Artykuł metodologiczny

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

DOI:

10.3791/68928

⸱

14 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten pokazuje, jak model myszy zawierający domenę homologii 2 zawierający domenę 5'-inozytol fosfatazy (SHIP) niedoborowy dla zapalenia i włóknienia kości typu Leśniowskiego-Crohna (CD) podobnego do choroby Leśniowskiej (CD) może być wykorzystywany do testowania nowych terapii dla CD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Crohna (CD) to przewlekła, nawracająca choroba zapalna charakteryzująca się segmentowym, przezmuralnym zapaleniem, które może dotyczyć dowolnej części przewodu pokarmowego. Charakterystyczną cechą CD jest upośledzenie funkcji bariery jelitowej, a włóknienie jelit jest częstym powikłaniem. Myszy niedoborowe SHIP (SHIP-/-) spontanicznie rozwijają dysfunkcję bariery jelitowej, zapalenie jelita oraz patologię włóknistą, co powtarza kluczowe cechy zapalenia kręta (CD-podobnego). Myszy SHIP-/- stanowią cenny wzór do testowania terapii przeciwzapalnych i przeciwfibrotycznych w CD.

Tutaj opisujemy metody oceny interwencji terapeutycznych w tym modelu, wykorzystując deksametazon jako przykład skutecznej terapii. Oferujemy krok po kroku protokół charakteryzacji choroby i odpowiedzi na leczenie , w tym ocenę przepuszczalności jelit mierzoną za pomocą FITC-dektranu, a także ogólne badanie patologiczne i szczegółowe analizy histologiczne. Oceny histologiczne obejmują barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w przypadku stanu zapalnego, barwienie trójchromowe Massona w przypadku włóknienia oraz barwienie błękitu alcjanowego/kwasowo-Schiffowego (PAS) w przypadku hiperplazji i hipertrofii komórek pucharowych. Dodatkowo w celu oceny stanu zapalnego określa się cytokiny i markery zapalne w tkance biodrowej. Razem te metody stanowią kompleksowe ramy oceny skuteczności leczenia w modelu mysim SHIP-/- zapalenia jelczyny przypominającej CD. Protokół ten jest szeroko stosowany wśród badaczy badających stan zapalny jelit, gojenie się błony śluzowej oraz włóknienie jelit.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa główne typy zapalnych chorób jelit (IBD) to choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) oraz wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), które charakteryzują się przewlekłym zapaleniem przewodu pokarmowego, które może nastąpić po nawrotach z remitentem lub postępującymprzebiegiem 1. Chociaż IBD historycznie była uznawana za chorobę krajów zwesternizowanych, jej częstość występowania szybko rośnie w krajach rozwijających się w Ameryce Południowej, Azji i Afryce2. Równocześnie rozpowszechnienie nadal rośnie w Ameryce Północnej, Europie i Australii, z niemal 50% wzrostem zarówno zachorowalności, jak i częstości występowania w latach 1990–2019, co podkreśla rosnące globalne obciążenie zdrowotne IBD 2,3. Pomimo znacznych badań naukowych, przyczyna IBD pozostaje nieznana. Obecne dowody wskazują na złożoną interakcję między podatnością genetyczną, dysfunkcją układu odpornościowego a czynnikami środowiskowymi, w tym zmianami w mikrobiomie 4,5.

Istnieją istotne różnice między CD a UC. W UC zapalenie jest ograniczone do jelita grubego i charakteryzuje się ciągłym zaangażowaniem ograniczonym do warstwy śluzowej 6,7. Natomiast CD charakteryzuje się nieciągłym i przezmuralnym zapaleniem, które może dotyczyć dowolnej części przewodu pokarmowego, najczęściej w końcowym jelicie krętym 6,7. Charakterystycznym powikłaniem CD jest włóknienie jelit, które przyczynia się do powstawania zwężeń i niedrożności jelit8. Włóknienie definiuje się poprzez nadmierne odkładanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, oraz pogrubienie warstw mięśni jelit 9,10. Około 30% osób z chorobą księżną rozwija chorobę zwężające w ciągu 10lat od diagnozy. Obecnie żadna terapia nie celuje bezpośrednio w zwłóknienie, co jest niezaspokojoną potrzebą kliniczną, którą można rozwiązać za pomocą odpowiednich modeli przedklinicznych do badania tego powikłania 9,12.

Aby lepiej zrozumieć patogenezę IBD i ułatwić rozwój nowych terapii, opracowano liczne modele myszy12. Chociaż istnieje wiele modeli zapalenia jelita grubego, tylko kilka z nich powtarza zapalenie jelita jelita i włóknienie związane z CD.12. Wśród nich są opisane tutaj homologii 2 z niedoborem 5'-inozytolowej fosfatazy (SHIP-/-), a także myszy SAMP1/YitFc i myszyTnf ΔARE. Modele te łącznie odzwierciedlają złożoność ludzkiego CD, ponieważ każdy z nich jest napędzany przez odrębne mechanizmy komórkowe i molekularne. Choroba u myszy SAMP1/YitFc wynika z predyspozycji poligenowej wpływającej na funkcję bariery nabłonkowej i regulację odporności13,14, podczas gdy myszyTnf ΔARE mają delecję elementów bogatych w AU w mRNA TNF, co prowadzi do zwiększonej stabilności mRNA i nadprodukcji TNF15,16. Choć są cenne, te modele mają swoje ograniczenia. Model SAMP1/YitFc cierpi na niską efektywność hodowlę, co stanowi wyzwanie w uzyskaniu wystarczającej wielkości kohorty dla badań17. Ponadto modelTnf ΔARE wymaga do 24 tygodni na rozwinięcie zauważalnej patologii fibrotycznej, co czyni badania interwencyjnych kosztownymi i trudnymi16.

