Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Podsumowanie

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Streszczenie

Neurony polaryzują się, tworząc dendryty i aksony, umożliwiając komunikację międzykomórkową. Uszkodzenie aksonów przerywa te połączenia i przekazuje sygnały o uszkodzeniu do somy, często prowadząc do zwyrodnienia neuronów. Tak więc utrzymanie homeostazy aksonalnej jest niezbędne do promowania lokalnej regeneracji aksonów i ochrony przed neurodegeneracją. Proces ten opiera się na metabolizmie komórkowym w celu dostarczania energii i prekursorów biosyntezy i jest podtrzymywany przez mechanizmy regulujące równowagę metaboliczną i eliminujące produkty uboczne. Jednak metabolizm neuronalny jest podzielony między somę a akson i jest dodatkowo wpływany in vivo przez otaczające mikrośrodowisko, takie jak aktywność metaboliczna pochodząca z astrocytów (np. Wahadłowiec mleczanowy astrocytów-neuronów). Czynniki te komplikują badanie wewnętrznych mechanizmów metabolicznych neuronów. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do hodowli pierwotnych neuronów korowych in vitro , która zachowuje kluczowe cechy metaboliczne obserwowane in vivo, w tym fizjologiczny przepływ glikolityczny i oddychanie mitochondrialne. System ten zapewnia uproszczony model do badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej neuronów po uszkodzeniu aksonów. Konwencjonalne chipy mikroprzepływowe obsługują modele uszkodzeń aksonalnych in vitro i są kompatybilne z obrazowaniem żywych komórek, barwieniem immunofluorescencyjnym i leczeniem hipoksji. Aby umożliwić wielkoskalowe analizy transkryptomiczne i metabolomiczne obejmujące miliony komórek, zaprojektowaliśmy i wyprodukowaliśmy wysokowydajne chipy mikroprzepływowe ze zoptymalizowanymi protokołami operacyjnymi. Urządzenie posiada naprzemiennie ułożone komory somy i aksonów połączone mikrokanalikami, a uszkodzenie aksonów jest indukowane przez próżniowe zasysanie płynu z komory aksonowej. Platforma ta umożliwia szybką ocenę dynamiki metabolitów i enzymów, poprawiając dokładność i odtwarzalność badań multiomicznych.

Wprowadzenie

Neurony tworzą dwa odrębne typy wypukłości o wyspecjalizowanych funkcjach, aksony i dendryty, poprzez polaryzację podczas rozwoju ^1,2. Regeneracja nerwów odnosi się do procesu odrastania aksonów po uszkodzeniu neuronów³, z naciskiem na naprawę ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W przeciwieństwie do obwodowego układu nerwowego, OUN ma ograniczoną zdolność regeneracyjną ^4,5,6, co często prowadzi do trwałych zaburzeń funkcjonalnych lub trwałej niepełnosprawności u pacjentów z urazami rdzenia kręgowego lub urazami mózgu ^7,8. W związku z tym kluczowe znaczenie ma opracowanie strategii usprawniających naprawę ośrodkowego układu nerwowego i wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw regeneracji aksonów.

Urządzenia mikroprzepływowe, funkcjonujące jako zintegrowane, opłacalne i wysokoprzepustowe systemy hodowli in vitro, wykazały w ostatnich latach niezwykłe zalety w badaniach nad komórkami i neuronami ^9,10. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, technologia mikroprzepływowa umożliwia precyzyjną regulację naprężeń ścinających płynu, gradientów stężeń i struktur przestrzennych, dzięki czemu ściśle symuluje autentyczne fizjologiczne i patologiczne mikrośrodowiska w celu promowania wzrostu, migracji, różnicowania i interakcji komórek 11,12,13,14. Oparte na mikrofluidyce modele uszkodzeń aksonalnych in vitro umożliwiają przedziałową hodowlę ciał i procesów komórek nerwowych poprzez polaryzację przestrzenną, zapewniając niezbędne narzędzie do badania wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów i ich adaptacji metabolicznych po urazie^15,1, ^6,17,18. Zapewnia kluczowe okno na to, jak neurony reagują na urazy, regulują procesy metaboliczne¹⁹ i promują regenerację aksonów²⁰. Jednak istniejące platformy mikroprzepływowe do uszkodzeń aksonów i badań metabolicznych nadal stoją przed wyzwaniami, w tym niską wydajnością komórek neuronalnych, zmniejszoną dokładnością pomiarów metabolicznych i brakiem ustandaryzowanych procedur operacyjnych.

