Artykuł metodologiczny

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

DOI:

10.3791/68939

⸱

21 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikronaczyniowe zgryzania w mózgu są stosunkowo powszechne, ale pozostają w dużej mierze niedostatecznie zbadane. Wskaźnik zdarzeń, długoterminowe konsekwencje oraz potencjalne mechanizmy rozliczania są w dużej mierze nieznane. Obecne modele stosowane do badania tych zdarzeń, takie jak fotozakrzepica czy iniekcje mikrozatorówek, mają swoje zalety i ograniczenia. Badanie to opracowało szczegółowy protokół, który łączy przygotowanie przewlekłego okna czaszkowego z indukcją mikronaczyniowych zatorów mózgowych poprzez intraarterialne zastrzyki mikrosfer u myszy. Takie rozwiązanie umożliwia długoterminowe obrazowanie in vivo mikronaczynia oraz mikro-zakrycia za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Mikrosfery są dostarczane przez cewnik umieszczony w zewnętrznej tętnicy szyjnej (ECA), która jest trwale podwiązana. Co ważne, wspólna tętnica szyjna (CCA) i tętnica szyjna wewnętrzna (ICA) pozostają nienaruszone przez cały czas i po zabiegu, minimalizując tym samym zaburzenia przepływu krwi w mózgu. Aby ułatwić natychmiastowe obrazowanie in vivo oraz zapobiec skupianiu się mikrosfer lub przyczepianiu się do końcówek pipet i cewnika, mikrosfery są zawieszone w mieszance FITC-Dektranu i 0,1% Tween 20. Technika wtrysku została zweryfikowana za pomocą obrazowania 3D in situ po śmierci w celu określenia rozkładu mikrosfer. To badanie dodatkowo pokazuje swoją użyteczność na przykładzie mikroskopii dwufotonowej in vivo . Takie podejście zapewnia spójną i solidną metodę indukowania i badania mikronaczyniowych zatorowości, umożliwiając badanie ich wpływu i dynamiki oczyszczania za pomocą obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar niedokrwienny spowodowany zatorowością dużej tętnicy mózgowej to ostre i często wyniszczające zdarzenie1. Zatory mogą również występować w naczyniach bardziej odległych. W rezultacie mogą rozwinąć się ciche zawały mózgu (SBI); Jak sama nazwa wskazuje, pozostają bezobjawowe i zazwyczaj są wykrywane przypadkowo podczas obrazowania z niezwiązanych powodów 2,3. SBI są powszechne i należą do najczęściej obserwowanych schorzeń mózgowo-naczyniowych podczas autopsji osób starszych 4,5. Badania epidemiologiczne wykazały 20% częstości występowania u osób bez historii udaru. SBI przyczyniają się do zaburzeń poznawczych i demencji, zwiększają ogólną śmiertelność i są czynnikiem ryzyka przyszłych udarów 6,7,8. Zawały mają zazwyczaj tylko kilka milimetrów średnicy i są związane z zatkaniem tętnic penetrujących o średnicy około 100 μm. Te penetratory tworzą rozległe łoże tętnicowe i naczyniowate. Mały mikrozakrzep przechodzący przez tętnice penetrujące i osiadający w mikrokrążeniu poniżej prawdopodobnie pozostanie niewykrywalny na angiografii9. Jednak wiele mikrozakrzepów może być uwalnianych w przypadku migotania przedsionków, blaszek miażdżycowych oraz z innych źródeł 10,11,12,13,14. Poza mikrozakrzepami, inne mikrocząstki (MP), w tym cząstki tłuszczu, agregaty komórkowe, a nawet mikroplastiki, mogą powodować zatory mikronaczyniowe. Kilka badań wykazuje obecność plastikowego MP we krwi i mózgu większych niż średnica kapilary 5μm 15,16.

Mikronaczyniowe zgryzania pozostają stosunkowo słabo zbadane w porównaniu z ostrym udarem i SBI. Niewiele wiadomo o wskaźniku zdarzeń, długoterminowych konsekwencjach oraz możliwych mechanizmach oczyszczania. Jednak zainteresowanie szybko rośnie po udanym klinicznym wprowadzeniu mechanicznej trombektomii w udarze, gdzie mikronaczyniowe zatory mogą powodować zaburzenia mikronaczyniowej reperfuzji po pozornie udanej reanalizacji dużej tętnicy winowajskiej17. Ponadto obserwuje się wzrost badań nad mikroplastikami, które mogą częściowo wywoływać wpływ na zjawisko mikronaczyniowe 18,19,20.

Mikronaczyniowe okluzje w korze myszy można badać m.in. za pomocą mikroskopii wielofotonowej za pomocą okna czaszki. Najczęściej stosowanymi modelami do badania mikronaczyniowych okluzji mózgu są model fotokrzepowy oraz model mikrosfery. Model fototrombotyczny wykorzystuje barwniki fotoczułe do wywołania zatory w wybranych naczyniach (zazwyczaj naczyniach niekapilarnych) poprzez fotoaktywację. Jednak model ten nie pozwala na badanie zatorowości przez dłuższy czas z powodu aktywacji układu fibrinolitowego, który rozpuszcza zator21,22. Ponadto aktywacja światłoczułego barwnika powoduje uszkodzenia jednolitych form tlenu, powodując uszkodzenia śródbłonka i bariery krew-mózg (BBB)23. W badaniach nad funkcjonowaniem śródbłonka i BBB podczas zatorów mózgowych oraz długoterminowym wpływem na krążenie mózgowe i funkcjonowanie mózgu, preferowany jest model mikrosfery. Model iniekcji mikrosfery wykorzystuje mikrosfery wstrzykiwane do krążenia mózgowego do zatkania mikronaczyniamózgowego 9,24,25,26,27,28,29,30. Potencjalną wadą tego modelu jest fakt, że nie jest możliwe wcześniejsze określenie lokalizacji zatorów, w przeciwieństwie do metody fototrombotycznej31,32. Zaletą jest to, że mikrosfery o dobrze określonych średnicach mogą być wstrzykiwane, co celuje w (mikro-) naczynia o określonych średnicach 33,34,35.

Na przestrzeni lat opracowano wiele metod wstrzykiwania mikrosfer do krążenia mózgowego gryzoni. Protokoły te osiągają konsensus w dostępie do trójkąta szyjnego, składającego się z tętnicy szyjnej (CCA), tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) oraz tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) do iniekcji mikrosfery wewnątrztętnicowej. Metoda iniekcji wewnątrztętnicznej do mikrosfery różni się w zależności od protokołu na kilka sposobów. Po pierwsze, badania użyły strzykawki 9,26,27,29,33,34 lub cewnika 25,28,30,36. Po drugie, istnieje znaczna zmienność w liczbie i rozmiarze wstrzykiwanych mikrosfer. Średnice mikrosfer zazwyczaj mieścią się w zakresie od 10 do 50 μm, przy czym wybór zależy od wielkości docelowego naczynia. Zasadniczo im większe mikrosfery, tym niższy należy wstrzyknąć, ponieważ tętniczy jest mniej niż naczyńwłosowatych 25,26,30.

Uzyskanie spójnego intra-arterialnego zastrzyku mikrosfery pozostaje wyzwaniem. W praktyce wstrzykiwanych jest duża liczba mikrosfer, jednak tylko ułamek trafia do krążenia mózgowego. Jest to szczególnie problematyczne przy badaniu efektów osadzonych mikrosfer za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo , ponieważ skuteczność tej techniki zależy od obecności mikrosfer w zewnętrznych warstwach kory myszy w obrębie widoku przez przygotowane okno czaszki. Wybór odpowiednich barwników fluorescencyjnych do mikrosfer jest kluczowy, ponieważ łączenie ich z transgenicznymi myszymi modelami i barwieniem wewnątrznaczyniowym może być trudne ze względu na intensywną fluorescencję mikrosfer i nakładające się widma emisyjne.

Mikronaczyniowe okluzje są badane w modelach gryzoni, a efekty synergiczne wielu mikrosfer zostały wcześniej wykazane w mózgach gryzoni ex vivo 9, a także pozorne ekstravazowanie takich cząstek, proces zwany angiofagią 33,35,37,38. Aby umożliwić badania in vivo, opracowano metody mikroskopii wielofotonowej u myszy z oknami czaszkowymi. Celem obecnego badania jest opracowanie i przedstawienie szczegółowego protokołu intraarterialnego wstrzykiwania mikrosfer u myszy, który optymalizuje badanie ich wpływu na tkankę mózgową i los. Główną zaletą tego protokołu jest poprawa efektywności dostarczania, minimalizacja utraty mikrosfery i zwiększenie prawdopodobieństwa ich obecności w rejonie środkowej tętnicy mózgowej (MCA) w obszarze obrazowania okna czaszki. Optymalizowany protokół iniekcji do mikrosfery jest oceniany za pomocą mikroskopii in vivo dwufotonowej oraz obrazowania 3D in situ pośmiertnego z dedykowanym kriomikrotomem39.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Komitet Centralny ds. Eksperymentów na Zwierzętach Holandii udzielił pełnej zgody (AVD11400202316817).