SHIP jest ujemnym regulatorem szlaku sygnalizacyjnego fosfatydylinozytol-3-kinazy (PI3K) i jest głównie ekspresjonowany w komórkach hematopoietycznych. Działa poprzez usunięcie grupy fosforanowej 5' z fosfatydylinozytolu 3,4,5-trisfosforanu, co tłumi sygnał PI3K18 w dalszej fazie. Myszy SHIP-/- oferują kilka zalet w badaniach przedklinicznych. Te myszy są stosunkowo łatwe do rozmnażania i wykazują oznaki zwłóknienia już od 8. tygodnia życia19 lat. Przyspieszona remodelacja włóknistości w tym modelu prawdopodobnie jest napędzana przez zwiększone odpowiedzi zapalne spowodowane zaburzeniem szlaku PI3K, co prowadzi do hiperaktywacji komórek odpornościowych i późniejszej szybkiej remodelacji tkanek. Co najważniejsze, my i grupa Kerra niezależnie wykazaliście, że myszy SHIP-/- rozwijają zapalenie kręci kręcowej o cechach bardzo przypominających ludzkie19,20 cykl cyklu. Potwierdzając znaczenie tego modelu, podgrupa osób z CD miała zmniejszoną aktywność SHIP zarówno w biopsjach jelita, jak i PBMC21. Co więcej, osoby o niskiej aktywności SHIP mają tendencję do poważniejszych przebiegów choroby, często wymagających wielu operacji22.

SHIP-/- myszy zaczynają rozwijać spontaniczny, nieciągły stan zapalny jelit lokalizowany w dalszej części jelita już w wieku 4 tygodni, a stan zapalny występuje u wszystkich myszy do 6. tygodnia życia20 lat. Do 8. tygodnia życia myszy mają już wykształconą patologię fibrotyczną, charakteryzującą się pogrubieniem mięśnia zewnętrznego oraz rozległym nagromadzeniem kolagenu w podśluzówce i między warstwami mięśniowymi19. Stan zapalny w tym modelu jest wywoływany przez interleukinę-1β (IL-1β)21 pochodzącą z makrofagów. Zarówno wyczerpanie makrofagów przy użyciu liposomów zawierających klodronaty, jak i farmakologiczna blokada sygnalizacji IL-1 za pomocą antagonisty receptora IL-1 (anakinra) złagodziły stan zapalny jelit u myszy SHIP-/-21. Oprócz zapalenia jelita krętego, myszy SHIP-/- wykazują zapalenie płuc, które wykorzystaliśmy do oceny efektów poza celem terapii przeznaczonych do lokalnego dostarczania jelita23. Inni zgłaszali, że hamowanie kaspazy-8 przy użyciu Z-IETD-FMK znacząco zmniejsza zarówno stan zapalny jelita mięciowego, jak i płucnego u myszy SHIP-/- 24, co dodatkowo wspiera patologię płuc jako dodatkową cechę do oceny ogólnoustrojowej kontroli zapalnej.

Niniejszy artykuł metodologiczny powraca do naszych niedawno opublikowanych badań nad skutecznym leczeniem deksametazonem23 oraz zawiera szczegółowy opis kluczowych procedur technicznych, z dodatkowymi rozważaniami dotyczącymi wykorzystania modeli mysich w badaniach farmakologicznych. Konkretnie podkreślamy standardowe parametry oceny skuteczności leków w modelach IBD, w tym ocenę przepuszczalności jelit, patologii grubej, histopatologii oraz mediatorów i efektorów prozapalnych, oraz omawiamy sposoby integracji tych danych w celu wyciągania wniosków dotyczących ogólnej skuteczności terapii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania dotyczące zwierząt powinny być przeprowadzane zgodnie z protokołami etycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz zgodnie z Wytycznymi Krajowych Rad Badawczych dotyczących opieki nad zwierzętami. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt w tym protokole były zgodne z wytycznymi etycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (protokół A21-0212).

UWAGA: Aby ocenić terapeutyczny wpływ leku na patologię jelit myszy SHIP-/-, należy uwzględnić SHIP+/+ jako zdrowe kontrolne składniki do porównania. W przypadku interwencji terapeutycznej rozpocznij leczenie w wieku 6 tygodni, gdy choroba jest już w pełni ugruntowana w modelu. Tutaj zarówno myszy SHIP+/+, jak i SHIP-/- otrzymywały codzienną doustną dawkę deksametazonu w dawce 3 mg/kg w dawce 0,5% β-cyklodekstryny (pojazd) lub samemu postrojowi przez 2 tygodnie, w objętości 10 μL/g.

1. Test FITC-dekstran do pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej

  1. Szybkie myszy przez 4 godziny przed badaniem.
  2. Rozpuścić 4 kDa FITC-dekstranu w sterylnym 1x PBS do końcowego stężenia 80 mg/mL.
  3. Przygotuj wystarczająco dużo na 150 μL na mysz, plus 50 μL więcej na standardową krzywą.
    UWAGA: Minimalizuj ekspozycję na światło roztworu FITC-dekstranu oraz próbek plazmy podczas całego zabiegu.
  4. Delikatnie unieruchom (skarż) każdą mysz i podaj 150 μL roztworu FITC-dekstranu za pomocą doustnej gavage.
    UWAGA: Rozpocznij timer zaraz po podaniu pierwszego gavage. Czekaj 10-15 minut między kolejnymi myszami, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na przeprowadzenie eutanazji i dalszych procedur w sposób stopniowy, minimalizując zmienność wynikającą z różnic czasowych.
  5. Trzymaj myszy bez jedzenia przez 4 godziny.
  6. Uśpienie myszy przy użyciu izofluranu 5% (znieczulenie wziewne podawane z 1,5 litra tlenu/min), a następnie dwutlenku węgla zgodnie ze standardową procedurą instytucjonalną. Pobieranie krwi poprzez nakłucie serca za pomocą igieł 25 g i 1 ml strzykawek.
  7. Natychmiast należy dodać 10 μL roztworu kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowego do każdego 100 μL pobranej krwi jako środek przeciwzakrzepły. Dokładnie mieszaj przez inwersję.
  8. Wiruj w 1500 x g przez 10 minut w 4 °C i ostrożnie przelej plazmę (supernatant) do oznakowanych rurek mikrowirówek o pojemności 1,7 mL. Trzymaj próbki na lodzie i chronione przed światłem do czasu analizy.
  9. Każdą próbkę plazmy rozcieńcz w proporcjach 1:2 i 1:10 za pomocą 1x PBS.
  10. Dodaj 100 μL każdego rozcieńczenia do nieprzezroczystej płyty 96-dołkowej w duplikatach.
  11. Wykonaj rozcieńczenia seryjne 1:2 oryginalnego zapasu FITC-dekstrów o masie 80 mg/mL przy użyciu 1x PBS, aby uzyskać następujące stężenia: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 oraz 0 ng/mL. Dodaj 100 μL każdego stężenia do płytki z 96 dołkami w duplikacie.
  12. Zmierz fluorescencję przy wzbudzeniu 485 nm i emisji 535 nm za pomocą czytnika mikropłyt.