W odpowiedzi na te ograniczenia, w ramach tego badania opracowano nową, wielkoskalową platformę mikroprzepływową, która umożliwia standaryzowaną, wysokoprzepustową indukcję uszkodzenia aksonów i zapewnia wystarczającą ilość materiału komórkowego do podzielonych na przedziały analiz multiomicznych. Ten zintegrowany projekt bezpośrednio konfrontuje się z krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w badaniach nad uszkodzeniami neuronalnymi. W szczególności zaprojektowany przez nas chip mikroprzepływowy charakteryzuje się naprzemiennym układem komór somalnych i aksonalnych połączonych mikrorowkami, z transsekcją aksonalną osiągniętą poprzez kontrolowane zasysanie próżniowe. Takie podejście jest idealne do badań, które wymagają powtarzalnych, wysokoprzepustowych modeli uszkodzeń aksonów i precyzyjnego profilowania metabolicznego, takiego jak badanie mechanizmów metabolicznych leżących u podstaw regeneracji aksonów. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, technika ta oferuje wyższą przepustowość, większą precyzję metaboliczną i możliwość ustanowienia ustandaryzowanych modeli urazów. Na przykład wcześniejsze badania wykazały znaczenie transportu mitochondrialnego w regeneracji aksonów 20,21,22,23, podczas gdy nasza platforma dodatkowo ujawnia rolę metabolizmu glukozy w regeneracji aksonów po urazie. Protokół ten ustanawia system techniczny do aksotomii i analizy metabolicznej na dużą skalę, który jest zarówno weryfikowalny wizualnie, jak i znormalizowany operacyjnie.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej Uniwersytetu Beihang i zostały zatwierdzone przez komisję (kod zatwierdzenia: BM20210060). Rysunek 1 przedstawia oś czasu eksperymentu.

1. Konstrukcja konwencjonalnego i wielkoskalowego urządzenia mikroprzepływowego

1. Zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe za pomocą programu AutoCAD, aby tworzyć dwuwymiarowe (2D) schematy i trójwymiarowe (3D) modele konstrukcyjne.
2. Użyj tych projektów, aby wytworzyć główną formę na płytce krzemowej z fotolitografią negatywową SU-8.
3. Odtwórz formę wzorcową, odlewając polidimetylosiloksan (PDMS), co daje wysoce precyzyjny, funkcjonalny chip mikroprzepływowy.
4. Zaprojektuj każdy mikrokanał tak, aby miał wysokość 5 μm, przepuszczając tylko aksony podczas blokowania somy.
5. Spraw, aby mikrokanały miały szerokość 10 μm, aby zwiększyć pojemność aksonów.
6. Zaprojektuj komory tak, aby miały 120 μm wysokości i 220 μm szerokości, zapewniając wystarczająco dużo miejsca na somę neuronalną.
7. Użyj tej platformy mikroprzepływowej do symulacji uszkodzenia aksonów in vivo , kontrolując przepływ płynów i rozmieszczenie neuronów.
8. Za pomocą urządzenia można przygotowywać próbki metabolomiczne i transkryptomiczne do precyzyjnej manipulacji komórkami oraz umożliwiać przetwarzanie o wysokiej przepustowości w celu poprawy dokładności próbki i trafności biologicznej.

2. Wytwarzanie konwencjonalnych i wielkoskalowych urządzeń mikroprzepływowych

1. Zważyć bazę PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 (w/w) i umieścić je w probówce wirówkowej.
2. Umieścić probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę PDMS w mieszadle odśrodkowym. Odwirować przy 2000 × g przez 4 minuty w celu wymieszania, a następnie ponownie odwirować w temperaturze 2000 × g przez 4 minuty w celu odgazowania.
3. Wlej 13-15 g odgazowanego PDMS do formy mikroprzepływowej, upewniając się, że dno formy jest całkowicie zakryte.
4. Umieść formę w eksykatorze próżniowym. Użyj pompy próżniowej, aby usunąć powietrze przez 5-10 minut, aby dokładnie usunąć pęcherzyki z PDMS.
5. Użyj gumowej gruszki, aby delikatnie postukać w powierzchnię PDMS, aby rozbić wszelkie pozostałe pęcherzyki na powierzchni.
6. Umieść formę w piecu konwekcyjnym i piecz w temperaturze 80 °C przez 100 minut, aby utwardzić PDMS.
7. Gdy PDMS jest w pełni utwardzony, delikatnie wsuń końcówkę skalpela pod krawędź PDMS, aby ostrożnie podnieść i oddzielić go od formy.
8. Użyj stempla do biopsji o średnicy 2,0-2,5 mm, aby utworzyć otwory w PDMS do infuzji pożywki hodowlanej i ładowania komórek.
9. Usuń wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe z PDMS za pomocą taśmy klejącej, a następnie umieść go w czystym szklanym naczyniu i owiń folią aluminiową do przechowywania.
10. (Opcjonalnie) Potraktuj powierzchnię PDMS plazmą tlenową (30 W, 20 s), a następnie dociśnij ją do innej powierzchni w celu nieodwracalnego połączenia.
11. Przed eksperymentem należy sterylizować urządzenie mikroprzepływowe w autoklawie w temperaturze 121 °C i 101 kPa przez 5 minut, aby zapewnić sterylność.