UWAGA: Użyto samców i samic myszy w wieku od 2 miesięcy do 1 roku. Po przybyciu zwierzęta były aklimatyzowane przez 7 dni przed jakąkolwiek procedurą eksperymentalną. Zwierzęta były trzymane maksymalnie 4 osobami w klatce, zapewniano im jedzenie i wodę ad libitum oraz utrzymywano je w cyklu światła i ciemności co 12 godzin. Pozyskano myszy NG2-DsRed i TIE2-GFP (szczegóły w Tabeli materiałów ) i wyhodowano je wewnętrznie.

1. Implant okna czaszkowego

  1. Znieczulenie i opieka przedoperacyjna
    1. Dodaj 0,06 mg/mL Carprofen do wody pitnej na dzień przed rozpoczęciem operacji okna czaszki.
    2. Zważ mysz i podskórnie podaj 5 mg/kg karprofenu oraz 2 mg/kg deksametazonu podskórnie na 30 minut przed operacją.
    3. Przygotuj obszar operacyjny, umieszczając termofor z systemem sprzężenia zwrotnego na stereotaktycznej ramie i przykryj go sterylną ściereczką.
    4. Rozłóż wszystkie sterylne narzędzia chirurgiczne na drugiej sterylnej ścierecie.
    5. Znieczulać mysz w komorze indukcyjnej z mieszanką 1 L/min powietrza (30% tlenu i 70% powietrza medycznego) oraz 3-4% izofluranu, a następnie utrzymać znieczulenie 1,5-2% izofluranem przy użyciu maski na twarz.
    6. Przymocuj mysz w stereotaktycznej ramie i włóż sondę termometru z poduszki grzewczo-grzewczą prosto, używając smaru. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, i ustaw termofor na 37 °C.
    7. Podskórnie podaj 1,5 mg/kg ropivakainy na linii nacięcia chirurgicznego 5 minut przed operacją.
    8. Ogol i wyczyść skórę nad czaszką od szyi aż po oczy betadyną za pomocą bawełnianej końcówki.
  2. Przygotowanie chirurgiczne do stabilizacji głowicy i okna
    1. Za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela chirurgicznego wykonaj początkowe nacięcie skóry nad tylną częścią czaszki. Przedłuż nacięcie od szwu lambda do przodu wzdłuż linii środkowej do szwów czołowych tuż przed bregmą (Rysunek 1A). Ostrożnie cofnij i usuń skórę, aby całkowicie odsłonić mięśnie skroniowe po obu stronach.
    2. Nałóż około 0,1 mL lidokainy o 1% na czaszkę, aby zminimalizować krwawienie.
    3. Usuń okost i zadrap wszystkie obszary czaszki, gdzie będzie mocowany drążek głowy, za pomocą ostrza chirurgicznego. Zadrapania powinny być prostopadle na czaszce, aby zapewnić solidne przyleganie do głowy.
    4. Oczyść resztki krwi bawełnianą końcówką i wysuszyć czaszkę sprężonym powietrzem.
  3. Fiksacja głowicy
    1. Przygotuj mieszankę kleju dentystycznego w zimnym (4 °C) naczyniu ceramicznym, dodając 100 μL monomeru do 0,1 g polimeru i mieszając. Dodaj 1 kroplę katalizatora do mieszanki, aby rozpocząć szybkie zastyganie kleju.
    2. Nałóż klej na dolną część belki głowicy. Lekko przechyl głowę w lewą stronę boczną od zatoki strzałkowej i naciśnij na czaszkę. Nałóż dodatkowy klej na krawędzie belki główkowej, aby uszczelnić wszystkie otwory. Zapewnia to solidną przyczepność.
    3. Zrób mieszankę cementu dentystycznego, mieszając płyn cementowy o pojemności 100 μL z 0,1 g proszku. Nałóż cement na wszystkie strony belki głowicowej, zapobiegając przeciekowi cementu na czaszkę w miejscu wiercenia. Dodaj dodatkową warstwę cementu dentystycznego na górę głowy, aby utworzyć odwiert umożliwiający zastosowanie płynów na okno czaszki (Rysunek 1B).
    4. Pozwól klejowi i cementowi wyschnąć przez co najmniej 10 minut.
    5. Potwierdź solidne przyleganie drążka głowy, delikatnie naciskając na czaszkę, w której zostanie wykonana kraniotomia. Pręt głowy jest prawidłowo przymocowany, gdy czaszka się nie porusza i nie pojawia się płyn między cementem dentystycznym a czaszką.
  4. Kraniotomia
    1. Przymocuj mysz do uchwytu na obrazowanie za pomocą główki lub trzymaj ją w stereotaktycznej ramie, aby mocno zabezpieczyć głowę zwierzęcia podczas kraniotomii.
    2. Zaznacz cel wiertniczy po kraniotomii (średnica 4 mm) na czaszce za pomocą markera cienkiego punktu. Umieść MCA widoczne przez czaszkę, aby upewnić się, że okno czaszkowe jest optymalnie ułożone, pokrywając jak największą część MCA. Aby potwierdzić prawidłowy rozmiar i położenie celu wiertniczego, trzymaj szybę osłonową nad wyznaczonym obszarem i dostosuj rozmiar celu wiertniczego w razie potrzeby.
    3. Rozpocznij wiercenie okrężnymi przy oznaczeniach, nie uciskając czaszki, aby zapobiec generowaniu ciepła (Rysunek 1C). Chłodzić czaszkę, nakładając sól fizjologiczną co 30 sekund. Podczas schładzania czyść i schładzać głowicę wiertła, zanurzając ją w wodzie, a następnie susząc ręcznikiem papierowym. Regularnie usuwaj cały pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Potwierdź rozmiar kraniotomii, umieszczając szkło pokrywowe na czaszce i w razie potrzeby regulując wiercenie.
    4. Kontynuuj wiercenie w kółkach, aż kość będzie odpowiednio przerzedzona. Pęknięcia pojawią się w miejscu wiercenia, gdy czaszka zostanie prawie przebita. Upewnij się, że kość jest odpowiednio przerzedzona, dodając sól fizjologiczną, aby zmiękczyć przerzedzoną czaszkę, i delikatnie naciskając środek kości czaszkowej w obszarze wiercenia. Obszar wiercenia jest na tyle wąski, gdy czaszka porusza się równomiernie po wszystkich stronach obszaru wiercenia pod delikatnym naciskiem. Kontynuuj wiercenie aż do osiągnięcia tego punktu. Nie wierć przez czaszkę; To może uszkodzić mięśnie twardej i tkankę mózgową. Utrzymuj miejsce wiercenia nasączone w płynie mochwiowym, jeśli opona twarda jest uszkodzona lub pojawia się krwawienie.
      UWAGA: Przed usunięciem czaszki upewnij się, że cały pył kostny został usunięty z obszaru wiercenia. Resztki kości na kości twardej mogą potencjalnie inicjować odrost kości pod oknem.
    5. Dokładnie usuń cały pył kostny za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego i sprężonego powietrza. Stosuj aCSF na wywierconym obszarze, aż czaszka będzie całkowicie zanurzona. Używając igły o grubości 27 mm (0,4 mm x 16 mm) lub 30 gauge (0,3 mm x 13 mm), ostrożnie przebij przecienkłą czaszkę poziomo (~180°), unikając uszkodzenia mięśnia twardego i mózgu. Delikatnie pchaj kość do góry, aż się odłączy, stosując minimalną siłę. Jeśli kość nie odłącza się łatwo, kontynuuj wiercenie. Usuń odłączoną czaszkę kleszczami, utrzymując mózg zanurzony w płynie mózgowo-rdzeniowym (rysunek 1D).
    6. Przepłucz mózg aCSF, a następnie umieść sterylną, chłonną gąbkę hemostatyczną z żelatyną wieprzową namoczoną w aCSF, aby kontrolować miejscowe krwawienie przez 2 minuty. Ostrożnie wyjmij gąbkę, utrzymując mózg zanurzony w płynie mózgowo-płynowym. Kontynuuj płukanie za pomocą aCSF, aby upewnić się, że nie pozostał pył kostny ani krew na mózgu. Jeśli krwawienie się utrzymuje, umieść na mózgu świeżą, sterylną, chłonną gąbkę hemostatyczną nasączoną w płynie mózgowo-płynowym.
      UWAGA: Niewielkie krwawienie jest częste podczas usuwania kości. Upewnij się, że odpowietrzanie zostało zatrzymane przed położeniem szyby, ponieważ pozostałe odpowietrzanie może obniżyć przejrzystość szyb.
  5. Umieszczenie szkła okładowego
    1. Wchłaniaj aCSF pokrywający mózg bawełnianą końcówką, pozostawiając tylko cienką warstwę. Przyłóż szkło pokrywkowe do mózgu i delikatnie dociśnij je do otworu czaszki za pomocą wygiętych mikrokleszczy. Upewnij się, że szkło pokrywkowe znajduje się nieco poniżej poziomu czaszki i jest ustawione równolegle do głowki.
      UWAGA: Szyba powinna być mocno przyciśnięta do mózgu, aby zapobiec powstawaniu wnęki i zachować jakość okna. Utrzymanie szkła pokrywowego równolegle do belki głowicy zapewnia jego położenie prostopadle do obiektywu mikroskopu, poprawiając jakość obrazu.
    2. Przymocuj szkło osłonowe do czaszki i głowy klejem epoksydowym, nakładając je na boki, jednocześnie trzymając szkło mocno na miejscu i równolegle do głowy.
    3. Zabezpiecz wszystkie krawędzie szkła osłonowego klejem, aby zapobiec narażaniu mózgu. Podczas aplikacji połóż jedną kroplę aCSF na mózgu, aby zapobiec przenikaniu kleju pod okno lub kontaktu z oponą twardą (Rysunek 1E).
    4. Pozwól klejowi zastygnąć przez 5 minut.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu kraniotomii. Szczegółowe przykładowe zdjęcia i schematy kluczowych etapów podczas kraniotomii i zakładania głowki. (A) Usunięcie skóry (krok 2.2). (B) Mocowanie główki (krok 2.3). (C) Wiercenie kraniotomii 4 mm (krok 2.4.3). (D) Usunięcie czaszki (krok 1.4.5). (E) Umiejscowienie szyby osłonowej (krok 1.4.7). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Opieka pooperacyjna
    1. Podaj 5 mg/kg karprofenu podskórnie.
    2. Przenieś zwierzę do klatki regeneracyjnej o temperaturze 37 °C na 30 minut. Następnie odłóż go do klatki domowej z karprofenem 0,06 mg/mL w wodzie pitnej na maksymalnie 2 dni po operacji.
    3. Podawaj jedzenie nasączone w karprofenie 0,06 mg/mL aż zwierzę wróci do wagi sprzed operacji.
    4. Pozwól zwierzęciu na co najmniej 7 dni na regenerację przed wykonaniem modelowej operacji mikronaczyniowej z powodu zatoru naczyniowego.