2. Ocena patologiczna ogólna

  1. Po pobraniu krwi do testu FITC-dekstern, ostrożnie wyciąć całe jelito cienkie.
  2. Delikatnie usuń przymocowany tłuszcz i tkankę łączną.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tkanką, ponieważ chore obszary mogą być delikatne i podatne na pękanie.
  3. Połóż jelito płasko na arkuszu czystego białego papieru dla maksymalnego kontrastu. Wizualnie obejrzyj tkankę pod kątem makroskopowych oznak choroby. Stan zapalny jest zazwyczaj lokalizowany w dalszej części jelita cienkiego na odległość 10 cm u myszy SHIP-/-.
    UWAGA: Kluczowe cechy makroskopowe do oceny to zmiany koloru, w których obszary wykazują widoczne zaczerwienienie lub hiperemię w porównaniu do sąsiedniej tkanki o normalnym wyglądzie. Dodatkowo sprawdź pogrubienie tkanek, ponieważ dotknięte obszary mogą wyglądać na opuchnięte, obrzęknięte lub sztywne po delikatnym dotyku. Zwracaj uwagę na obecność krwi, która może pojawiać się jako widoczne krwotoczne plamy, ciemnoczerwone przebarwienia lub przylegająca krew.
  4. Ustaw jelito obok linijki dla skali i zrób zdjęcie, aby udokumentować ogólne wyniki patologiczne.

3. Ocena histologiczna

  1. Usuń zawartość jelit, delikatnie przepłukując lumen 1x PBS za pomocą strzykawki. Nie wywieraj zbyt dużej siły na tkankę, ponieważ może to zniekształcić strukturę kosmków i krypt.
  2. Zidentyfikuj i pobierz około 1 cm dalszej części jelita jelenia, która najlepiej odzwierciedla ogólną patologię. Uwzględnij widoczne obszary dotknięte, jeśli występują. Do porównań (SHIP+/+ vs. SHIP-/-) upewnij się, że tkanki są pobierane z dopasowanych pozycji anatomicznych.
    UWAGA: Do wstępnej oceny skuteczności leczenia zaleca się przygotowanie jelita jelewego jako rolka szwajcarska. Ta metoda zapewnia globalną wizualizację chorób i zmniejsza błędy próbkowe.
  3. Ułóż tkankę płasko w kasecie histologicznej, umieszczając ją między gąbkami, aby zapobiec złożeniu.
  4. W przypadku barwienia trójchromowego hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz trójbarwnego barwienia Massona należy utrwalić tkankę na noc w 10% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze 4 °C, używając co najmniej 10-20 razy większej objętości tkanki (około 5 mL na kasetę) i dbając o pełne zanurzenie. Przelewaj kasety do 70% etanolu do przechowywania, utrzymując je całkowicie zanurzone aż do przetworzenia.
    UWAGA: 10% formalina, utrwalacz zawierający 3,7% formaldehydu, jest silnym drażniącym czynnikiem oddechowym, uczulającym na skórę i jest klasyfikowany jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Wdychanie, połknięcie lub kontakt ze skórą może powodować ostrą toksyczność, podczas gdy przewlekła ekspozycja może zwiększać ryzyko nowotworów. Wszystkie procedury z udziałem formaliny powinny być wykonywane w certyfikowanym okapie chemicznym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), w tym fartucha laboratoryjnego, rękawiczek odpornych na chemikalia oraz ochrony oczu. Zbieraj odpady w pojemnikach wyraźnie oznaczonych jako "Odpady formalinowe" w celu właściwej utylizacji zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Wszystkie materiały skażone formaliną (np. końcówki pipet, chusteczki, rękawiczki) powinny być traktowane jako chemicznie niebezpieczne odpady i wyrzucane zgodnie z lokalnymi procedurami Ochrony Środowiska i Bezpieczeństwa (EHS).
  5. W przypadku barwienia błękitu alcjanskiego/PAS utrwalaj tkankę w roztworze Carnoya (60% etanolu, 30% chloroformu i 10% kwasu octowego lodowca) w temperaturze 4 °C przez noc, używając około 5 mL na kasetę, czyli 10-20 razy większą objętość tkanki. Przenieś kasety do 100% etanolu do przechowywania aż do przetworzenia.
    UWAGA: Roztwór Carnoya składa się z 60% etanolu, 30% chloroformu i 10% kwasu octowego glacjalnego. Ta mieszanina jest wysoce lotna, łatwopalna i toksyczna. Roztwór Carnoy należy przechowywać wyłącznie w okapie i przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach, z dala od źródeł ciepła lub zapłonu. Odpady Carnoy's powinny być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na mieszane rozpuszczalniki organiczne i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Wszystkie materiały skażone roztworem Carnoya powinny być traktowane jako chemicznie niebezpieczne odpady.
  6. Osadz tkanki w parafinie i wycinaj przekroje o wymiarach 5 μm do barwienia.
  7. Oceniaj przekroje brzęczne barwione H&E w skali 16-punktowej zgodnie z kryteriami z Tabeli 1. Ostateczny wynik uszkodzeń histologicznych ustalany jest na podstawie uśredniania wyników od dwóch recenzentów, którzy są ślepi na warunki eksperymentalne.
  8. Oceń trójbarwne przekroje poprzeczne Masson, używając skali 6-punktowej na podstawie kryteriów z Tabeli 2. Ostateczny wynik z włóknieniem obliczany jest jako mediana wyników przydzielonych przez dwóch niezależnych recenzentów nieświadomych warunków eksperymentalnych.