3. Przygotowanie neuronów korowych

1. Znieczulij 3 szczury Sprague-Dawley (SD) po urodzeniu (w ciągu 12 godzin po urodzeniu), umieszczając je na lodzie na 5 minut, a następnie szybko odetnij głowy.
2. Wypreparuj obszar ruchowy kory mózgowej i umieść tkankę we wstępnie schłodzonym buforze preparacyjnym (np. 2 ml HBSS bez wapnia i magnezu).
   UWAGA: Wszystkie procedury preparacji tkanek należy wykonywać na lodzie przy użyciu wstępnie schłodzonych roztworów.
3. Zmielić tkankę na około 1 mm³ kawałki za pomocą sterylnych nożyczek i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
4. Odstawić na 5 minut, a następnie ostrożnie odessać supernatant w celu usunięcia resztek krwi i buforu.
5. Dodać podgrzany roztwór papainy (1 mg/ml) w 5 ml HBSS z wapniem i magnezem, który został podgrzany do temperatury 37 °C.
6. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 40 minut, delikatnie odwracając probówkę 3 razy co 10 minut.
7. Po strawieniu zawiesinę delikatnie roztrzeć 100 razy za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
   UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, aby zapobiec stresowi komórkowemu.
8. Odwirować przy 300 × g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
9. Dodać roztwór terminacyjny zawierający 1 mg/ml inhibitora proteazy (np. 600 μl fiolki z inhibitorem systemu dysocjacji papainy w 5 ml HBSS z wapniem i magnezem) w celu ponownego zawieszenia komórek.
10. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm i zebrać filtrat do nowej probówki wirówkowej.
11. Odwirować filtrat o stężeniu 200 × g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
12. Zawiesić osad w 500 μl kompletnej pożywki do hodowli neuronów zawierającej 2% witaminy B27 i 1% GlutaMAX.
13. Policz komórki (około 3 miliony/szczura) i dostosuj gęstość do 1 × 10⁶ komórek/ml do późniejszego użycia.

4. Powłoka

UWAGA: Potraktuj szkiełka nakrywkowe lub szalki hodowlane roztworem poli-D-lizyny (PDL), aby poprawić adhezję neuronów i stworzyć optymalne środowisko do wzrostu neuronów.

1. Powlekanie szkiełek nakrywkowych
   1. Umieścić szkiełko nakrywkowe przeznaczone do konwencjonalnych urządzeń mikroprzepływowych (Φ25 mm, grubość 0,17 mm) w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i dodać 2 ml 0,1 mg/ml roztworu PDL.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin lub przez noc.
   3. Po inkubacji ostrożnie pobrać roztwór PDL w celu ponownego użycia lub właściwego usunięcia.
   4. Dodaj 2 ml sterylnej ultraczystej wody do naczynia i obróć je 50 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 50 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (w przypadku wielu naczyń obróć je jednocześnie w większym naczyniu).
   5. Zassać wodę za pomocą pompy próżniowej podłączonej do sterylnej końcówki pipety, zbierając odpady do pojemnika na odpady płynne.
   6. Powtórzyć procedurę prania (kroki 4.1.4-4.1.5) łącznie trzy razy.
   7. Przed użyciem pozostaw szkiełka nakrywkowe do naturalnego wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Powlekanie naczynia hodowlanego
   1. Dodać odpowiednią ilość 0,1 mg/ml roztworu PDL do szalki hodowlanej lub płytki dołka (np. dodać 2 ml do szalki o średnicy 35 mm w przypadku konwencjonalnych mikrofluidyków i 5 ml do 10-centymetrowej szalki w przypadku mikrofluidyki na dużą skalę).
      UWAGA: Upewnij się, że komora bezpieczeństwa biologicznego działa prawidłowo ze sterylnym przepływem powietrza, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   2. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa dno i inkubuj go w temperaturze 37 °C przez 6 godzin lub przez noc.
   3. Po odzyskaniu roztworu PDL umyć naczynie hodowlane trzykrotnie odpowiednią ilością sterylnej ultraczystej wody, jak opisano w kroku 4.1.4.
   4. Usuń resztki ultraczystej wody i wysusz naczynie hodowlane na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym do późniejszego użycia.

5. Przygotowanie pożywki neuronalnej

1. Przygotuj kompletną pożywkę do rutynowej hodowli neuronów.
   1. Wyjąć tłok z jednorazowej strzykawki o pojemności 50 ml. Umieść strzykawkę z gumową główką skierowaną do góry na czystej ławce w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Dodać kolejno 500 μl streptomycyny penicyliny (PS), 1 ml witaminy B27, 125 μl GlutaMAX i 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do strzykawki. Wymień końcówkę pipety dla każdego elementu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
      UWAGA: Dodaj każdy składnik w określonej kolejności, aby zachować spójność.
   3. Weź nową sterylną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml. Oznacz to jako "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0,25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      UWAGA: Użyj NBA, jeśli nie neuronów embrionalnych; stosować neurony podstawne (NB) dla neuronów embrionalnych.
   4. Podłączyć filtr strzykawkowy 0,22 μm do końca strzykawki.
      UWAGA: Upewnij się, że filtr jest szczelnie połączony ze strzykawką, aby zapobiec wyciekowi.
   5. Użyj NBA, aby napełnić strzykawkę płynem do 50 ml, łącznie z objętością dodatków. Ponownie zainstaluj tłok.
   6. Powoli naciskaj tłok z prędkością około 2 ml/s, aby przefiltrować ciecz do oznaczonej probówki wirówkowej.
   7. Dokręcić nakrętkę probówki wirówkowej. Odwróć probówkę 3-5 razy, aby wymieszać podłoże.
2. Kompletna pożywka zawierająca [^U-13C₆]-glukozę (do analizy strumienia metabolicznego): Do analizy strumienia metabolicznego metabolizmu glukozy w uszkodzonych neuronach, należy użyć bezcukrowego NBA do przygotowania kompletnej pożywki zawierającej [^U-13C₆]-glukozę.
   1. Jako roztwór bazowy należy użyć bezglukozowego NBA i dodać [^U-13C₆]-glukozę do końcowego stężenia 25 mM przed filtracją (jeśli [^U-13C₆]-glukoza jest stała, należy ją wcześniej obliczyć i zważyć). Postępuj zgodnie z tą samą sekwencją dodawania innych składników, jak również etapów filtracji i mieszania, jak opisano w sekcji 5.1.