2. Model mikronaczyniowej embolii u myszy

  1. Zespół cewnika
    1. Włóż końcówkę mikrocewnika o długości 20 cm (średnica 0,23114, przewlek, 0,27432 mm) do przezroczystego cewnika (średnica 0,31, średnica 0,64 mm) i uszczelnij połączenie klejem epoksydowym oraz taśmą. Potwierdź, że całkowita długość cewnika jest wystarczająca, by pomieścić co najmniej 160 μL.
    2. Do przeciwległego końca przezroczystego cewnika należy włożyć igłę luer-lock o grubości 27 (0,1 mm x 16 mm). Zabezpiecz koniec klejem epoksydowym i taśmą.
    3. Napełnij strzykawkę 1 mL solą fizjologiczną i podłącz ją do blokady luer igły cewnika. Przepłucz 0,7 ml soli fizjologicznej, aby nie pozostać żadne wycieki ani pęcherzyki powietrza.
    4. Napełnij cewnik 80 μL soli fizjologicznej i zaznacz poziom osiągnięty w cewniku.
  2. Znieczulenie i opieka przedoperacyjna
    1. Na dzień przed operacją mikronaczyniowej zatoru podaj myszy wodę pitną zawierającą 0,06 mg/mL karprofenu.
    2. Pod sterylną ściereczką umieść poduszkę grzewczą z systemem sprzężenia zwrotnego i ustaw ją na 37 °C.
    3. Wszystkie sterylne narzędzia chirurgiczne umieść na drugiej sterylnej ścierece.
    4. Zważ mysz i podaj 5 mg/kg karprofenu podskórnie 30 minut przed operacją.
    5. Znieczulać mysz za pomocą izofluranu 3-4% w komorze indukcyjnej z przepływem gazu 1 L/min, składającym się z 30% tlenu i 70% powietrza chirurgicznego.
    6. Przenieś mysz na stół operacyjny i utrzymuj znieczulenie za pomocą maseczki na twarz, dostarczając 1,5-2% izofluranu w dawce 1 L/min z 30% tlenu i 70% powietrza.
    7. Włóż nawilżoną sondę do pomiaru temperatury odbytu i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
    8. Umieść strzykawkę 2 mL pod szyją myszy leżącej, aby ułatwić dostęp do miejsca operacji.
    9. Delikatnie przymocuj przednie łapy do stołu chirurgicznego taśmą.
    10. Ogol miejsce operacyjne i nałóż betadynę, a następnie lidokainę.
  3. Nacięcie
    1. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypania palca.
    2. Wykonaj nacięcie środkowe o długości około 0,5 cm nad tchawicą poniżej żuchwy, używając skalpela chirurgicznego i kleszczy do rozcinania.
    3. Rozcinaj tkankę łączną od powięzi szyjnej za pomocą kleszczy mikro-szwowych, aby odsłonić mięśnie sternohyoidalne pod spodem.
    4. Oddziel lewy i prawy mięsień mostkowy, delikatnie rozrywając tkankę łączną między nimi. Zwij prawy mięsień omohyoidalny ogonowo-bocznie za pomocą haczyka tkankowego. Upewnij się, że prawy trójkąt szyjny, w tym CCA, ICA i ECA, jest wyraźnie widoczny.
  4. Przygotowanie chirurgiczne tętnicy piersiowej (CCA), ICA, ECA oraz tętnicy tylnej (PPA)
    UWAGA: Unikaj chwytania lub szczypania nerwu błędnego; Poruszaj go delikatnie, aby zapobiec negatywnym skutkom dla zdrowia zwierzęcia. Nie dotykaj tchawicy, ponieważ może to powodować problemy z oddychaniem. Zidentyfikuj tętnicę potyliczną (OA), która rozgałęzia się od ICA w połowie drogi między rozgałęzieniem ICA w kształcie litery Y a początkiem ECA, oraz tętnicę tarczycową górną (TA), która odgałęzia się od przyśrodkowej strony ECA. Te tętnice są delikatne i należy je obchodzić z najwyższą ostrożnością.
    1. Usuń pozostałą powięź i tkankę tłuszczową otaczającą CCA.
    2. Ostrożnie oddziel CCA od nerwu błędnego.
    3. Wokół CCA załóż dwie nici 4/0 1,5 i luźno je zawiąż. Upewnij się, że węzły nie utrudniają przepływu krwi CCA.
    4. Usuń powięź i tkankę tłuszczową z ICA i PPA. Tymczasowo związać PPA i wszystkie boczne gałęzie ICA, w tym OA, poprzez wiązanie węzła z nicią 4/0 1.5.
    5. Usuń powięź i tkankę tłuszczową z ECA i TA. Umieść dwa luźne węzły wokół ECA i TA, używając gwintu 4/0 1.5. Umieść najbardziej dalszą nić jak najdalej od rozgałęzienia w kształcie litery Y i użyj jej do trwałego wiązania ECA i TA. Zostaw proxymalny węzeł rozwiązany.
  5. Przygotowanie roztworu mikrosfery i załadowanie cewnika
    UWAGA: Przygotować roztwór FITC-Dextran/mikrosfera tuż przed podaniu, aby zminimalizować przyczepność mikrosfery do cewnika.
    1. Ujednolic i sonikuj mikrosfery o pojemności 10 μm (7,2 x 10,6 mikrosfer/mL), aby uzyskać równomierną zawieszeność pojedynczych cząstek.
    2. Przygotuj 140 μL mieszaniny FITC-Dextran o stężeniu 25 mg/mL 70 kDa zawierającej 0,1% Tween20, następnie dodaj 20 μL zhomogenizowanych mikrosfer, aby uzyskać 160 μL mieszaniny FITC-Dextran/Tween20/mikrosfery zawierającej 1,44 × 105 mikrosfer.
    3. Na krótko cofnij strzykawkę podłączoną do cewnika, tworząc śluzę powietrzną.
    4. Zanurz końcówkę cewnika w przygotowanej mieszance FITC-Dextran/Tween20/mikrosfera i powoli cofaj strzykawkę, aż mieszanka znajdzie się w cewniku.
    5. Upewnij się, że w cewniku nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli jest obecna, wlej mieszankę do pojemnika o pojemności 0,5 mL i powtórz kroki 2.5.3 oraz 2.5.4.
    6. Włóż strzykawkę z załadowanym cewnikiem do pompy strzykawkowej. Ustaw pompę na 10 μL/min i pracuj, aż na końcu cewnika pojawi się niewielka kropla mieszanki mikrosfery.
  6. Wkładanie cewnika i iniekcja do mikrosfery
    UWAGA: Unikaj wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do układu naczyniowego, ponieważ może to powodować poważne skutki niepożądane lub śmierć. Pęcherzyki powietrza mogą powstać w wyniku nieprawidłowego obciążenia cewnika lub wycieków w rurce.
    1. Przyłóż klips naczyniowy na ICA i dokręć jeden z wcześniej przygotowanych węzłów bliższych wokół CCA (patrz krok 2.4.3).
    2. Za pomocą mikronożyczek wykonaj małe nacięcie ukośne w płąku ECA, około 0,5 mm dalej od nici ligacyjnej. Upewnij się, że rozmiar nacięcia jest nieco mniejszy niż średnica cewnika.
    3. Wchłaniaj krew sterylną ściereczką lub chusteczką, aby nie przeciekała dalej przez podwiązania i klips naczynia.
      UWAGA: Trójkąt naczyniowy musi pozostać wolny od krwi po nacięciu ECA. Pozostała krew może prowadzić do powstawania skrzepu, co może powodować duże epizody niedokrwienności mózgu po przywróceniu przepływu tętnic szyjnym lub zablokowanie ECA, uniemożliwiając wstrzyknięcie do mikrosfery.
    4. Krótko uruchom pompę strzykawkową, aby utworzyć kroplę mieszanki mikrosfery na końcówce cewnika, potwierdzając, że w końcówce nie ma powietrza.
    5. Otwórz nacięcie ECA i wprowadź cewnik za pomocą drobnych mikrokleszczy. Unikaj dotykania innych powierzchni podczas zakładania, aby zapobiec utracie mieszanki mikrosfery lub przedostaniu się powietrza do cewnika. Jeśli włożenie się nie powiodło lub końcówka cewnika dotknie powierzchni, powtórz krok 2.6.4 przed ponowną próbą.
