Artykuł metodologiczny

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

DOI:

10.3791/68941

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Medical Faculty, Department of Pathophysiology, University of Belgrade, 2Faculty of Electronic Engineering, University of Nis

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio (danio rerio) są szeroko wykorzystywane jako model kręgowców w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na genetyczne podobieństwo do ludzi, przezroczystość optyczną we wczesnym okresie rozwoju oraz zdolność do obrazowania in vivo. Niniejszy artykuł przedstawia ustandaryzowany, dostępny protokół oceny morfologii i funkcji serca w zarodkach danio pręgowanego po 96 godzinach po zapłodnieniu (HPF) za pomocą mikroskopii świetlnej w świetle. Metoda obejmuje pobieranie zarodków, badania morfologiczne, unieruchomienie u agarozy, nagrywanie wideo bijącego serca oraz analizę parametrów serca opartych na obrazach, takich jak wymiary komory, objętość uderzeniowa, tętno, frakcja wyrzutowa i wydajność serca. Obliczenia opierają się na geometrycznych przybliżeniach komory przy użyciu oprogramowania open source (np. ImageJ, Zembryo Analyzer). Protokół umożliwia ilościową ocenę wydajności serca przy użyciu szeroko dostępnych urządzeń, co czyni go odpowiednim dla laboratoriów o ograniczonych zasobach i wysokoprzepustowych badaniach. W tym badaniu przeanalizowano 96 larw danio pręgowanego o hpf, rejestrując bijące serce pod mikroskopem świetlnym. Kluczowe mierzone parametry serca obejmowały wymiary komory, które służyły do obliczenia objętości uderzenia i tętna, określanych przez uderzenia na minutę. Na podstawie nich wyprowadzono frakcję wyrzutową i ilość wyrzutową, aby ocenić ogólną wydajność serca. Reprezentatywne wyniki zdrowych embrionów wykazały stałe kurczenie komór i silne wskaźniki funkcjonalne, podczas gdy zarodki wystawione na kadm wykazywały upośledzoną morfologię serca i istotnie zwiększoną ilość czynności serca. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest istotna dla wykrywania rozwojowej kardiotoksyczności i zapewnia powtarzalne, nieinwazyjne podejście do oceny funkcji serca in vivo podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio (Danio rerio) stały się znaczącym modelowym organizmem kręgowców w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na swoją genetyczną homologię z ludźmi, zapłodnienie zewnętrzne, optyczną przezroczystość zarodków oraz szybki rozwój 1,2. Te cechy, w połączeniu z opłacalnością i skalowalnością, sprawiają, że danio pręgowany jest szczególnie odpowiedni do badań wczesnej morfogenezy serca, wad wrodzonych serca oraz rozwojowej kardiotoksyczności3. Ich znaczenie dodatkowo wzmacnia wysoka zachowawczość genów i szlaków sygnałowych regulujących rozwój serca u gatunkówkręgowców 4. W szczególności modele danio pręgowanego znacząco przyczyniły się do zrozumienia genetycznych i fizjologicznych podstaw formowania, przebudowywania i funkcjonowania serca zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych 5,6.

Strukturalnie serce danio dano wykonanego składa się z pojedynczego przedsionka i pojedynczej komory, połączonych liniowo, pozbawionych typowej dla ssaków czterokomorowego ssa. Mimo to serce danio majstrasowego odzwierciedla kluczowe aspekty fizjologii serca człowieka, w tym obecność warstw wsierdziowych i mięśniowych, układ przewodzenia serca, rytmiczną aktywność kurczliwą oraz regulację przez czynniki neurohormonalne 7,8. Co ważne, serce danio danio przewiduje kluczowe wydarzenia morfogenetyczne, w tym prawo-pętlę rurki serczowej oraz późniejsze rozszerzenie i wyznaczenie komór serca, przypominających te w rozwoju embrionalnym człowieka9. Ponadto serce danio manielanowanego zachowuje wiele właściwości elektrofizjologicznych i hemodynamicznych obserwowanych u wyższych kręgowców, w tym propagację potencjału czynnościowego, modulację kurczliwości oraz dynamikę cyklu wapnia7.

Biorąc pod uwagę te podobieństwa, danio danio stało się kluczowym modelem w toksykologii, zwłaszcza do oceny wpływu ekspozycji chemicznej na rozwój i funkcjonowanie serca10. Jednak jednym z głównych ograniczeń tej dziedziny pozostaje poleganie na technicznie wymagających technikach obrazowania. Konwencjonalne metody wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia konfokalna lub świetlna na arkuszu, czy linie transgeniczne wyrażające fluorescencyjne markery serca, choć są silne, są kosztowne i wymagają znacznej infrastruktury technicznej11. Te ograniczenia ograniczają szersze wdrożenie fenotypowania sercowego opartego na danio pręgowanym, szczególnie w warunkach o ograniczonych zasobach lub w zastosowaniach wymagających wysokoprzepustowego przesiewowego przesiewu12.

