatnich latach wprowadzono alternatywne strategie, takie jak wykorzystujące ludzkie embrionalne komórki macierzyste lub embriony danio, w ramach międzynarodowych działań mających na celu ustanowienie systemów testowania niezwierzęcych. Podejścia te wykazały również wysoką dokładność predykcyjną w ocenie toksyczności rozwojowej. Aby jeszcze bardziej poprawić wydajność tego testu, korzystne może być włączenie dodatkowych szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój embrionalny. W morfogenezie rozwojowej istnieje kilka innych głównych szlaków sygnalizacji, takich jak Wnt/β-katenina, BMP/SMAD oraz sygnalizacja Hedgehog/GLI19. Różne kombinacje komórek raportujących używane do oceny tych szlaków sygnalizacyjnych mogą zapewnić bardziej kompleksową ocenę różnych substancji chemicznych. Wpływ etapu różnicowania komórek iPS, na przykład najwcześniejszego etapu powstawania trzech warstw zarodkowych – na wrażliwość tego testu na wykrywanie będzie tematem naszych przyszłych badań. Przyszłe badania mogą również badać walidację międzygatunkową z wykorzystaniem systemów komórek macierzystych gryzoni lub królików, aby umożliwić bezpośrednie porównanie z zestawami danych in vivo u tych gatunków, podczas gdy naszym głównym celem pozostają ludzkie komórki iPS, aby zmaksymalizować znaczenie dla człowieka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez JSPS, Japonia [numery grantowe KAKENHI 23K25021 i 25K03278]; MHLW, Japonia [granty programowe numery 23KD1003 i 24KD1003]; KISTEC w Japonii; oraz AMED, Japonia [numery grantów JP23mk0101252 i 25mk0121314].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka mikrowirówki 1,5 mLFastGeneFG-MCT015CPrzygotowanie chemikaliów testowych
Rurka wirówki 15 mLVIOLAMO1-3500-21Hodowla komórkowa
Rurka PCR z 8 paskamiWatson137-333CPrzygotowanie chemikaliów testowych
Biała/przezroczysta płyta dolna 96 otworów, powierzchnia TCThermo Fisher Scientific165306Pomiary hodowli komórkowych i luminescencji
mikropłytka płaska dno 96WellASONA3-3321-04Do pomiaru luminescencji w testach cytotoksyczności
Oddychaj ŁATWIEJTOHOBERM-2000Folia uszczelniająca przepuszczająca gazy
CellTiter-Glo Luminescencyjny Testy Żywotności Komórek LuminescencyjnychPromegaG7572Badanie cytotoksyczności
Wirówka 5702 REppendorfWirowania
ClipTip 300, filtrowany, sterylny, w regaleThermo Fisher Scientific94420513
ClipTip 50, filtrowany, sterylny, w regałachThermo Fisher Scientific94420253
Countess 3 FL Automatyczny Licznik Komórek KomórkowychInvitrogenLiczenie komórek
Komory liczenia komórek hrabinyInvitrogenC10312Liczenie komórek
Kultura, Sure, DMSO FUJIFILM Wako031-24051Rozpuszczalnik do chemikaliów
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako036-24023Inhibitor ROCK do siewania iPSC
DMEM/F12 HEPES, bez fenoluThermo Fisher Scientific11039-021Powłoka do hodowli komórek iPS
Pipety wielokanałowe F1-ClipTip, 30 do 300 i mikro; LThermo Fisher Scientific4661180N
Pipety wielokanałowe F1-ClipTip, od 5 do 50 i mikro; LThermo Fisher Scientific4661160N
Chip filtrującyWatson
Matryca bazalnej bazowej Geltrex LDEV-wolnej od LDEV, zredukowanego czynnika wzrostuThermo Fisher ScientificA1413202Powłoka do hodowli komórek iPS
HIENAI Mat 01RCOSMO BIOHMAT01RDo utrzymania stabilności temperatury płyty podczas manipulacji hodowlą komórkową
HIENAI Tube Warmer GX01COSMO BIOTWGX013Do utrzymania medium ciepłego podczas eksperymentalnego użytkowania
Ludzkie białko rekombinowane bFGF stabilne ciepłoThermo Fisher ScientificPHG0367Stymulacja FGF do testu reportera
Ludzkie indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPS)201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)RIKEN BRC Bank Komórkowy
Wstrząsarka mikropłytTAITEC0089532-000Potrząsanie płytą do testu cytotocyczności
Czytnik wielopłytowyPerkinElmerARVO X4Pomiar luminescencji
Substrat żywych komórek nano-glo endurazynyPromegaN2571Podłoże luminescencyjne
PBS (-) FUJIFILM Wako166-23555Kultura komórkowa
ParafilimJAKO JEDEN65-1681-93Przechowywane na płytę powłokową
PipettoEppendorf
WSL-1563 KronosHTATTO3510140System pomiaru luminescencji w czasie rzeczywistym
AkwenBMBioBM-0850-1
STEMdif APEL2 Medium STEMCELL TechnologiesST-05275Medium testowe
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Medium konserwacyjne
Woda sterylna, wolna od endotoksynFUJIFILM Wako196-15645Kontrola wilgotności w hodowli komórek iPS
Płytka do hodowli tkankowej VTC-P6VIOLAMO2-8588-01Kultura komórkowa
TrypL Select Enzyme (1X), bez fenolu czerwonegoThermo Fisher Scientific12563011Hodowla komórkowa
Kwas walproinowyFUJIFILM Wako227-01071Chemikalia testowe

Bibliografia

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. DeSesso, J. M. Future of developmental toxicity testing. Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).
  3. Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches. Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).
  4. Vargesson, N. Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms. Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).
  5. van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report. Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).
  6. Kanno, S., et al. Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).
  7. Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).
  8. Kanno, S., et al. Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience. 25 (2), 103770(2022).
  9. Miano, J. M. Role of serum response factor in the pathogenesis of disease. Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).
  10. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  11. Paradis, F. -H., Hales, B. F. Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs. Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).
  12. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).
  13. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  14. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  15. Hales, B. F. Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein. Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).
  16. Genschow, E., et al. The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models. Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).
  17. Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro. Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).
  18. Uibel, F., et al. ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).
  19. Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. Editorial: Signaling pathways in embryonic development. Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar luminescencjitest żywotności komórekbadanie toksyczności chemicznejrozcieńczenia seryjneobrazowanie w kontraście fazowym
Testy toksyczności rozwojowej oparte na monitorowaniu sygnału czynnika wzrostu fibroblastów w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.