    6. Zabezpiecz cewnik w ECA, zaciskając szew bliższy (patrz krok 2.4.5) wokół ECA.
    7. Upewnij się, że nie ma wycieków ani pęcherzyków powietrza wewnątrz naczyń, uruchamiając pompę strzykawkową od 10 μL/min. Jeśli którykolwiek z nich jest obecny, odłącz cewnik i wróć do kroku 2.6.4.
    8. Jeśli nie wykryto wycieku ani pęcherzyków powietrza, kontynuuj pompowanie z częstotliwością 10 μL/min, aby stopniowo zwiększać ciśnienie w cewniku i naczyniach, aż zauważymy widoczne powiększenie tętnicy. Aby dopasować ciśnienie tętnicze zwierzęcia, należy ustalić odpowiednie ciśnienie w cewniku i naczyniach przed ponownym otwarciem ICA i CCA. Gdy przepływ krwi w CCA i ICA zostanie przywrócony, część krwi może trafić do cewnika, ale następnie zostanie ponownie wstrzyknięta do ICA. Wizualnie potwierdzić wstrzyknięcie mieszaniny mikrosfery do ECA oraz skuteczność nagromadzenia ciśnienia, obserwując zielony barwnik FITC wypełniający tętnice. Jeśli tego nie zauważysz, zatrzymaj pompę strzykawkową, wyjmij cewnik i powtórz kroki od 2.6.4 do 2.6.8.
    9. Usuń klips naczynia z ICA, a następnie zwiększ przepływ pompy strzykawkowej do 20 μL/min. Potwierdź skuteczną iniekcję do mikrosfery, potwierdzając, że ICA dystalnie od bifurkacji PPA jest wypełniona barwnikiem FITC. Jeśli zostaniesz zatwierdzony, przejdź do kroku 2.6.11; Jeśli nie, przejdź do kroku 2.6.10.
    10. Zatrzymaj pompę strzykawkową i poluzuj podwiązanie PPA. Przesuń ligację PPA dalej dystalnie od podziału ICA-PPA, a następnie ją zaciśnij. Powrót do kroku 2.6.9.
    11. Usuń gwint, który wiązał CCA, aby umożliwić przepływ mieszanki mikrosfery do ICA.
    12. Rozwiązywanie problemów w przypadku przepływu wstecznego podczas wstrzykiwania mieszaniny mikrosfery:
      1. Jeśli nastąpi cofający się przepływ mieszaniny mikrosfery do CCA, należy zmniejszyć przepływ pompy strzykawkowej do 10 μL/min.
      2. Jeśli przepływ wsteczny będzie kontynuowany, delikatnie ściśnij ECA, ICA i CCA za pomocą mikrokleszczy, aby upewnić się, że nie ma przeszkody spowodowanej przez zakrzep.
      3. Wizualnie potwierdzić, że wewnątrz naczyń nie ma zatorowości powietrznej. Zatorowość powietrzną można rozpoznać jako przezroczysty przekrój w naczyniach.
      4. Jeśli obecny jest zatorowy płuc, zatrzymaj pompę strzykawkową i przenieś ją do ECA, delikatnie ściskając tętnicę mikro-kleszczemi. Podłącz CCA i zamontuj klips naczyniowy na ECA. Usuń cewnik i zatorowość powietrzną i wróć do kroku 2.6.4.
      5. Jeśli nie ma przeszkody, ale przepływ wsteczny trwa, zamknij CCA za pomocą klipsa naczyniowego i wróć do kroku 2.6.10.
        UWAGA: Nie powinien zachodzić cofający się przepływ mieszaniny mikrosfery do CCA, ponieważ może wskazywać na niewystarczające ponowne otwarcie ICA, zatorowość powietrzną lub powstawanie zakrzepów, co może mieć negatywny wpływ na wynik eksperymentu.
    13. Zatrzymaj wstrzyknięcie do mikrosfery, wyłączając pompę strzykawkową, gdy mieszanina w cewniku osiągnie poziom 80 μL (patrz krok 3.1.4). Wstrzykiwanych jest łącznie 80 μL FITC-Dextran/Tween20 z 7,2 x 104 mikrosferami.
  7. Zakończenie procedury
    1. Podwiązuj CCA za pomocą pozostałego przygotowanego węzła (patrz krok 2.4.3) i zamknij ICA za pomocą klipsa naczyniowego.
    2. Wyjmij cewnik z ECA, trzymając gwint mocujący cewnik w ECA w tej samej pozycji.
    3. Trwałe podwiązuj ECA, dokręcając nitkę, która zabezpieczała cewnik.
    4. Usuń klips naczyniowy i przewinęcia wokół CCA, ICA i PPA, aby przywrócić przepływ krwi. Zwilż obszar operacyjny kilkoma kroplami soli fizjologicznej.
    5. Zszyj skórę odwróconą igłą o długości 3/8 mm i niewchłaniającym się jedwabnym szwem 3-0 (USP).
  8. Opieka pooperacyjna
    1. Podskórnie podawaj 5 mg/kg karprofenu.
    2. Przenieś zwierzę do klatki do odzyskiwania (~33 °C) na 30-60 minut. Po pełnym wyzdrowieniu zwierzę z powrotem do klatki domowej odłóż.
    3. Przez pierwsze 2 dni mocz karprofen przez 10 minut w dawce 0,06 mg/mL karprofenu i podawaj zwierzęciu, a do wody pitnej dodaj 0,06 mg/ml karprofenu. Po tym okresie kontynuuj podawanie namoczonej karmany bez karprofenu, aż zwierzę wróci do wagi sprzed operacji.
    4. Przez pierwsze 2 dni monitoruj zwierzę kilka razy dziennie, a potem 3 razy w tygodniu. Uśpij zwierzę, jeśli osiągniesz odpowiedni punkt końcowy.
      UWAGA: Punkty końcowe dla człowieka są definiowane zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego. Ponadto uśpij każde zwierzę, jeśli wykazuje objawy niedokrwienia, takie jak krążenie lub paraliż, ponieważ model mikronaczyniowej embolii nie powinien powodować poważnego zdarzenia niedokrwiennego.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Operacja mikronaczyniowej zatory naczyniowej. Szczegółowe przykładowe zdjęcia i schematy kluczowych etapów podczas operacji mikronaczyniowej embolii. (A) Przygotowanie ligacji CCA (2x), ECA (2x), TA, OA i PPA (krok 2.4). (B) (Skroniowa) Podwiązanie CCA (1. st) i ECA, następnie zamknięcie OA i PPA oraz tymczasowe zamknięcie ICA za pomocą klipsa naczyniowego, umożliwiając nacięcie ECA bez krwawienia (krok 2.6.2). (C) Umieszczenie cewnika w rozciętych ECA, które są połączone drugim szwem (krok 2.6.7). (D) Otwarcie szwu bliższego wokół CCA i usunięcie klipsa naczynia z ICA w celu przywrócenia przepływu krwi, a następnie wstrzyknięcie mieszaniny mikrosfery do ICA (krok 2.6.10). CCA = Wspólna tętnica szyjna; ECA = tętnica szyjna zewnętrzna; TA = tętnica tarczycowa; OA = tętnica potyliczna; PPA = tętnica pterygopalatine; ICA = Tętnica szyjna wewnętrzna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Obrazowanie in vivo

  1. Mikroskopia dwufotonowa
    1. Umieść zwierzę w dwufotonowym uchwytie mikroskopu do pooperacyjnego obrazowania in vivo . Utrzymuj lekką znieczulenie z 1,2% izofluranem w mieszance 1 L/min z 30% tlenu i 70% powietrza oraz monitoruj częstotliwość i głębokość oddychania. Zobacz Tabelę Uzupełniającą 1 , aby poznać szczegóły ustawienia mikroskopu.
    2. Lokalizuj utknięte mikrosfery przez okno czaszki za pomocą obiektywu 10x (10x/0,30 DRY) i oświetlenia lampą rtęciową. Następnie przełącz na obrazowanie dwufotonowe z obiektywem zanurzonym w wodzie 25x (25x/0,95 WATER). Zobacz Tabelę Uzupełniającą 2 , aby poznać ustawienia obrazowania.
    3. Rejestruj stosy Z wokół interesującej nas mikrosfery.