W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na podejścia metodologiczne umożliwiające wiarygodną ocenę funkcji serca przy użyciu szeroko dostępnych instrumentów. Istniejąca literatura zawiera przykłady takich uproszczonych metod, w tym obrazowanie oparte na jasnym polu lub mikroskopii świetlnej, połączone z pomiarami ręcznymi lub półautomatycznymi13,14. Jednak techniki te nie zawsze są standaryzowane i często różnią się między grupami badawczymi pod względem protokołu, czasu oraz parametrów analizy obrazów. Ta zmienność utrudnia powtarzalność i ogranicza wartość porównawczą w badaniach, szczególnie w dziedzinach takich jak embriotaktykologia, farmakologia czy ekotoksykologia, gdzie ilościowe punkty końcowe sercowo-naczyniowe są coraz częściej wykorzystywane jako wskaźniki bezpieczeństwa rozwojowego15.

W tym kontekście danio pręgowane stanowią cenny model do badania rozwojowej kardiotoksyczności in vivo. Agencje regulacyjne i konsorcja naukowe coraz częściej dostrzegają znaczenie danio pręgowanych w tym obszarze, zwłaszcza biorąc pod uwagę ich zdolność do wykrywania subtelnych zmian w funkcji serca, które mogą poprzedzać nieprawidłowości strukturalne lub śmiertelność14. Przezroczysty embrion umożliwia bezpośrednią wizualizację bijącego serca, umożliwiając na czas rozdzieloną, na żywo ocenę wydajności serca bez konieczności stosowania inwazyjnych zabiegów. Ponadto prostota anatomii serca danio danio młodego ułatwia ilościową identyfikację dynamiki przedsionków i komór, w tym wymiarów komory i parametrów uderzenia, przy użyciu podstawowych technik obrazowania15.

Głównym celem opisanej w tym artykule metody jest zapewnienie dostępnego, powtarzalnego podejścia do morfofunkcjonalnej oceny zarodkowej sprawności serca danio pręgowanego za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. Skupiając się na prostym akwizycji wideo i analizie obrazu post hoc, technika ta ma na celu wypełnienie metodologicznej luki między obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości a jakościowym oceną obserwacyjną. Protokół ten jest adaptowalny do różnych warunków laboratoryjnych i poziomów zasobów, a szczególnie ma zastosowanie w badaniach toksykologicznych, farmakologicznych lub genetycznych skupionych na ocenie funkcji serca.

Oprócz praktycznych zalet, protokół przyczynia się do rozwoju dziedziny, oferując skonsolidowany, krok po kroku workflow, który łączy powszechnie stosowane techniki w jednym, powtarzalnym procesie. Chociaż podobne podejścia istnieją w literaturze, niewiele z nich oferuje taki poziom integracji z dokumentacją wizualną, co może wspierać szersze wdrożenie i standaryzację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące embrionów danio pręgowanego były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami i ich stosowaniem zatwierdzonymi przez lokalną komisję etyczną. Hodowla i manipulacja zarodkami danio były wykonywane zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63/UE dotyczącą ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Utrzymanie i pobieranie zarodków danio pręgowanego

  1. Utrzymuj dorosłe danio (Danio rerio) w systemie akwarium recyrkulacyjnego w temperaturze 28 °C± 1 °C w cyklu światła i 10 godzin ciemności.
  2. Karm ryby trzy razy dziennie wysokobiałkową paszą płatkową lub granulowaną, odpowiednią dla danio dano.
  3. Późnym popołudniem przenieś dorosłe danio do zbiorników lęgowych wyposażonych w przezroczystą siatkę oddzielającą ryby od dna akwarium. Stosuj stosunek mężczyzn do kobiet 2:3, oddzielony przez noc zdejmowaną przegrodą.
  4. Następnego ranka usuń przegrodę i dodaj 50-100 ml zimnej wody akwariowej, aby wywołać tarło.
  5. Po zapłodnieniu (w ciągu 30-60 minut) usuń dorosłe ryby ze zbiornika lęgorzędnego, aby zapobiec drapieżnictwu zarodków.
  6. Zbieraj zarodki za pomocą plastikowej pipety Pasteura i przenosi je do sterylnych szalek Petriego wypełnionych podłożem embrionowym E3.
    UWAGA: Medium zarodkowe E3 to buforowany roztwór soli, który naśladuje jonowy skład płynu zewnętrznego danio pręgowanego. Przygotuj podłoże E3, rozpuszczając 580 mg NaCl, 27 mg KCl, 97 mg CaCl2,2H 2O oraz 163 mg MgCl 2,6H2O w około 800 mL ultraczystej wody destylowanej. Reguluj pH do 7,2, używając 1 N NaOH lub HCl. Gdy pH zostanie dostosowane i ustabilizowane, podnieś całkowitą objętość do 1 000 mL za pomocą wody destylowanej. Sterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr membranowy o średnicy 0,22 μm. Dodaj 100 μL 1% błękitu metylenowego na litr, aby zapobiec rozwojowi grzybów. Przechowuj przygotowany podłoże E3 w temperaturze 4 °C i podgrzej do temperatury pokojowej przed użyciem.
  7. Inkubuj zarodki w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze z kontrolowanym cyklem światła/ciemności (14 h/10h).
    UWAGA: Ogranicz liczbę zarodków na szalce Petriego (np. 50 na 100 mm), aby uniknąć przeludnienia, które może powodować niedotlenienie i wady rozwojowe.
  8. Codziennie wymieniaj E3 medium, aby utrzymać optymalne warunki rozwojowe.