4. Ocena cytokinowa

  1. Po sekcji i usunięciu próbki histologicznej pobierz pozostałą część dystalnego 10 cm jelita krętego.
  2. Osusz tkankę i zapisz wagę. Szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania.
  3. Gdy są gotowe do obróbki, pobierz tkankę i trzymaj ją na lodzie przez cały czas.
  4. Zważ próbki tkanek. Przygotuj wystarczający bufor homogenizacyjny dla wszystkich próbek, dodając inhibitory proteazy do 1x PBS (aprotynina i leupeptyna, każdy w dawce 10 μg/mL). Użyj 10 μL buforu na mg tkanki (np. 100 mg tkanki wymaga 1 mL buforu).
    UWAGA: Bufor homogenizacyjny musi być przygotowany świeżo w dniu homogenizacji, aby zapewnić skuteczność inhibitorów proteazy.
  5. Homogenizuj pełnogrubą tkankę jelita w lodowatym buforze homogenizacyjnym za pomocą homogenizatora laboratoryjnego. Upewnij się, że ujednolicenie jest jednolite i wolne od widocznych fragmentów tkanek. Dokładnie opłucz końcówkę homogenizatora PBS między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  6. Wiruj tkankę w 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Oczyszczone supernatanty są aliquotowane, aby uniknąć cykli zamarzania i rozmrażania oraz przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
  8. Wykonaj enzymatyczne immunosorbentne testy (ELISA) na oczyszczonych supernatantach w celu ilościowego określenia cytokin zainteresowanych tematem, zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Gęstość optyczna na 450 nm została zmierzona za pomocą czytnika mikropłyt Varioskan LUX z oprogramowaniem Skanlt RE 7.0.2, z długością fali odniesienia 570 nm do korekcji. Do analizy danych użyto Microsoft Excel, a wartości absorpcji w zakresie liniowym krzywej standardowej zostały interpolowane w celu określenia stężeń cytokin.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6-tygodniowe myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były doustnie podawane 0,5% β-cyklodekstryny (kontrola pojazdu; n = 6/genotyp) lub 3 mg/kg deksametazonu (n = 6/genotyp) dziennie przez 2 tygodnie. Czas i czas trwania leczenia zależą od modelu i powinny uwzględniać początek oraz tempo postępu choroby, a także to, czy interwencja ma charakter profilaktyczny czy terapeutyczny. W eksperymentach należy stosować równą liczbę samców i samic myszy. Chociaż nie zidentyfikowaliśmy różnic płciowych w naturalnym przebiegu choroby u myszy SHIP-/-, różne protokoły leczenia mogą wykazywać odpowiedzi specyficzne dla płci. W tym modelu profilaktyczne leczenie od 4 do 6 tygodnia życia może być stosowane w celu zapobiegania wystąpieniu stanu zapalnego i włóknienia, natomiast programy terapeutyczne wykonywane w wieku 6-8, 8-10 lub 6-10 tygodnia życia mogą służyć do oceny skuteczności leczenia w przypadku choroby ugruntowanej. Optymalne dawkowanie i czas dawkowania powinny być kierowane literaturą i badaniami nad miareczkowaniem. Wcześniej wykazano, że ten schemat dawkowania deksametazonu jest skuteczny, gdy podaje się go po rozwinięciu zapalenia jelita jelita.

Zalecany harmonogram dnia zbiorów przedstawiony jest na rysunku 1A. Deksametazon nie wywołał żadnej patologii jelitowej u myszy SHIP+/+ na podstawie badania ogólnego. Myszy SHIP-/- wykazywały widoczne miejsca zaczerwienienia i pogrubienia, wskazujące na stan zapalny. Te grube cechy patologiczne nie występowały u myszy SHIP-/- leczonych deksametazonem (Rysunek 1B). Aby ocenić funkcję bariery jelitowej, po doustnym gavage zmierzono stężenia FITC-dekstranu w osoczu. Chociaż nie istotne statystycznie, myszy SHIP-/- miały podwyższone stężenia FITC-dekstran w osoczu w porównaniu do kontrolnych SHIP+/+, co sugeruje zwiększoną przepuszczalność jelit. Leczenie deksametazonem obniżyło stężenie FITC-dekstranu u myszy SHIP-/- do poziomu podobnego do obserwowanego u myszy SHIP+/+ (rysunek 1C).

Histologiczne badanie przekrojów jelitowych myszy SHIP-/- wykazało charakterystyczne cechy patologiczne, w tym infiltrację komórek odpornościowych, zakłóconą architekturę krypt kozmków, hiperplazję/hipertrofię komórek pucharowych oraz pogrubienie warstwy mięśniowej (Rysunek 2A). Cechy te odzwierciedlały się w znacząco wyższych wynikach uszkodzeń histologicznych w porównaniu do myszy SHIP+/+ (p = 0,0005, rysunek 2B). Uszkodzenia histologiczne nie zaobserwowano u myszy SHIP+/+ leczonych deksametazonem. Zgodnie z poprawą obserwowaną w patologii grubej i funkcji barierowej, deksametazon zmniejszał histopatologię u myszy SHIP-/-, choć efekt ten nie był statystycznie istotny (p = 0,0981, rysunek 2A i rysunek 2B). Trójchromowe barwienie Massona wykazało znaczne osadzanie kolagenu w tkankach jelitowych SHIP-/-, wraz ze znacząco wyższymi wynikami zwłóknienia w porównaniu z kontrolą SHIP+/+ (Rysunek 2C). Deksametazon skutecznie osłabił cechy włóknistej u myszy SHIP-/-, obniżając wyniki zwłóknienia do wartości porównywalnych z kontrolami SHIP+/+ (Rysunek 2C). Dodatkowo, barwienie błękitu alcowego/PAS potwierdziło hiperplazję/hipertrofię komórek pucharowych u myszy SHIP-/-, która została zmniejszona po leczeniu deksametazonem (Rysunek 2D).