4. Analiza sekcji zwłok

  1. Eksperymentalny punkt końcowy dla obrazowania in situ
    1. Gdy osiągnięty zostanie punkt końcowy eksperymentalny, należy uśpić zwierzę przez zwichnięcie szyjki macicy, potwierdzone przez przerwę w kręgu szyjnym lub torakotomię, przy podłożu izofluranu > 4% w mieszance 1 L/min zawierającej 30% tlenu i 70% powietrza medycznego.
  2. Obrazowanie mózgu in situ
    1. Ekstrakt mózgu, osadzenie go w rozpuszczalniku sodu o stężeniu 3,0% karboksymetylocelulozy (Sigma) zmieszanym z czarnym tuszem 0,1% (VWR) i zamrażanie w temperaturze −20 °C przez co najmniej 24 godziny.
    2. Wyobraź sobie mózg za pomocą specjalnie wykonanego małego systemu kriomikrotomu 3D do obrazowania fluorescencyjnego (small-3D-FICS), wcześniej opisanego przez Jucha R.N.S. i in.40. Ustaw system tak, aby przecinał mózg pionowo na przekroje 16 μm i obrazował w rozdzielczości 13,66 × 13,66 μm. Zobacz Tabelę Uzupełniającą 3 oraz Tabelę Uzupełniającą 4 , aby poznać ustawienia obrazowania i specyfikacje systemu. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Articulus41.
  3. Obrazowanie całych myszy in situ
    1. Usuń skórę, zęby i ogon zwierzęcia.
      UWAGA: Usunięcie ogona jest opcjonalne, ale zwiększa szybkość obrazowania.
    2. Umieść zwierzę w rozpuszczalniku sodowym o stężeniu 3,0% karboksymetylocelulozy (Sigma) zmieszanym z czarnym tuszem 0,1% (VWR) i zamroz w temperaturze −20 °C przez co najmniej 24 godziny.
    3. Wyobraz zwierzę za pomocą specjalnie wykonanego dużego systemu 3D Fluorescent Imaging Cryomicrotom System (large-3D-FICS), jak opisano wcześniej 42. Ustaw system tak, aby wycinał przekroje o długości 25,9 μm z rozdzielczością w płaszczyźnie 26,09 μm. Zobacz Tabelę Uzupełniającą 5 oraz Tabelę Uzupełniającą 6 , aby poznać ustawienia obrazowania i specyfikacje systemu. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Articulus41.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie in situ po śmierci

Skuteczność operacji mikronaczyniowej zatoru została potwierdzona obrazowaniem in situ całego ciała i całego mózgu 4 dni po operacji mikronaczyniowej (Rysunek 3A). Strzałkowy fragment myszy pokazuje osadzenie mikrosfer w mózgu. Rysunek 3B,C przedstawia przykład pobranego mózgu myszy, 1 dzień po operacji mikronaczyniowej embolii. Mikrosfery znajdowały się głównie w półkuli ipsilateralnej, w obszarze przepływu arterii środkowej i przedniej mózgu. Liczba mikrosfer w plasterkach mózgu została znacząco zwiększona, gdy do mieszaniny dodano Tween20 (rysunek 3E). Monitorowanie masy ciała podczas rekonwalescencji po operacji mikrozatoru pokazuje, że myszy traciły mniej na wadze i szybciej wracały do zdrowia po zabiegu po wstrzyknięciu mieszanki mikrosfery zawierającej Tween20 (rysunek 3F).

figure-results-1
Rysunek 3: Rozmieszczenie mikrosfer u myszy po operacji mikronaczyniowej embolii. Lokalizacja in situ mikroskopów o średnicy 10 μm w myszy zwizualizowana za pomocą oprogramowania Articulus41. (A) Przykład całej myszy z płaszczyzny strzałkowej obrazowanej dużymi 3D-FICS po operacji mikronaczyniowej embolii. (B-D) Reprezentatywne obrazy osiowe, koronalne i strzałkowe mózgu myszy, wykonane za pomocą małych 3D-FICS. (E) Średnia liczba wykrytych mikrosfer na 50 μm przekrojów koronalnych mózgu przy grubości około bregmy ± 0,5 mm dla warunków Control i Tween20. Słupki oznaczają średnią ± odchylenie standardowe. Poszczególne wymiary są pokazane jako kropki. Porównanie statystyczne przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu T; wartość p jest oznaczona na wykresie. Wartości odstające zostały zidentyfikowane i usunięte metodą zakresu interkwartylowego (IQR) (n = 1 dla obu grup), co dało ostateczny rozmiar grupy n = 3 dla kontrolnych i n = 14 dla Tween20. (F) Znormalizowane zmiany masy ciała w czasie po operacji mikronaczyniowej embolii w punkcie 0. Waga została znormalizowana do poziomu wyjściowego każdego zwierzęcia podczas operacji. Linie pokazują średnią ± SD na grupę (kontrola, n = 4; Tween20, n = 5) z Control w niebieskim kolorze, a Tween20 w ciemnopomarańczowym. Istotność statystyczna między grupami w każdym momencie czasowym oceniano za pomocą nieparowanych dwustronnych testów T. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Iniekcja do mikrosfery i mikroskopia dwufotonowa in vivo

Podczas iniekcji do mikrosfer cewniki pokryte 5% BSA wykazały wiele mikrosfer przyczepionych do powierzchni cewnika, a mikrosfery przepływające często były skupione, co mogło potencjalnie powodować większe zatyczki (patrz Wideo uzupełniające 1). Ponadto dodanie 5% BSA do mieszaniny mikrosfery, aby zapobiec adhezji i skupienia, nie jest pożądane ze względu na potencjalną odpowiedź immunologiczną po wstrzyknięciu43,44. Aby temu zapobiec, w mieszance mikrosfer zastosowano roztwór Tween20 o stężeniu 0,1%, co skutkowało widocznie większą liczbą mikrosfer przepływających przez cewnik oraz pożądaną liczbą (> 20) mikrosfer w oknie obrazowania (Rysunek 4 i Wideo uzupełniające 2). Rysunek 4A,B przedstawia przeglądowy obraz kory mózgowej z mikroskopii fluorescencyjnej 0,5 godziny po operacji mikronaczyniowej embolii. Każda biała kropka reprezentuje mikrosferę, która blokuje naczynia włosowate w mikronaczyniach mózgowych. Rysunek 4C,D przedstawia dwufotonowe obrazy z-stack 2D jako przykład. Mikrosfery powodują zatory mikronaczyniowe mózgowe z zaburzeniami przelewania, co wskazuje brak barwnika wewnątrzświetlnego poniżej mikrosfery (Rysunek 4E i Wideo Uzupełniające 3). Dodatkowo te zatory powodują zaburzenia BBB poprzez ekstrawazację barwnika FITC-Dextran (rysunek 4F,G).

Wyniki te są zgodne z niską liczbą mikrosfer przyczepionych do cewnika oraz minimalnym skupieniem mikrosfer, które zaobserwowano w cewniku podczas wstrzykiwania mieszaniny mikrosfery i Tweena. Jednak w ostatnich 20 μL mieszaniny mikrosfer w cewniku skupiło się wiele mikrosfer, które nie powinny być wstrzykiwane, aby zapobiec ewentualnemu wystąpieniu dużego zawału (patrz Wideo uzupełniające 4).

figure-results-2
Rysunek 4: Dwufotonowa mikroskopia in vivo ułożonych mikrosfer.Przykłady fluorescencyjnych i dwufotonowych obrazów in vivo mikrosfer uwięzionych w korze myszy. (A) Przegląd fluorescencyjny przez okno czaszkowe mikrosfer lodge. (B) Obraz fluorescencyjny wybranego ROI. (C,D) Dwufotonowe obrazy mikroskopii uwięzionych w mikrocyrkulacji mózgowej z wybranym zwrotem kosztów do szczegółowego obrazowania. Obrazy stosu Z są przedstawiane w 2D poprzez obliczenie odchylenia standardowego intensywności pikseli wzdłuż stosu Z. (E-G) Reprezentatywne obrazy mikroskopii in vivo z dwufotonową mikroskopią pokazującą trzy mikronaczyniowe zatory mózgowe. Czerwone strzałki wskazują obszary ekstravazacji FITC-Dekstern, wskazując na zakłócenia BBB i wyciek barwnika. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela uzupełniająca 1: Specyfikacja systemu mikroskopu dwufotonowego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Ustawienia mikroskopu dwufotonowego do obrazowania FITC-dextran i mikroskopu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3: Małe ustawienia systemu kriomikrotomowego do obrazowania 3D do obrazowania mózgu myszy z niebieskimi mikrosferami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 4: Specyfikacje systemu kriomikrotomowego do obrazowania 3D do obrazowania mózgu myszy z niebieskimi mikrosferami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 5: Duże 3D obrazowanie fluorescencyjne Ustawienia systemu kriomikrotomu do obrazowania całej myszy z czerwonymi mikrosferami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 6: Duże 3D fluorescencyjne systemy kriomikrotomowe do obrazowania całej myszy z czerwonymi mikrosferami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wideo uzupełniające 1: Cewnik pokryty powłoką BSA z powłoką 5% z przyczepnością mikrosfery do ściany cewnika oraz skupiskiem mikrosfery w mieszance mikrosfery FITC-Dextran o stężeniu 25 mg/mL podczas wstrzykiwania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające 2: Cewnik powlekany Tween20 o powierzchni 0,1% z pewną przyczepnością mikrosfery do ściany cewnika, ale bez skupiska mikrosfer w mieszance 25 mg/mL FITC-Dextran z mieszanką Tween20 0,1% z mikrosferami podczas wstrzykiwania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające 3: 3D segmentacja mikronaczyniowych zatyczek przez mikrosfery. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające 4: Ostateczna objętość wstrzyku do mikrosfery o wysokim stężeniu mikrosfery w 25 mg/ml FITC-Dextran z mieszaniną Tween20 0,1%. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Weryfikacja zgodności mikrosfery z końcówkami pipety. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Immunohistochemiczna ocena pokrycia CD45 po 1, 7 i 28 dniach po operacji mikroembolii, porównując półkule ipsilateralne i przeciwległe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby modelować zatory mikronaczyniowe, opisano protokół wstrzykiwania mikrosfer do krążenia mózgowego myszy, który umożliwia badanie mikrozatoru za pomocą mikroskopii in vivo dwufotonowej mikroskopii. Metoda ta zoptymalizowała uwięzienie mikrosfery w mózgu, z wieloma mikrosferami uwięzionymi w pierwszych 500 μm kory ipsilateralnej, co umożliwiło skuteczne obrazowanie dwufotonowe.