6. Liczenie komórek

1. Dokładnie przetrzyj hemocytometr 75% etanolem. Przed kontynuowaniem upewnij się, że wszystkie powierzchnie są całkowicie suche.
2. Dodać 90 μl sterylnego buforu soli fizjologicznej (PBS) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
3. Delikatnie ponownie zawiesić pobraną zawiesinę komórek nerwowych, pipetując w górę i w dół 3-5 razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
4. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl przenieść 10 μl zawiesiny z mieszanych komórek do probówki wirówkowej zawierającej 90 μl PBS (rozcieńczenie 1:10).
5. Użyj pipety o pojemności 200 μl, aby delikatnie wymieszać roztwór 10 razy, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki.
6. Wymień końcówkę pipety na nową końcówkę o pojemności 10 μl. Pobrać 10 μl mieszaniny i dodać ją do komory na próbkę hemocytometru.
7. Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość za pomocą obiektywu 20x. Zlokalizuj środkową siatkę 4 × 4 i policz komórki we wszystkich 16 kwadratach zgodnie ze standardowymi zasadami hemocytometru.
8. Rejestruj łączną liczbę komórek ze wszystkich 16 kwadratów. Oblicz stężenie komórek za pomocą wzoru: (Całkowita liczba × 10) × 10⁴ komórki/ml.
   UWAGA: Zawsze pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

7. Hodowla in vitro neuronów korowych w konwencjonalnych lub wielkoskalowych urządzeniach mikroprzepływowych

1. Protokół A (Konwencjonalne urządzenia mikroprzepływowe).
   1. Sprawdzić, czy szklana powierzchnia w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm jest całkowicie sucha.
   2. Za pomocą sterylnych kleszczyków z cienką końcówką umieść autoklawowany chip mikroprzepływowy na środku szklanej powierzchni z mikrokanalikami skierowanymi w dół.
   3. Delikatnie dociśnij chip do szklanej powierzchni za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby zapewnić pełną przyczepność.
   4. Zaznacz lewą komorę kropką (·) za pomocą markera permanentnego, aby oznaczyć komorę somy.
   5. Odessać 10 μl zawiesiny neuronalnej (10 milionów komórek/ml) za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
   6. Powoli dozować zawiesinę do otworu ładowania powyżej oznaczonej komory somy.
   7. Upewnij się, że płyn przepływa prawidłowo do dolnego zbiornika lewej komory.
   8. Przenieść naczynie hodowlane do nawilżonego inkubatora (37 °C, 5% CO₂) na 20 minut.
   9. Wyjmij naczynie hodowlane z inkubatora.
   10. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym 20 × potwierdzić perfuzję pożywki z komory somy do komory aksonalnej przez mikrokanaliki.
   11. Dodaj 150 μl neuronalnej pożywki podstawowej do górnego portu przedziału aksonalnego (prawej komory), umożliwiając przepływ grawitacyjny do dolnego zbiornika.
   12. Podobnie dodaj 15 μl kompletnego podłoża neuronalnego do górnego portu komory somy (lewej komory).
       UWAGA: Na tym etapie neurony powinny widocznie przylegać, a większość resztek komórkowych powinna zostać wypłukana do dolnej studzienki. Nie wymieniaj pożywki podczas hodowli; Użyć jednorazowego dodania kompletnej pożywki neuronalnej, jak opisano w kroku 5.1.3.
   13. Wlej 20 ml ultraczystej wody do naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm, aby utworzyć komorę wilgotnościową. Umieść naczynie hodowlane o średnicy 35 mm w dużym naczyniu.
   14. Przenieś cały system hodowli do inkubatora i utrzymuj przez wymagany czas (np. 7 dni).
       UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórkowej należy wykonywać w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny i rękawice). Odkażaj powierzchnie robocze przed i po zabiegach.
2. Protokół B (Wielkoskalowe chipy mikroprzepływowe).
   UWAGA: Standardowy protokół konwencjonalnych specyfikacji został zastosowany z dwiema modyfikacjami.
   1. Do umieszczenia urządzenia użyj szalki Petriego o średnicy 10 cm.
   2. Wybierz wysiew pełnokanałowy lub interwałowy w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ponieważ każda metoda wymaga różnych protokołów uszkodzenia aksonów.
   3. Po zakończeniu wysiewu dodaj 5 ml kompletnej pożywki do hodowli neuronów na 10-centymetrową szalkę Petriego, aby utrzymać wzrost neuronów.
   4. Dodaj 20 ml ultraczystej wody do naczynia o średnicy 150 mm, aby utworzyć komorę wilgotnościową. Następnie umieść 10-centymetrowe naczynie w dużym naczyniu (Rysunek 3F).
   5. Tak samo jak w kroku 7.1.14.