Aby ocenić stężenia cytokin zapalnych, przeprowadzono badania ELISA na homogenatach tkanek jelita o pełnej grubości (Rysunek 3A). Stężenia IL-1β były istotnie wyższe u myszy SHIP-/- w porównaniu z kontrolnymi SHIP+/+ (p = 0,0468), co zgadza się z wcześniejszymi ustaleniami korelującymi ekspresję IL-1β z nasileniem choroby w tym modelu. Leczenie deksametazonem znacząco obniżyło stężenie IL-1β u myszy SHIP-/- (p = 0,0023). Zgodnie z wcześniejszymi raportami, stężenia IL-6 lub TNF nie różniły się w czterech grupach eksperymentalnych. Zmierzyliśmy także stężenia białek związanych z neutrofilami: mieloperoksydazy (MPO) i lipokaliny-2 (LCN-2) w homogenatach o pełnej grubości jeli, jako dodatkowe biochemiczne markery stanu zapalnego (Rysunek 3B). Zarówno stężenia MPO, jak i LCN-2 były istotnie wyższe (p = 0,0031 i p = 0,0002 odpowiednio) u myszy SHIP-/- w porównaniu do kontrolnych SHIP+/+, choć wzrost LCN-2 był w dużej mierze spowodowany wysokimi stężeniami zmierzonymi u 2 z 6 myszy. Leczenie deksametazonem zmniejszyło MPO i umiarkowanie obniżyło LCN-2, różnice nie były istotne. Dane te sugerują, że MPO jest użytecznym markerem stanu zapalnego u myszy SHIP-/-, podczas gdy stężenia LCN-2 nie są tak stałe ani wiarygodne.

Aby zbadać związek między cechami zapalnymi a włóknistymi w modelu myszy SHIP-/-, przeprowadziliśmy analizy korelacji Spearmana z wykorzystaniem histologicznych wskaźników uszkodzeń, wyników zwłóknienia oraz stężeń IL-1β z tkanki szyjkowej o pełnej grubości (Rysunek 4). Stężenia IL-1β pozytywnie korelowały z wynikami uszkodzeń histologicznych (r = 0,6813), co wskazuje, że zwiększone zapalenie wiązało się ze zwiększonym uszkodzeniem tkanek (Rysunek 4A). Zaobserwowano również umiarkowaną korelację między stężeniami IL-1β a wynikami włóknienia (r = 0,4117), co sugeruje związek między produkcją cytokin zapalnych a przebudową włóknistą (Rysunek 4B). Dodatkowo, oceny uszkodzeń histologicznych istotnie korelowały z wynikami zwłóknienia (r = 0,6241), co sugeruje, że uszkodzenia strukturalne i włóknienie przebiegają równolegle u myszy SHIP-/- (rysunek 4C).

figure-results-1
Rysunek 1: Deksametazon zmniejsza ogólną patologię jelit i przepuszczalność u myszy SHIP-/-. Myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były codziennie doustnie podawane albo 0,5% β-cyklodekstryny jako środka kontrolnego (VC), albo deksametazonu (Dex; 3 mg/kg) w wieku od 6 do 8 tygodni życia. (A) Zalecany harmonogram eksperymentów. (B) Oceniono morfologię całkowitej nasypu i dalszej części kości jelewnej, a przedstawiono reprezentatywne obrazy (n = 4-6 myszy na grupę). Gwiazdki oznaczają obszary o plamastym zaczerwienieniu i pogrubieniu zaobserwowanym podczas badania ogólnego. Obrazy te mają służyć jako reprezentatywne przykłady ogólnej patologii i nie są przeznaczone do analizy ilościowej. (C) Aby ocenić przepuszczalność jelit, myszy były na czczo przez 4 godziny i podawano 80 mg/mL FITC-dektranowi. Po kolejnych 4 godzinach postu pobrano krew za pomocą nakłucia serca, a stężenia FITC-dekstranu w osocze zmierzono. Dane są prezentowane jako średni±SD. Szary pasek reprezentuje zakres stężeń FITC-deksranów w osoczu, zwykle obserwowanych u zdrowych myszy C57BL/6 cztery godziny po gavage25. Istotność statystyczną określono za pomocą testu Kruskal-Wallis, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Deksametazon zmniejsza oceny uszkodzeń histologicznych, kolagen, grubość mięśni oraz hiperplazję i hipertrofię komórek pucharowych w dalszej jelicie jelita jelita SHIP-/- myszy. Myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były codziennie doustnie podawane albo 0,5% β-cyklodekstryny jako środka kontrolnego (VC), albo deksametazonu (Dex; 3 mg/kg) w wieku od 6 do 8 tygodni życia. (A) Przekroje poprzeczne myszy z barwieniem H&E zostały sfotografowane z powiększeniem 10x; skala = 200 μm. (B) oceny uszkodzeń histologicznych dla myszy SHIP+/+ i SHIP-/- wyrażone jako mediana ± IQR. (C) Stałe przekroje poprzeczne szyldu biodrowego zostały barwione trichromem Massona pod kątem włóknienia; kolagen jest zabarwiony na niebiesko. Zdjęcia wykonano z 10-krotnym powiększeniem; Paski skalowe = 200 μm. Wyniki zwłóknienia dla myszy SHIP+/+ i SHIP-/- wyrażone jako mediana ± IQR. (D) Stałe przekroje boczne zostały bejcowane błękitem alkowym/PAS. Zdjęcia były fotografowane przy powiększeniu 10×; Paski skalowe = 200 μm. Wszystkie sekcje reprezentują n = 6 myszy na grupę (z wyjątkiem SHIP+/+ Dex i SHIP-/- Dex, n = 5). Istotność statystyczna dla wyniku uszkodzeń histologicznych została określona za pomocą testu Kruskal-Wallis, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Deksametazon obniża stężenie IL-1β w pełnogrubych homogenatach narządu z myszy SHIP-/-. Myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były codziennie doustnie podawane albo 0,5% β-cyklodekstryną jako kontrolą pojazdu (VC), albo deksametazonem (Dex; 3 mg/kg) w wieku od 6 do 8 tygodni życia. (A) Stężenia IL-1β, TNF i IL-6 mierzono w homogenatach szylowych o pełnej grubości. (B) stężenia mieloperoksydazy (MPO) i lipokaliny-2 (LCN-2) mierzono w homogenatach tkanek brzęgowych o pełnej grubości. Dane prezentowane są jako średnia ± SD. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Kruskal-Wallis, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Stężenia IL-1β korelują pozytywnie z uszkodzeniami histologicznymi, a włóknienie i włóknienie korelują z wynikiem uszkodzeń histologicznych u myszy SHIP-/-. Analiza korelacji Spearmana została przeprowadzona w celu oceny zależności między oceną uszkodzeń histologicznych, oceną zwłóknienia oraz stężeniami IL-1β w tkance szyjnej o pełnej grubości u myszy SHIP-/-. Zaobserwowano istotne pozytywne korelacje między (A) oceną uszkodzeń histologicznych a stężeniami IL-1β (r = 0,6813), (B) wynikiem włóknienia i stężeniami IL-1β (r = 0,4117) oraz (C) oceną uszkodzeń histologicznych i wskaźnikami włóknienia (r = 0,6241). Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Komponent obrażeńŚcieżka dźwiękowa
Utrata architektury krypt0 = brak
1 = <25% straty
2 = strata 25-50%
3 = strata 50-75%
4 = >75% straty
Infiltracja komórek odpornościowych0 = brak
1 = okazjonalna komórka odpornościowa w lamina propria
2 = zwiększony poziom odporności w lamina propria
3 = zbieżne komórki odpornościowe w warstwie błonki i błonie śluzowej przenikających
4 = infiltracja komórek odpornościowych w całym przekroju
Przerost i hipertrofia komórek pucharowych0 = brak
1 = <50% wzrost liczby i rozmiaru buziarskich komórek
2 = >50% wzrost liczby i rozmiaru bucharowych komórek
Wrzody0 = brak
1 = wrzód pośredni
2 = znaczne wrzody
Obrzęk0 = brak
1 = <50% sekcji
2 = >50% sekcji
Pogrubienie mięśni0 = brak
1 = pogrubienie pośrednie
2 = znaczne pogrubienie