Wysoka liczba mikrosfer w korowej części mózgu jest kluczowa dla obrazowania in vivo dwufotonowego. Utrata mikrosfer została zminimalizowana podczas przygotowania mieszanki mikrosfery poprzez pokrycie końcówek pipety 5% BSA lub 0,1% Tween20, co zmniejszało przyczepność mikrosfery (patrz Plik Uzupełniający 1). Chociaż dokładnej liczby przyklejonych mikrosfer nie dało się określić, pomiary średniej intensywności pokazały wpływ powłok. Dodatkowo, Tween20 wydawał się zapobiegać skupianiu mikrokul w cewniku, co skutkowało wizualnie większą liczbą pojedynczych mikrosfer przepływających przez cewnik, choć nie jest to zmierzone ilościowo. Zmniejsza to ryzyko zatkań dużych naczyń oraz potencjalnego powstawania dużych obszarów niedokrwiennych i hipoksycznych, co jest niepożądane ze względu na model embolizacji mikronaczyniowych. Ponadto myszy wykazywały mniejsze utraty masy ciała i szybciej wracały do wagi przedoperacyjnej po wstrzyknięciu mieszaniny mikrosfery zawierającej niskie stężenia Tween20. Tween20 jest powszechnie stosowanym dyspersantem 45,46,47, dlatego niskie stężenia stosowane w tym badaniu nie powinny powodować toksyczności ani negatywnych skutków dla integralności BBB. Ponadto nasze dane pokazują, że wyciek BBB występuje tylko w pobliżu (lub po przejściu) miejsca zalżenia mikrosfery, a nie systematycznie, nie powodując istotnego wzrostu całkowitego pokrycia leukocytami (patrz Plik Uzupełniający 2), co potwierdza stosowanie 0,1% Tween20. Ogólnie rzecz biorąc, dodanie Tween20 przyczynia się do zmniejszenia zlepiania mikrosfer oraz zwiększenia dostarczania mikrosfer do krążenia mózgowego, co potwierdzają liczebność mikrosfer w plasterkach mózgu, a także skutkuje wystarczającą liczbą mikroskopów widocznych dla mikroskopii dwufotonowej. Chociaż stosowanie Tween20 zwiększa liczbę mikrosfer umieszczonych w mózgu, zmienność w wstrzykiwaniu mikrosfer pozostaje niezmienna. Na tę zmienność może wpływać kilka czynników. Po pierwsze, tworzenie zakrzepów w cewniku lub naczyniach może powodować przyczepianie mikrosfer do skrzepu. Po drugie, obecność pęcherzyków powietrza może zakłócać płynne dostarczanie. Wreszcie, niepełne przywrócenie przepływu krwi w CCA lub ICA może zmienić hemodynamikę, potencjalnie sprzyjając przyczepności mikrosfery do ściany naczynia lub skupianie się w lumenie. Niestety, tych odchyleń nie można wykryć podczas zabiegu wstrzyknięcia.

Mikrosfery polistyrenowe są gęstsze niż woda, co prowadzi do nierównomiernego rozłożenia po załadowaniu mieszaniny mikrosfery do cewnika. Większość mikrosfer osiada w pobliżu ściany cewnika, gdzie tarcie płynu spowalnia ich ruch względem szybszego przepływu centralnego. Ostatecznie prowadzi to do nagromadzenia mikrosfer w ostatnich 20 μL cewnika. Należy unikać wstrzykiwania tej skoncentrowanej części, ponieważ może ona powodować duże zatory i incydenty niedokrwienne. Aby temu zapobiec, objętość mieszanki mikrosfery powinna być przygotowywana na dwukrotnie większej niż zamierzona objętość wtrysku.

Operacja mikronaczyniowej embolii wymaga znacznego szkolenia i precyzji. Jednym z najbardziej wymagających technicznie etapów jest umieszczenie szwu wokół PPA, OA oraz bocznych gałęzi ICA, aby zapewnić dokładne dostarczanie mieszaniny mikrosfery do kręgu Willisa i terytorium MCA. Ten etap jest utrudniony przez bliskość nerwu błędnego w pobliżu CCA, małą średnicę naczyń i ograniczoną przestrzeń chirurgiczną, co utrudnia ustawienie szwów bez uszkodzenia nerwów lub urazu naczyń.

Chociaż klips naczyniowy może być rozważany jako alternatywa dla tymczasowego podwiązywania PPA za pomocą szwów, niesie ze sobą dodatkowe ryzyko. Klipsy mogą nieumyślnie się odłączyć, co prowadzi do ponownego otwarcia jednostki. Co więcej, użycie drugiego klipsa na PPA obok istniejącego na ICA zwiększa prawdopodobieństwo odłączenia klipsa ICA z powodu ograniczonej przestrzeni. Jeśli tak się stanie, spowoduje to znaczne krwotok i bez natychmiastowej interwencji może doprowadzić do wcześniejszego zakończenia eksperymentu. Dlatego zamykanie PPA za pomocą klipsa do naczynia nie jest zalecane.

Obecny protokół wykorzystuje cewnik zamiast strzykawki33 do iniekcji do mikrosfery. To podejście zapewnia lepszą kontrolę nad prędkością i objętością wstrzykiwania oraz umożliwia zdalne wstrzykiwanie mikrosfer (np. wewnątrz metody obrazowania, takiej jak mikroskop czy skaner MRI).

Wybór ECA zamiast CCA jako punktu wejścia pozwala CCA pozostać całkowicie otwartym podczas zabiegu, co pomaga utrzymać bardziej fizjologiczne perfuzję mózgu przez cały zabieg chirurgiczny. Dodatkowo, wstrzykiwanie mikrosfer przez ECA zamiast CCA ma inne zalety:48: i) skrócony czas całkowitej pracy podczas reperfuzji; ii) zmniejszone ryzyko krwawienia podczas wstrzyknięcia i po zakończeniu zabiegu; iii) przy metodzie wejścia CCA po usunięciu igły49 w CCA powstaje niestabilne zwężenie i zakrzepica. Powoduje to zaburzenia przepływu krwi oraz ryzyko powstawania mikrozakrzepa, które mogą trafić do mózgu. Dodatkowo, wejście przez CCA wiązałoby się z dużym ryzykiem trwałego zamknięcia CCA, co może skutkować nieoptymalną reperfuzją mózgową w okresie przeżycia po operacji, pogorszoną przez dużą zmienność kręgu Willisa u myszy50,51

Mimo pełnej optymalizacji, protokół ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, obserwacja, że mikrosfery poruszają się wolniej wzdłuż ścian cewnika i nie są równomiernie rozłożone podczas wstrzykiwania, sugeruje, że do ICA trafia mniej mikrosfer niż się spodziewano. Pomimo stosowania Tween-20 w celu zmniejszenia przyczepności, niektóre mikrosfery nadal przyczepiają się do końcówek pipety, rurki Eppendorfa i cewnika. W konsekwencji rzeczywista liczba wstrzykiwanych mikrosfer prawdopodobnie jest niższa niż obliczone 7,2 x 104 cząstek na mysz. Niemniej jednak, wystarczająca liczba mikrosfer dociera do krążenia mózgowego, aby umożliwić obrazowanie za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Protokół wtrysku i skład mieszaniny są zoptymalizowane dla mikrosfer polistyrenowych o pojemności 10 μm. Jeśli użyte materiały (końcówki, rurki, cewniki) lub rozmiar mikrosfer zostaną zmienione, zarówno procedura roztwórzenia, jak i wstrzykiwania powinny zostać odpowiednio ponownie ocenione. Po drugie, badania dotyczące najlepszej metody zamykania dużych naczyń poprzez wewnątrzluminalne zatykanie MCA wykazały, że wejście do układu naczyniowego przez trwałą ligację ECA prowadzi do niedokrwienia mięśni żucia i połykania52. Może to prowadzić do zmniejszonego spożycia pokarmu przez myszy, a co za tym idzie do nadmiernej utraty masy ciała, upośledzenia funkcji motorycznych oraz zwiększonego deficytu neurologicznego (neurologicznego). Jednak to stwierdzenie zostało obalone przez innych48. W tym badaniu monitorowanie masy ciała wykazało spodziewany spadek wagi po operacji, ale szybkie powrót do wagi przedoperacyjnej w ciągu kilku dni, co wskazuje, że myszy regenerują się i normalnie jedzą oraz piją po stałym podwiązaniu ECA. Chociaż masa zwierząt była monitorowana, jest to jedynie pośredni wskaźnik dobrostanu zwierząt i nie wyklucza całkowicie upośledzeń funkcjonalnych, takich jak miejscowe zaburzenia żucia lub ruchowe. Nie przeprowadzono bezpośrednich ocen funkcjonalnych powrotu do zdrowia, co jest ograniczeniem tego badania. Inne badanie porównywało wejście do układu naczyniowego przez CCA lub ECA i wykazało, że wejście przez CCA może prowadzić do zaburzeń reperfuzji krążenia mózgowego, dochodząc do wniosku, że preferowana jest metoda wejścia do ECA53. Po trzecie, prawidłowe i bezpieczne założenie cewnika bez wprowadzania pęcherzyków powietrza, zakrzepów krwi czy wycieku oraz bez utrudniania przepływu w CCA i ICA wymaga znacznej praktyki. Na koniec, w przeciwieństwie do innych metod mikro-zakrycia, takich jak fotozakrzepica z użyciem zastrzyku Rose-Bengal22, nie da się przewidzieć, gdzie mikrosfery ostatecznie osiadną w krążeniu.