8. Ustalenie modelu uszkodzenia aksonów in vitro w konwencjonalnych urządzeniach mikroprzepływowych

1. Oznacz lewą stronę urządzenia mikroprzepływowego jako komorę somalną (oznaczoną znakiem "·"), a prawą stronę jako komorę końcową aksonalną.
2. Nasiać neurony korowe do przedziału somalnego.
3. Hodowla neuronów in vitro do 7 dnia (DIV7), umożliwiając aksonom rozciąganie się przez mikrokanały do przedziału końca aksonalnego.
4. W DIV7 wykonaj zabiegi uszkodzenia aksonów w przedziale końcowym aksonów, aby ustalić model uszkodzenia aksonów in vitro .
5. Weź odpowiednią ilość pożywki NBA i przenieś ją do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml do późniejszego wykorzystania.
6. Hodowla neuronów korowych w urządzeniu mikroprzepływowym przez określony czas. Następnie przenieś urządzenie na czystą ławkę.
7. Użyj niestrzępiącego się papieru, aby wysuszyć dno naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odessać pożywkę z dwóch otworów po prawej stronie urządzenia mikroprzepływowego.
8. Podłącz rurkę pompy próżniowej do sterylnej, bezfiltrowej końcówki pipety o pojemności 200 μl, włącz pompę próżniową (szybkość ssania 60 l/min) i skieruj końcówkę w punkt połączenia między dolnym otworem komory końcowej aksonu a komorą, aby zassać stare medium (w tym momencie aksony pękają z powodu podciśnienia).
9. Wymień końcówkę pipety o pojemności 200 μl i nabierz 150 μl NBA, powoli wlewając ją przez dolny otwór prawej komory.
   UWAGA: Jeśli przepływ cieczy jest zbyt wolny i tworzą się bąbelki, szybko usuń płyn z końcówki, aby szybko napełnić komorę.
10. Naprzemiennie używaj dwóch otworów po prawej stronie do dodawania cieczy: po każdym dodaniu NBA natychmiast użyj pompy próżniowej, aby zassać ciecz z drugiego otworu, aby odciąć aksony. Powtórz tę operację 4 razy, a po ostatniej aspiracji zastąp świeżą kompletną pożywką neuronalną.
11. Odessać starą pożywkę z bocznego otworu w ciele komórki i dodać świeżą, kompletną pożywkę neuronalną zawierającą leki (jeśli jest to konieczne).
12. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe wraz z szalką hodowlaną w naczyniu hodowlanym o średnicy 150 mm i kontynuować hodowlę przez określony czas (np. 24 godziny).
    UWAGA: Operacja uszkodzenia aksonów wymaga pożywki NBA, ponieważ kompletny ośrodek neuronalny będzie wytwarzał pęcherzyki wpływające na efekt odcięcia.

9. Uraz aksonalny urządzenia mikroprzepływowego na dużą skalę

1. Metoda 1: Ręczne uszkodzenie aksonów.
   1. Umieść neurony we wszystkich komorach urządzenia mikroprzepływowego.
   2. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO₂ przez trzy dni, a następnie usunąć całe urządzenie mikroprzepływowe.
      UWAGA: Aby uniknąć naprężeń mechanicznych lub rozerwania aksonów wrastających w mikrokanały, wyjmij urządzenie mikroprzepływowe w DIV3 zamiast DIV7. Jest to szczególnie ważne, jeśli projekt eksperymentalny obejmuje nieuszkodzoną grupę kontrolną.
   3. W DIV7 wyjąć z inkubatora naczynie hodowlane zawierające urządzenie mikroprzepływowe i umieścić je na sterylnym stoliku.
   4. Przygotuj mikroskop z 20-krotnym powiększeniem i wysterylizuj obszar roboczy 75% etanolem.
   5. Trzymaj sterylną końcówkę pipety z filtrem o pojemności 10 μl i zidentyfikuj wiązki aksonów w oryginalnych mikrokanalikach pod kontrolą mikroskopu.
   6. Wykonaj podłużne zadrapania wzdłuż każdej wiązki aksonów za pomocą końcówki pipety.
   7. Obserwuj pękanie aksonów pod mikroskopem w czasie rzeczywistym po zadrapaniu.
      UWAGA: Podczas pracy z żywymi neuronami należy nosić rękawice nitrylowe i pracować w środowisku laboratoryjnym sterylizowanym promieniami UV
2. Metoda 2: Uszkodzenie aksonów wspomagane podciśnieniem.
   1. Neurony korowe nasienne na przemian w wielkoformatowym urządzeniu mikroprzepływowym.
   2. Włącz pompę próżniową i ustaw ją na 60 l/min.
   3. Podłącz koniec rurki pompy próżniowej do portu komory aksonu za pomocą sterylnej końcówki pipety.
   4. Całkowite odcięcie aksonów poprzez zastosowanie podciśnienia za pomocą konwencjonalnych protokołów mikroprzepływowych.
   5. (Opcjonalnie) Aby specyficznie zebrać uszkodzone aksony, w określonym punkcie czasowym po aksotomii, należy szybko zassać zawartość komory ciała komórki za pomocą pompy próżniowej (o szybkości ssania 60 l/min) w celu usunięcia ciał komórek, pozostawiając w ten sposób tylko aksony w mikrokanałach.