Tabela 1: Oceny obrażeń histologicznych. Histologiczne uszkodzenia przekrojów poprzecznych jelia z SHIP+/+ i SHIP-/- myszy zabarwionych H&E są oceniane na podstawie kluczowych cech zapalenia jelita kręcowego charakteryzujących model myszy SHIP-/-, w tym utraty architektury (0-4), infiltracji komórek odpornościowych (0-4), hiperplazji i przerostu komórek pucharowych (0-2), wrzodów (0-2), obrzęku (0-2) oraz pogrubienia mięśni (0-2).

Komponent włóknieniaŚcieżka dźwiękowa
Nadmiar kolagenu0 = Normalna architektura; brak nadmiaru kolagenu
1 = Niewielki wzrost kolagenu; ograniczone do podśluzówki lub podserozy
2 = Umiarkowana ekspansja kolagenu do podśluzówki i częściowej muscularis propria, z nieuporządkowanymi pęczkami
3 = Rozległy, gęsty kolagen zastępujący normalną strukturę, obejmujący podśluzówkę i mięśnie (przezmuralne)
Fibromusckularna hiperplazja/mięśniowa/zatarcie mięśni podśluzówki0 = Brak, prawidłowa zawartość podśluzówki mięśni
1 = Niewielki wzrost zawartości mięśni
2 = Duża ilość mięśni w podśluzowości, wpływa na morfologię, ale na prawidłową strukturę
3= Mięsień zniszczył całą przestrzeń podśluzową

Tabela 2: Ocena zwłóknienia. Włóknienie w przekrojach poprzecznych jelita SHIP+/+ i SHIP-/- myszy zabarwionych masonem Massona trichrom oceniono na podstawie kluczowych cech włóknienia jelit obserwowanych w modelu SHIP-/-, w tym nadmiernego odkładania kolagenu (0-3) oraz fibromusckularnej hiperplazji lub zatarcia mięśni podśluzówki (0-3). Kolagen ocenia się pod kątem zakresu i zaburzenia architektonicznego, natomiast zmiany mięśniowe oceniane są na podstawie stopnia infiltracji mięśni i zniekształcenia struktury podśluzowej.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa procedury oceny zapalenia jelita i włóknienia jelit u myszy SHIP-/-, mysiego modelu zapalenia jelit podobnego do CD, z towarzyszącą patologią włóknistą. Model myszy SHIP-/- odtwarza cechy CD, które rzadko występują w innych mysich modelach zapalenia jelit, w szczególności lokalizację jelita podstępnego, plamy i przezmuralne oraz patologię włóknistą19,26. W połączeniu z łatwością hodowli i krótkim czasem do pojawienia się choroby, model SHIP-/- jest dobrze pozycjonowany jako potężne narzędzie badań translacyjnych wcyklu 19 cyklu.

W tym badaniu oceniono istotność statystyczną dla testu FITC-dextran oraz oceny histologicznej za pomocą testu Kruskal-Wallis, ponieważ te zbiory danych nie spełniały założeń normalności wymaganych dla jednokierunkowej ANOVA, a oceny histologiczne reprezentują zmienne nieciągłe, nieparametryczne. Chociaż nasze analizy nie wykazały statystycznie istotnych różnic między grupami leczonymi deksametazonem a leczonymi pojazdem, zaobserwowaliśmy wyraźne trendy. Deksametazon zmniejszał przepuszczalność jelit i histopatologię myszy SHIP-/-, a efekty te mogły osiągnąć istotność przy większych próbkach.