Niniejsze badanie celowo nie obejmuje grup kontrolnych negatywnych (fałszywych) ani pozytywnych (fotozakrzepica), ponieważ nie przyniosłyby one dodatkowej wartości dla głównego celu. Sukces tego modelu definiuje liczba mikrosfer umieszczonych w mikrocyrkulacji mózgowej, szczególnie w obszarze okna czaszki, co umożliwia mikroskopię in vivo o wysokiej rozdzielczości. Zabieg pozorowany z definicji nie dawałby mikrosfer w obszarze docelowym i nie oferowałby istotnego porównania dla końcowego obrazowania in vivo . Podobnie włączenie modelu fotozakrzepicy dotyczyłoby zasadniczo innego mechanizmu patofizjologicznego i dlatego wykraczałoby poza zakres tych prac, które koncentrują się na charakteryzacji modelu mikronaczyniowej embolii zamiast porównywania metodologii. Nie prowadzono szerszych analiz histologicznych zatory i ich potencjalnego wpływu na BBB lub lokalną tkankę neuronalną, ponieważ badanie miało na celu priorytetowe traktowanie wizualizacji 3D in vivo nad walidacją na poziomie tkanek.

Szczegółowy protokół chirurgiczny zarówno dla przygotowania okna czaszkowego, jak i modelu zatoru mikronaczyniowego wspiera wiarygodne i powtarzalne badania zmian mikronaczyniowych związanych z zatorem mikronaczyniowym oraz występowania cichych zawałów mózgu na całej półkuli ipsilateralnej. Optymalizacja przygotowania i wstrzyknięcia mieszaniny mikrosfery dodatkowo wzmacniają spójność i wiarygodność tego podejścia eksperymentalnego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną wyrazić szczere podziękowania dr. Iwanowi Dobbe za opracowanie oprogramowania Articulus , które zostało wykorzystane do rekonstrukcji obrazów 3D in situ. Dziękujemy również prof. dr Nikolausowi Plesnila za uprzejme udostępnienie myszy TIE2-GFP (Jackson Laboratory, Stock No. 003658) wykorzystywanych do hodowli na miejscu.

Badanie to zostało sfinansowane przez Amsterdam Neuroscience (813294 do I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (sprzęt wywołany 2021 i 2023 do I.M.) oraz Dutch Heart Foundation (03-006-2021-T019 do I.M.).  