10. Leczenie hipoksyjności konwencjonalnych lub wielkoskalowych urządzeń mikroprzepływowych

1. Wysiewaj pierwotne neurony w urządzeniu mikroprzepływowym i kulturze aż do DIV7 w warunkach normoksyjnych (37 °C, 5% CO₂ ).
2. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe w komorze inkubatora hipoksji i dostarczyć mu mieszaninę gazów składającą się z 1% O₂ , 5 % CO₂ i zrównoważonego N₂ .
3. Użyj rotametru, aby kontrolować natężenie przepływu gazu i ustaw je na 25 l/min.
4. Przepłucz komorę przez 5 minut, aby wyprzeć powietrze.
5. Zaciskając wlot komory niedotlenienia, zamknij zawór redukcyjny ciśnienia wylotowego.
6. Zacisnąć rurkę wylotową komory hipoksyjnej i na koniec szczelnie zamknąć zawór butli z gazem.
7. Inkubować urządzenie mikroprzepływowe w komorze hipoksyjnej w temperaturze 3 °C przez 1 godzinę.

11. Przygotowanie próbki neuronów hodowanych in vitro przy użyciu wielkoskalowych urządzeń mikroprzepływowych do analizy omicznej

1. Próbka do transkryptomiki.
   1. Przenieś urządzenie mikroprzepływowe z uszkodzonymi aksonami do okapu z przepływem laminarnym 6 godzin po całkowitym uszkodzeniu aksonalnym.
   2. Po wyrzuceniu starej pożywki umyj komórki neuronalne 2-3 razy sterylnym PBS.
   3. Użyj standardowego zestawu do ekstrakcji RNA, aby wyizolować i oczyścić RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
   4. Wykonaj sekwencjonowanie RNA. Przeprowadzenie uzupełniającej analizy bioinformatycznej na uzyskanych danych sekwencjonowania.
2. Próbka do analizy strumienia metabolicznego.
   UWAGA: Aby monitorować zmiany w strumieniu metabolicznym glukozy w neuronach po urazie za pomocą wielkoskalowego urządzenia mikroprzepływowego, zastosowaliśmy analizę strumienia metabolicznego [^U-13C₆]-glucose tracing²⁴. Protokół przygotowania próbek do analizy LC-MS jest następujący:
   1. Do eksperymentów użyj szczeniąt szczurów P0 SD. Wypreparuj neurony korowe i hoduj je in vitro krótkoterminowo (DIV5-DIV7) lub długoterminowo (DIV15-DIV30).
   2. Zarówno dla młodych (DIV5-DIV7), jak i dojrzałych (DIV15-DIV30) neuronów należy ustalić grupy urazowe i nieuszkodzone grupy kontrolne.
   3. Zastąp pożywkę taką, która zawiera 25 mM [^U-13C₆]-glukozy (Neurobasal-A bez glukozy, 1% FBS, 2% B27, 25 mM [^U-13C₆]-glukozy) i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Aby uniknąć stresu neuronalnego i apoptozy spowodowanej zmianami osmotycznym lub pH podczas wymiany pożywki, przygotuj dodatkowe neurony hodowane w pożywce zawierającej 25 mM [^U-13C₆]-glukozy w momencie wysiewu i użyj tej pożywki do wymiany.
   4. Po dwukrotnym delikatnym przepłukaniu 5 ml wstępnie podgrzanego HBSS (zawierającego wapń i magnez), próbki należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić rękawice nitrylowe i fartuch laboratoryjny.

12. Barwienie immunofluorescencyjne neuronów w oparciu o konwencjonalne i wielkoskalowe urządzenia mikroprzepływowe

UWAGA: Podczas hodowli neuronów in vitro przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych należy wziąć pod uwagę potencjalne uszkodzenie aksonów neuronalnych w mikrokanałach, które może wystąpić podczas demontażu tych urządzeń w celu utrwalenia żywych komórek.