Przy realizacji tego protokołu mogą pojawić się liczne wyzwania techniczne. Jeśli chodzi o kontakt z tkankami, SHIP-/- ilea wymagają delikatnej manipulacji podczas sekcji, ponieważ są podatne na pękanie. Jest to szczególnie ważne przy przygotowywaniu tkanek do obrazowania grubego. Utrwalanie tkanek jest kolejnym kluczowym czynnikiem w analizie histologicznej. Tkanka utrwalona formaliną nadaje się zarówno do barwienia trójchromowego H&E, jak i Masson, ale jest niekompatybilna z barwieniem Alcian Blue/PAS. Natomiast tkanka utrwalona Carnoya nadaje się do barwienia H&E i Alcian Blue/PAS, ale nie do barwienia trójchromowego Massona. Fiksacja Carnoya prowadzi do intensywnego i rozproszonego ciemnoniebieskiego przebarwienia, które zaciemnia wizualizację kolagenu i warstw mięśniowych. Do analizy cytokinowej niezbędne jest przetwarzanie próbek na lodzie, ponieważ cytokiny są bardzo wrażliwe na degradację. Kluczowe jest, aby aliquot ujednolicił się bezpośrednio po przetworzeniu. Powtarzające się cykle zamrożenia i rozmrażania mogą znacząco ograniczyć integralność cytokin i podważyć potencjalne różnice między genotypami i/lub grupami leczonymi. Na koniec, aby zapewnić dokładną ilościfikację, zalecamy wielokrotne rozcieńczanie każdej próbki, aby potwierdzić, że odczyty mieszczą się w liniowym zakresie standardowej krzywej testu oraz zminimalizować potencjalne zakłócenia ze strony złożonej matrycy tkankowej. Uwzględnienie tych technicznych kwestii jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych i interpretowalnych wyników, ale biologiczna zmienność inherentna dla myszy SHIP-/- musi być również starannie zarządzana.

Istnieje kilka kluczowych aspektów myszy SHIP-/-, które należy również wziąć pod uwagę i starannie kontrolować, aby zapewnić powtarzalność i zminimalizować zmienne zakłócające. Mikrobiom jelitowy ma głęboki wpływ na rozwój choroby i odpowiedzi terapeutyczne w modelach włobrzymionego jelita mysich27,28. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że zapalenie jelit u myszy SHIP-/- jest zależne od mikrobioty i można go złagodzić antybiotykami29. Dlatego należy stosować kontrolę dla rodzeństwa miotu, aby zmniejszyć zmienność wywołaną przez mikrobiom, a grupy leczenia muszą być zrównoważone dla30 punktów pochodzenia w klatce. Ponadto niezbędna jest staranna dopasowywanie płci. Chociaż u myszy SHIP-/- nie zaobserwowano różnic płciowych w penetrancji ani nasileniu choroby, inne modele zapalenia krętoruchu, takie jak SAMP1/YitFc, wykazują wcześniejszy początek i zwiększoną ciężkość choroby u kobiet14,31. Ponieważ hormony płciowe mogą również modulować skład mikroorganizmów32, dopasowanie płci jest kluczowe, aby zminimalizować potencjalne zakłócenia w badaniach terapeutycznych. Ponadto indywidualne leczenie oceniane może wykazywać różną skuteczność u samców i samic myszy. Chociaż obecne wyniki nie wykazują różnic związanych ze płcią w chorobach ani odpowiedzi terapeutycznej na deksametazon, dopasowanie płci powinno być przeprowadzane we wszystkich badaniach terapeutycznych.

Oprócz wspomnianych powyżej kwestii mikrobiomu i płci, ważne jest uwzględnienie myszy SHIP+/+ w badaniach terapeutycznych, aby ocenić działanie pojazdu i środków terapeutycznych w przypadku braku zapalenia jelit. Zapewnia to, że ani lek, ani sposób podawania nie powodują ani nie przyczyniają się do patologii zdrowego jelita, co poprawia interpretację skuteczności terapeutycznej i bezpieczeństwa.

Termin interwencji leczeń jest również istotny i powinien być dostosowany do celów eksperymentalnych, ponieważ u myszy występują istotne różnice zarówno w stanie zapalnym, jak i włóknieniu, w wieku19, 26 lat. SHIP-/- myszy rozwijają zapalenie jelit już w wieku 4 tygodni, przy czym wszystkie myszy wykazują stan zapalny do 6. tygodnia życia, a markery patologii włóknistej można mierzyć już w wieku 6 tygodni i są dobrze ustalone w wieku 8 tygodni życia, 19,26 lat. Dlatego leczenie ukierunkowane na zapalenie jelita jelita powinno rozpocząć się w wieku 6 tygodni życia. Interwencje przeciwfibrotyczne mogą być rozpoczęte profilaktycznie w 6. tygodniu lub terapeutycznie między 8. a 10. tygodniem. Jednak początek i nasilenie choroby mogą się różnić w zależności od środowiska mikrobiologicznego, które różni się w zależności od placówek. Badacze muszą najpierw określić kinetykę choroby w swojej kolonii, zanim wdrożą protokoły leczenia. Dodatkowo, myszy SHIP-/- mogą wykazać nawet 17% spadku masy ciała w ciągu 4-5 tygodni, a kolejne 5% do 8-10 tygodni33. Zwierzęta wykazujące znaczną utratę masy ciała powinny być wyłączone z badań, ponieważ świadczy to o ciężkim przejawie choroby i może zaszkodzić efektom leczenia związanym z patologią jelit.

Ważnym aspektem przy analizie postępu choroby w modelu SHIP-/- jest wybór odpowiednich markerów zapalnych. Na podstawie naszego bogatego doświadczenia z myszą SHIP-/-, profilowanie cytokin koncentruje się zazwyczaj na konkretnych mediatorach, takich jak IL-1β, które są znane z podwyższonej aktywności podczas postępu choroby. Jednak do początkowej charakterystyki odpowiedzi zapalnych lub przy ocenie nowych strategii terapeutycznych zaleca się multipleksową analizę cytokinową. Takie bezstronne podejście umożliwia szersze profilowanie środowiska zapalnego i może ujawnić nieoczekiwane cele istotne dla patogenezy choroby lub odpowiedzi na leczenie.