Badania te są również finansowane przez Holenderską Fundację Serca oraz Fundację Mózgu Holandii i prowadzone we współpracy oraz wspieranej przez Holenderski Sojusz Kardiowaskularystyczny, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Ponadto prace te były częściowo finansowane z nieograniczonego finansowania przez Stryker, Medtronic i Penumbra. Źródła finansowania nie były zaangażowane w projektowanie badań, monitorowanie, zbieranie danych, analizy statystyczne, interpretację wyników ani pisanie manuskryptów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła o grubości 27 (0,1x16 mm)Terumo-Igła 27 gauge (Krok 2.1.2.)
Oprogramowanie Articulus--Oprogramowanie do analizy 3D (Krok 4.2.2 i 4.3.3)
Betadina 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadyna/jod (krok 1.1.8 i 2.2.10.)
C& Monomer BSun Medical7111Składnik super glue (Krok 1.3.1.)
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej (nr 15)Swann-Morton205Ostrze do drapania czaszki (Krok 1.2.4.)
Karprofen (50 mg/ml)Zoetis-Leki przeciwbólowe (kroki 1.1, 1.6, 2.2 i 2.8)
KatalizatorSun Medical7110Składnik super glue (Krok 1.3.1.)
Cewnik (średnica 0,31, przenik, 0,64 mm)Freudenberg228-0661Przezroczysty cewnik (Krok 2.1.1.)
Haczyk z tkanki wykonany przez Costom--Haczyk na tkankę (Krok 2.3.4.)
Końcówki bawełniane--Bawełniana końcówka (Krok 1.1.8, 1.2.4 i 1.5.1.)
Szkło okładkoweInstrumenty Warnera64-0724Szkło czaszkowe osłony okiennej (Krok 1.4.2.)
Na zamówienie szyna główka myszy--Ramka główka do uchwytu na obrazy (Krok 1.3.2). 
Uchwyt na mysz wykonany na zamówienie  --Uchwyt na mysz obrazującą (Krok 1.4.1 i 3.1.1.)
Niestandardowa rama stereotaktyczna--Stereotaktyczna rama (Krok 1.1.7.)
Płyn dentystycznyKulzer64707937Składnik cementu dentystycznego (Krok 1.3.3.)
Proszek do cemementu dentystycznegoKulzer64707945Składnik cementu dentystycznego (Krok 1.3.3.)
Wiertarka dentystyczna  Saeshin  L-206Ćwiczenie (Krok 1.4.3.)
Deksametazon (4 mg/ml)Centrafarm-Przedoperacyjne leki (Krok 1.1.4.)
Kleszcze do rozcinaniaBraun-AesculapBD023RKleszcze (Krok 1.2.2 i 2.3.2.)
wiertło z zacięciem PK/100,5 (0,5 mm)Nauki fine19007-05Wiertło (Krok 1.4.3.)
Durateary (3,5 g)Alcon-Maść do oczu (Krok 1.1.8 i 2.2.7.)
Klej epoksydowy (1g)Pattex9H PSMG3XKlej epoksydowy (krok 1.5.2 i 2.1.1.)
Drobne mikrokleszcze prosteNarzędzia do nauki wysokiej klasyDumont #5Drobne mikrokleszcze (Krok 2.6.6.)
FITC-Dextran (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SRozwiązanie FITC-Dextran (Krok 2.5.2.)
Izofluran (1000 mg/g)Laboratoria Karizoo S.A.118938Znieczulenie (Krok 1.1.6 i 2.2.5.)
duży trójwymiarowy kriomikrotom do obrazowania fluorescencyjnego;Wykonany na zamówienie-large-3D-FICS (Krok 4.3.3)
Lidokaina (100 mg/ml)Aspen-Znieczulenie miejscowe (Krok 1.2.3. i 2.2.10)
Mikronożyczki Vannas 3-3/8 calaBraun-AesculapOC498RMikronożyczki (Krok 2.6.2)
Kleszcze do wiązania mikroszwów z okrągłą rączkąBraun-AesculapFD280RMikroforeceps (Krok 2.3.3.)
Kleszcze do wiązania mikroszwów z okrągłą rączkąBraun-AesculapFD281RMikroforeceps zgięty (Krok 1.5.1 & 2.3.3.)
Mikronaczyniowy klipsBraun-AesculapFD562RKlip naczynia (Krok 2.6.1.)
Mikrocewnik (średnica 0,23114 mm, średnica 0,27432 mm)MikrolumenMikrocewnik (Krok 2.1.1.)
Poduszka grzewcza myszy i sonda odbytniczaStoelting53800RPoduszka grzewcza (Krok 1.1.2 i 2.2.2.)
Myszy NG2-DSRedJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, nr stockowy 008241
Polietylenglikol sorbitan monolauranSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Krok 2.5.2.)
Polistyrenowe FluorKule Niebieskie (365/415)InvitrogenF8829Niebieskie mikrosfery (Krok 2.5.1.)
FluorKule polistyrenowe czerwone (580/605)InvitrogenF8834Czerwona mikrosfera (Krok 2.5.1.)
Klatka ratunkowa--Klatka regeneracyjna (Kroki 1.6.2 i 2.8.2.)
Odwrotne cięcie igły 3/8 zakrzywionej (12mm) z użyciem szwówBbraun0762067Szew (Krok 2.7.5)
ropiwacaï Ne (2 mg/ml)--Leki  (Krok 1.1.5.)
mały kriomikrotom do obrazowania fluorescencyjnego 3D   Wykonany na zamówienieSmall-3D-FICS (Krok 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Krok 1.4.6.)
Mikroskop chirurgicznyEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMikroskop do operacji (Krok 1.2. 2.1.1.)
Nożyczki chirurgiczneBraun-AesculapBC303RNożyczki chirurgiczne (Krok 1.2.2 i 2.3.2.)
Pompka strzykawkowa (do strzykawek 1 ml)Aparat Havarda70-22081 ml pompki strzykawkowej (Krok 2.5.6.)
Nić, 100m,  4/0 1,5   BbraunF1134035Wątki 4/0.15 (Krok 2.4.3.)
Myszy TIE2-GFPJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, nr aktorowy 003658
Ultra czysty miotełkaThorlabsCA6-EUSprężone powietrze (Krok 1.2.5.)
Uniwersalny przezroczysty polimerSun MedicalT058ESkładnik super glue (Krok 1.3.1.)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
  2. Bernick, C., et al. Silent MRI infarcts and the risk of future stroke: the cardiovascular health study. Neurology. 57 (7), 1222-1229 (2001).
  3. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43 (11), 3102-3104 (2012).
  4. Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11 (3), 272-282 (2012).
  5. Adachi, T., Kobayashi, S., Yamaguchi, S. Frequency and pathogenesis of silent subcortical brain infarction in acute first-ever ischemic stroke. Intern Med. 41 (2), 103-108 (2002).
  6. Bokura, H., et al. Silent brain infarction and subcortical white matter lesions increase the risk of stroke and mortality: a prospective cohort study. J Stroke Cerebrovasc Dis. 15 (2), 57-63 (2006).
  7. Vermeer, S. E., et al. Silent brain infarcts and the risk of dementia and cognitive decline. N Engl J Med. 348 (13), 1215-1222 (2003).
  8. Gupta, A., et al. Silent brain infarction and risk of future stroke: a systematic review and meta-analysis. Stroke. 47 (3), 719-725 (2016).
  9. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E., van Bavel, E. Quantitative 3D analysis of tissue damage in a rat model of microembolization. J Biomech. 128, 110723(2021).
  10. Martinez Bravo, G., et al. Platelets in thrombosis and atherosclerosis: a double-edged sword. Am J Pathol. 194 (9), 1608-1621 (2024).
  11. Kell, D. B., Lip, G. Y. H., Pretorius, E. Fibrinaloid microclots and atrial fibrillation. Biomedicines. 12 (4), 494(2024).
  12. Hubbard, W. B., Dong, J. F., Cruz, M. A., Rumbaut, R. E. Links between thrombosis and inflammation in traumatic brain injury. Thromb Res. 198, 62-71 (2021).
  13. Dupré, N., Drieu, A., Joutel, A. Pathophysiology of cerebral small vessel disease: a journey through recent discoveries. J Clin Invest. 134 (10), e176987(2024).
  14. Idicula, T. T., Naess, H., Thomassen, L. Microemboli-monitoring during the acute phase of ischemic stroke: is it worth the time. BMC Neurol. 10, 79(2010).
  15. Bai, C. L., et al. A review on micro- and nanoplastics in humans: implication for their translocation of barriers and potential health effects. Chemosphere. 361, 142424(2024).
  16. Guan, Q., et al. The landscape of micron-scale particles including microplastics in human enclosed body fluids. J Hazard Mater. 442, 130138(2023).
  17. Alves, H. C., et al. Thrombus migration paradox in patients with acute ischemic stroke. Stroke. 50 (11), 3156-3163 (2019).
  18. Ragusa, A., et al. Plasticenta: first evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  19. Rotchell, J. M., et al. Microplastics in human urine: characterisation using µFTIR and sampling challenges using healthy donors and endometriosis participants. Ecotoxicol Environ Saf. 274, 116208(2024).
  20. Marfella, R., et al. Microplastics and nanoplastics in atheromas and cardiovascular events. N Engl J Med. 390 (10), 900-910 (2024).
  21. Knezic, A., Broughton, B. R. S., Widdop, R. E., McCarthy, C. A. Optimising the photothrombotic model of stroke in the C57Bl/6 and FVB/N strains of mouse. Sci Rep. 12 (1), 7598(2022).
  22. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke. J Vis Exp. (100), e52794(2015).
  23. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72 (4), 315-325 (1987).
  24. Demura, N., Mizukawa, K., Ogawa, N., Yamashita, K., Kanazawa, I. A cerebral ischemia model produced by injection of microspheres via the external carotid artery in freely moving rats. Neurosci Res. 17 (1), 23-30 (1993).
  25. Takeo, S., et al. Sustained damage to energy metabolism of brain regions after microsphere embolism in rats. Stroke. 23 (1), 62-68 (1992).
  26. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E. N. T. P., van Bavel, E. Recovery of hypoxic regions in a rat model of microembolism. J Stroke Cerebrovasc Dis. 30 (6), 105739(2021).
  27. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., van Bavel, E., Bakker, E. Perivascular clearance of blood proteins after blood-brain barrier disruption in a rat model of microinfarcts. Microvasc Res. 148, 104515(2023).
  28. Mayzel-Oreg, O., et al. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med. 51 (6), 1232-1238 (2004).
  29. Silasi, G., She, J., Boyd, J. D., Xue, S., Murphy, T. H. A mouse model of small-vessel disease that produces brain-wide-identified microocclusions and regionally selective neuronal injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 734-738 (2015).
  30. Shen, Y., et al. Histochemistry of microinfarcts in the mouse brain after injection of fluorescent microspheres into the common carotid artery. Neural Regen Res. 17 (4), 832-837 (2022).
  31. Inoue, K., Asaka, M., Lee, S., Ishikawa, K., Yanagihara, D. Gait disorders induced by photothrombotic cerebellar stroke in mice. Sci Rep. 13 (1), 15805(2023).
  32. Nowak, B., et al. Animal models of focal ischemic stroke: brain size matters. Front Stroke. 2, 15(2023).
  33. van der Wijk, A. E., et al. Microembolus clearance through angiophagy is an auxiliary mechanism preserving tissue perfusion in the rat brain. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 195(2020).
  34. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of biodegradable microspheres in the rat brain. Drug Deliv. 30 (1), 2194579(2023).
  35. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of microspheres in a rat model of silent brain infarcts. Stroke. 50 (6), 1590-1594 (2019).
  36. Rapp, J. H., et al. Cerebral ischemia and infarction from atheroemboli <100 µm in size. Stroke. 34 (8), 1976-1980 (2003).
  37. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465 (7297), 478-482 (2010).
  38. Grutzendler, J., et al. Angiophagy prevents early embolus washout but recanalizes microvessels through embolus extravasation. Sci Transl Med. 6 (226), 226ra31(2014).
  39. Spaan, J. A. E., et al. Visualisation of intramural coronary vasculature by an imaging cryomicrotome suggests compartmentalisation of myocardial perfusion areas. Med Biol Eng Comput. 43 (4), 431-435 (2005).
  40. Juch, R. N. S., et al. Home-use hyaluronic acid jet injectors: unreliable and unsafe. Dermatol Surg. 50 (1), 62-68 (2024).
  41. Dobbe, J. G. G., Roo, M. G. A. D., Visschers, J. C., Strackee, S. D., Streekstra, G. J. Evaluation of a quantitative method for carpal motion analysis using clinical 3-D and 4-D CT protocols. IEEE Trans Med Imaging. 38 (4), 1048-1057 (2019).
  42. Demkes, E., et al. Human cardiac microtissues display improved engraftment and survival in a porcine model of myocardial infarction. J Cardiovasc Transl Res. 18 (3), 512-528 (2025).
  43. Lei, H. Y., Lee, S. H., Leir, S. H. Antigen-induced anaphylactic death in mice. Int Arch Allergy Immunol. 109 (4), 407-412 (1996).
  44. Wiedmeier, S. E., Chung, H. T., Cho, B. H., Kim, U. H., Daynes, R. A. Murine responses to immunization with pertussis toxin and bovine serum albumin: I. Mortality observed after bovine albumin challenge is due to an anaphylactic reaction. Pediatr Res. 22 (3), 262-267 (1987).
  45. Weiszhár, Z., et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 45 (4), 492-498 (2012).
  46. Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
  47. Kelava, T., Ćavar, I., Čulo, F. Influence of small doses of various drug vehicles on acetaminophen-induced liver injury. Can J Physiol Pharmacol. 88 (10), 960-967 (2010).
  48. Hu, Y., et al. CCA repair or ECA ligation-which middle cerebral artery occlusion is better in the reperfusion mouse model. iBrain. 9 (3), 258-269 (2023).
  49. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  50. Zhao, L., Mulligan, M. K., Nowak, T. S. Substrain- and sex-dependent differences in stroke vulnerability in C57BL/6 mice. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 426-438 (2019).
  51. Bonnin, P., Mazighi, M., Charriaut-Marlangue, C., Kubis, N. Early collateral recruitment after stroke in infants and adults. Stroke. 50 (9), 2604-2611 (2019).
  52. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  53. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencyjne mikrosferyokno czaszkoweobrazowanie in vivom zgowa okluzja mikronaczyniowazapychanie naczy kapilarnychbariera krew m zgwstrzykni cie do t tnicy szyjnejFITC dekstran

Powiązane artykuły