1. Użyj pompy próżniowej do mikroodpadów, aby usunąć pożywkę hodowlaną z czterech dołków urządzenia mikroprzepływowego.
   UWAGA: Utrzymuj płyn w dwóch komorach przez cały proces barwienia immunofluorescencyjnego. Parametry ssania nie powinny być zbyt wysokie (optymalnie 2,5 l/min), aby uniknąć uszkodzenia lub zasysania ciał komórek nerwowych i aksonów.
2. Dodaj 100 μl 1x PBS do każdej z dwóch górnych studzienek urządzenia mikroprzepływowego (PBS naturalnie popłynie do dolnych studzienek).
3. Wymień bezfiltrową końcówkę na końcu pompy próżniowej, zassaj PBS z dolnych studzienek i powtórz proces trzy razy. W ostatniej iteracji odessaj wszystkie PBS z czterech dołków.
4. Dodaj 150 μl 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) do każdej z dwóch górnych studzienek i utrwalaj w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
   UWAGA: Unikaj demontażu urządzenia podczas fiksacji żywych komórek, aby zachować integralność strukturalną neuronów. Takie podejście pomaga wyraźniej rozróżnić lokalizacje somy neuronalnej i aksonów.
5. Przemyć trzykrotnie 1x PBS, a następnie inkubować neurony z buforem blokującym zawierającym 5% koziej surowicy, 0,3 M glicyny, 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), PBS i 0,1% (lub 0,5%) Triton X-100 przez 1 godzinę.
6. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało (np. βIII-tubulinę, mysz, 1:2000) w buforze blokującym, dodać 100 μl do lewego górnego dołka i 50 μl do prawego górnego dołka i inkubować z neuronami przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Po odessaniu przeciwciała pierwszorzędowego przemyć je trzykrotnie 1x PBS, jak opisano w krokach 12.2-12.3. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe przygotowane z buforem blokującym do górnych studzienek urządzenia mikroprzepływowego, jak opisano w kroku 12.6, i inkubować w ciemności przez 30 minut (w razie potrzeby przykryć folią aluminiową).
8. Po trzykrotnym umyciu 1x PBS, spłucz raz ultraczystą wodą. Ostrożnie użyj zakrzywionej pęsety, aby chwycić i wyjąć urządzenie z prawego górnego rogu zestawu mikroprzepływowego.
9. Dodaj 1 ml PBS do szalki hodowlanej, aby oddzielić duże szkiełko nakrywkowe od naczynia.
10. Za pomocą pipety nabrać 15 μl podłoża montażowego i upuść je na szkiełko nakrywkowe w miejscu przeznaczonym dla szkiełek nakrywkowych.
11. Delikatnie opuść stronę ogniwa na podłoże montażowe, umieść szkiełko nakrywkowe i usuń nadmiar płynu.
12. Pozostaw medium montażowe do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
13. Gdy podłoże montażowe wyschnie w temperaturze pokojowej, użyj mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem do wykonania obrazowania.
14. Wybierz obiektyw powietrzny 20x, ustaw czas naświetlania na 100-200 ms na klatkę i ustaw moc lasera na 5-10% maksimum ze wzbudzeniem 488 nm dla białka zielonej fluorescencji (GFP) i/lub 561 nm dla białka czerwonej fluorescencji (RFP).

13. Obrazowanie żywych komórek w konwencjonalnych urządzeniach mikroprzepływowych

1. Hodowla neuronów korowych w urządzeniu mikroprzepływowym do DIV7.
2. Przygotuj barwnik z żywych komórek (np. sondę do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Rozcieńczyć barwnik we wstępnie ogrzanym (37 °C) neuronalnym podłożu podtrzymującym.
4. Załaduj roztwór barwnika do komory somatycznej urządzenia mikroprzepływowego.
5. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Delikatnie umyj komory 3 razy 3 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) HBSS zawierającego wapń i magnez.
7. Dodaj roztwór do obrazowania żywych komórek bez czerwieni fenolowej do chipa mikroprzepływowego.
8. (Opcjonalnie) Obejmują GlutaMAX (0,25%) i B27 (2%) w przypadku przedłużonego obrazowania.
9. Umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu z komorą somatyczną po lewej stronie i komorą końcową aksonu po prawej.
10. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do soczewki obiektywu, upewniając się, że olej styka się ze szkiełkiem nakrywkowym pod chipem.
11. Do obrazowania należy używać obiektywu o powiększeniu 40x z czasem naświetlania 150 ms i maksymalną mocą lasera 10-15%.
    UWAGA: Dostosuj te parametry w oparciu o fotostabilność barwnika.

14. Analiza danych

1. Użyj oprogramowania ImageJ do analizy obrazów mikroskopowych. Oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora. Wykonuj i analizuj sekwencję RNA za pomocą odpowiedniej platformy.
2. W przypadku badań metabolomicznych należy wyodrębnić surowe dane ze spektrometrii mas za pomocą programu MRMPROBS (wersja 2.60) i zebrać informacje o zidentyfikowanych metabolitach, w tym szczegóły izotopowe i obszary pików.
3. Do wszystkich analiz statystycznych należy używać GraphPad Prism (wersja 8.4.3). Przedstaw dane jako średnią ± SEM. Do porównań grup należy użyć niesparowanych dwustronnych testów t lub testów Manna-Whitneya, a do porównań między wieloma punktami czasowymi w grupach zastosuj dwukierunkową ANOVA (istotność: ns, nieistotna; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

Wyniki

Aby stworzyć kompleksową platformę badawczą do badania mechanizmów regulacji metabolicznej w neuronach korowych, najpierw wyhodowaliśmy neurony korowe w konwencjonalnym urządzeniu mikroprzepływowym, precyzyjnie kontrolując wzrost aksonów wzdłuż mikrokanałów (ryc. 2A). Dzięki odpowiedniej konstrukcji mikrokanały zostały zbudowane z małą wysokością (5 μm) i większą szerokością (10 μm), dzięki czemu każdy kanał może pomieścić więcej aksonów bez wpuszczania ciał ...