Model myszy SHIP-/- oferuje praktyczne zalety umożliwiające powtarzalność i efektywność. SHIP-/- myszy rozwijają spontaniczne i stałe zapalenie jelita jelita oraz włóknienie bez potrzeby stosowania zewnętrznych czynników. Eliminuje to zmienność związaną z przygotowaniem odczynników oraz niestandaryzowane protokoły dawkowania przy wywoływaniu zapalenia jelit. Rozpoczęcie choroby jest szybkie, z objawami zapalnymi widocznymi w wieku 4-6 tygodni, a włóknieniem w wieku 8 tygodni, co czyni model zarówno efektywnym czasowo, jak i kosztownie. Dodatkowo, myszy SHIP-/- są łatwe w hodowli i utrzymaniu, genotypowanie jest proste, a nie wymagają specjalistycznych strategii hodowlanych. Upraszcza to zarządzanie kolonią, zmniejsza obciążenie techniczne i zmniejsza ryzyko wprowadzenia niezamierzonej zmienności genetycznej 19,21,26. Chorobę można wiarygodnie oceniać za pomocą szeroko dostępnych technik w większości środowisk badawczych, w tym testu FITC-dekstern, trójchromatycznego barwienia H&E i Massona oraz ELISA. Te połączone cechy wspierają efektywne projektowanie badań, obniżają bariery finansowe i techniczne oraz promują spójne generowanie danych między laboratoriami.

Chociaż model SHIP-/- oferuje unikalne zalety, ma on również swoje ograniczenia. Jak wszystkie modele przedkliniczne, nie jest w stanie w pełni odtworzyć złożonej, wieloczynnikowej natury ludzkiego IBD, na którą wpływają czynniki genetyczne, immunologiczne i środowiskowe34. Modele DSS i TNBS pozostają szeroko popularne dzięki swojej prostocie i opłacalności. W połączeniu z modyfikacjami genetycznymi, te modele chemiczne mogą służyć jako skuteczne narzędzia do zrozumienia wkładu specyficznego dla genów w funkcjonowanie bariery35. Jednak ich główną użytecznością jest modelowanie ostrych uszkodzeń nabłonka; nie oddają one przewlekłej patologii immunologicznej charakteryzującej CD oraz mechanizmu uszkodzenia nabłonka wywołanego przez substancje chemiczne, które nie mają bezpośredniego znaczeniaklinicznego 36. Wyłączne poleganie na jednym modelu może skutkować niepełną i/lub mylącą oceną potencjału terapeutycznego, dlatego zaleca się stosowanie wielu modeli, aby mieć pewność skuteczności leczenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te są wspierane przez placówkę opieki nad zwierzętami w BC Children's Hospital Research Institute oraz finansowanie z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada poprzez Canadian Glycomics Network (GlycoNet, Sieć Centrum Doskonałości) oraz Canadian Institutes of Health Research (MOP-133607 do LS). K.S. i W.M. są laureatami stypendiów doktoranckich TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,7 mL mikrorurka z zatrzaskiem i mikrorurką;DiamedSPE155-N
1x DPBS (bez chlorku wapnia, bez chlorku magnezu)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” igły & nbsp;BDREF 305122Do nakłucia serca
26G x figure-materials-2” igłyBDREF 305110Rozpłukanie jelit
Kwas octowySigma-AldrichA6283Histologia
Roztwór kwasowego cytrynianu (38 mM kwasu cytrynowego, 107 mM cytrynianu sodu, 136 mM dekstrozy)Millipore SigmaC3821
Igła karmienia dla zwierząt, niesterylna, wielokrotnego użytku, typ 304SSMillipore Sigma CAD7900 Do gavage
Proste
Rozmiar: 24G,
Lxdiam. 1 w. x 1,25 mm,
kula
AprotyninaCayman Chemical9087-70-1Bufor homogenizacyjny
BD Luer-Lok strzykawka sterylna, jednorazowa, 5 mLBDREF 309646Rozpłukanie jelit
BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA SetBD Biosciences555240
BD OptEIA Mysz TNF ELISA Set IIBD Biosciences558534
BD® Sterylna strzykawka Luer Slip Tip, jednorazowa, 1 mLBDREF 309659
Piankowe podkładki do biopsji kwadratowe, 30,2 x 25,4 x 2 mm średnicy.Simport ScientificREF M476-1Histologia
Buforowany Formalde-Fresh (niski zapach 10% Formaliny)Fisher ChemicalSF93-4Histologia
Przezroczyste płytki immuno-niesterylne z płaskim dnem na 96 dołkówThermo Scientific439454
Eppendorf 5415R Chłodzona Wirówka Marshall ScientificEP-5415R
Alkohol etylowy bezwodnyGreenfield GlobalP016EAANHistologia
Kaseta tkankowa Fisherbrand TRU-FLOWFisher Scientific15-200-403Histologia
FITC-dektranowy, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
Numer CAS: 60842-46-8
LeupeptinMillipore Sigma103476-89-7Bufor homogenizacyjny
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA  R& D SystemsDY401
Płyta wieloekranowa z 96 dołkami, pełne dnoMillipore SigmaMSSWNFX40Białe, niesterylne, niepoddające zabiegi
OmniPur ChloroformMillipore Sigma3150Histologia
Homogenizator Polytron PT-MR2100Kinematica AG632081
Wielomodowy czytnik mikropłyt Varioskan LuxThermo ScientificVL0L00D0

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

myszy z niedoborem SHIPmodel choroby Le niowskiego Crohnazapalenie jelita kr tegow knienie jelittest z FITC dekstranleczenie deksametazonemanaliza histologicznabarwienie trichromem Massonahiperplazja kom rek kubkowychoznaczanie ilo ci cytokin

Powiązane artykuły