Dyskusja

Ustanowienie zaawansowanych modeli in vitro do badania uszkodzeń i regeneracji aksonów jest niezbędne do odkrycia mechanizmów molekularnych i metabolicznych zaangażowanych w naprawę neuronów^16,19. W tym badaniu przedstawiamy ustandaryzowany przepływ pracy, który integruje urządzenia mikroprzepływowe, wielkoskalowe hodowle neuronów i precyzyjne protokoły uszkodzeń aksonów, umożliwiając solidną analizę multiomiczną uszkodzonych neuronów korowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Neurobasel-A Podłoże	Gibco (firma Gibco)	10888022	Pożywka hodowlana
Alexa Fluor 488 koza anty-mysz	Invitrogen	A-21042	Immunofluorescencji
Waga analityczna	Shanghai Shunyu Hengping Instrument Naukowy Co., Ltd.	FA1004 powiedział:	Precyzyjne ważenie odczynników/próbek
B27 (50x)	Gibco (firma Gibco)	17504044	Pożywka hodowlana
Test białka BCA	Boster (Boster)	Zobacz materiał AR1189	Stężenia białka
Analizator biologiczny	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Albumina surowicy bydlęcej	Widok genowy	FA016 powiedział:	Immunofluorescencji
Mieszadło odśrodkowe	MYŚLEĆ	ARE-310 powiedział:	Mieszanie PDMS i odgazowanie
Analizator CLARIOstarPlus-ACU	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus	Stężenia białka
Inkubator CO2	Thermo Fisher Scientific (Asheville) Sp. z o.o.	3111	Inkubacja kultur komórkowych w temperaturze 37 ° C, 5% CO?
Odporna na korozję membranowa pompa próżniowa	Szanghaj Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	LC-85DLC	Odessać zużytą ciecz i zapewnić ssanie do aksotomii
D-GLUCOSE (U-13C6, 99%)	Laboratoria Izotopowe w Cambridge	Zobacz materiał CLM-1396	Strumień metaboliczny
DNaza I	Roche	11284932001	Hodowla neuronów
Platforma Dr.TOM2	BGI Genomika		Wykonywanie i analiza sekwencjonowania RNA
Elektryczny piec do suszenia gorącym powietrzem	BIOM Huahong Bonn / Huaying Bosi	DHG-9070A	Utwardzanie PDMS
Waga elektroniczna	Szanghaj Huachao Industrial Co., Ltd.	Zobacz materiał HC313	Rutynowe ważenie materiałów
Fluoromount Wodne medium montażowe	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F4680	Immunofluorescencji
GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	35050061	Pożywka hodowlana
Glicyna	Solarbio (Słoneczna Biologia)	Kontroler G8200	Immunofluorescencji
HBSS (Sieć HBSS)	Gibco (firma Gibco)	14025092	Hodowla neuronów
HBSS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco (firma Gibco)	14175095	Hodowla neuronów
Wysokociśnieniowy sterylizator parowy	STIK Instrument (Szanghaj) Co., Ltd.	HMJ-54A	Sterylizacja sprzętu i pożywek laboratoryjnych
Komora hipoksyjna	Technologie STEMCELL	27310	Leczenie niedotlenienia
ObrazJ	NIH		Służy do analizy obrazów mikroskopowych
Mikroskop Leica	Leica Microsystems CMS GmbH	DMIL LED Fluo	Obserwacja na żywo i fluorescencyjna
Rozwiązanie do obrazowania żywych komórek	Invitrogen	A14291DJ	Obrazowanie żywych komórek
Medyczny pojemnik do przechowywania w niskiej temperaturze (-80 ° C)	Qingdao Haier Biomedical Co., Sp. z o.o.	DW-86L388J	Długotrwałe przechowywanie próbki w temperaturze -80 & deg; C
Mini biurkowa pompa próżniowa	Haimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.	GL-805	Zastosowania próżniowe na małą skalę
MitoTracker Pomarańczowy CMTMRos	Invitrogen	Zobacz materiał M7510	Barwienie potencjału błony mitochondrialnej
Program MRMPROBS		Wersja 2.60	Aby wyodrębnić surowe dane ze spektrometrii mas
Podłoże nerwowo-podstawowe	Gibco (firma Gibco)	21103049	Pożywka hodowlana
Neurobaseal-A bez glukozy	Gibco (firma Gibco)	A2477501	Pożywka hodowlana
Papaina	Worthington	LS003127	Hodowla neuronów
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6148	Utrwalanie komórek
PDMS (system zarządzania zasobami ludzkimi)	Dow Corning	Zobacz materiał DC184	Produkcja urządzeń
Fiolka z inhibitorem PDS Kit	Worthington	LK003182	Hodowla neuronów
Penicylina Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15140122	Pożywka hodowlana
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Ostrze biologiczne	BL302A	Rozcieńczyć substancje i oczyścić pojemniki na komórki
Czyścik plazmowy	Plazma Harricka	ODC-32G-2	Aktywacja
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6407	Hodowla neuronów
Pryzmat	Podkładka graficzna	Wersja 8.4.3	Analizy statystyczne
Wirówka z chłodzeniem	Eppendorf AG (Niemcy)	5430R	Rozdzielanie próbek w kontrolowanych temperaturach
Zestaw do ekstrakcji RNArep Pure Cell/Bacterial Total RNA	Prowincja Tiangen	DP430 powiedział:	Transkryptomika
Rotametr	Dwyer	Przekaźnik RMA-23-SSV	Kontroluj niski przepływ tlenu
Mikroskop stereoskopowy	Korporacja Olympus	SZ2-ILST	Obserwacja i analiza próbki
Wytrząsarka orbitalna Stuarta	Kylin-Bell powiedział:	TS-200 powiedział:	Mieszanie kultur komórkowych/roztworów z regulowaną prędkością
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Silnik X100	Immunofluorescencji
Rotacyjna łopatkowa pompa próżniowa ULVAC	ULVAC (Ningbo) Co., Sp. z o.o.	GLD-N202	Wytwarzanie próżni do filtracji/suszenia
β III-tubulina	Preparat Promega	Zobacz materiał G7121	Immunofluorescencji