2. Selekcja morfologicznie prawidłowych zarodków

  1. Około 6 godzin po zapłodnieniu (hpf; czas upływu od zapłodnienia) przenieś zapłodnione zarodki do czystej szalki Petriego zawierającej świeże medium E3.
  2. Zbadaj zarodki pod stereomikroskopem z 40-krotnym powiększeniem.
  3. Usuń wszelkie embriony wykazujące oznaki nieprawidłowości rozwojowych, w tym:
    1. Zarodki skrzępnięte: Rozpoznają się po nieprzezroczystym lub białym wyglądzie, ziarnistej strukturze oraz braku wyraźnych struktur wewnętrznych. Krzepnięcie jest oznaką nieprzeżywalności i zazwyczaj następuje w ciągu pierwszych kilku godzin po zapłodnieniu.
    2. Opóźniony rozwój: Wyklucz zarodki, które nie osiągnęły oczekiwanego etapu morfologicznego (np. brak epibolii lub nieregularne ułożenie komórkowe), co sugeruje zaburzenia żywotności.
    3. Nieprawidłowości w worku żółtkowym: Szukaj pękniętych, nieregularnych lub asymetrycznych woreczków żółtkowych, które mogą wskazywać na wadliwy rozwój lub zaburzenia równowagi osmotycznej.
    4. Zewnętrzne wady: Wyklucz zarodki z skręconymi osiami ciała, nieregularnym rozmieszczeniem masy komórkowej lub nieprawidłowym kształtem chorionu.
    5. Niska integralność kosmetyczki: Powstrzymaj się od używania zarodków z zapadłymi, pomarszczonymi lub pękniętymi chorionami, ponieważ mogą one być narażone na stres mechaniczny lub osmotyczny.
  4. Zachowuj tylko zarodki spełniające wszystkie następujące kryteria: (1) Przezroczysty i symetryczny kształt ciała, (2) Jednolity progresja epibolii z gładkim warstwowaniem komórek, (3) Wyraźnie widoczny blastoderm i nienaruszony sferyczny chorion.
    UWAGA: Przy 6 hpf morfologicznie prawidłowy zarodek danio pręgowanego ma kształt kopuły, z wyraźnie zarysowaną blastodermą otaczającą wierzch żółtka. Cytoplazma powinna być równomiernie rozłożona, bez ziarnistego plamkowania i bez oznak fragmentacji czy zlepiania.

3. Obrazowanie serca z użyciem mikroskopii świetlnej

  1. Przy mocy 96 hpf można zamontować zarodki indywidualnie w szalkach Petriego o przeszklonym dnie o średnicy 35 mm, wypełnionych medium E3.
  2. Przygotuj agarozę o niskiej temperaturze topnienia o 1,2% w medium E3 i rozgrzej do 37-38 °C. Utrzymuj temperaturę za pomocą bloku grzewczego lub kąpieli wodnej.
  3. Osadz każdy zarodek w agarozie i delikatnie ukierunkuj ją bocznie za pomocą cienkich kleszczy, zanim agaroza stwardnieje.
    UWAGA: Upewnij się, że serce jest wyraźnie widoczne i skierowane na bok, z przedsionkiem i komorą w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
  4. Użyj mikroskopu odwróconego światła wyposażonego w aparat cyfrowy, aby nagrywać filmy o wysokiej rozdzielczości 30-tych, skupione szczególnie na obszarze sercowym zarodków danio pręgowanego. Nagrywaj filmy z powiększeniem 40× lub 100×, aby zapewnić wyraźną wizualizację struktur serca i bicia serca.
    1. Nagrywaj filmy z częstotliwością 30 klatek na sekundę (fps) w formatach nieskompresowanych lub minimalnie skompresowanych (np. AVI lub MOV), aby zachować jakość obrazu i umożliwić dokładną analizę dynamiki ruchu serca. Takie rozwiązanie umożliwia szczegółową ocenę parametrów funkcjonalnych, takich jak tętno, rytm skurczy i morfologia komory.

4. Analiza obrazów i pomiar funkcji serca

  1. Pomiary ręczne w ImageJ
    1. Importuj filmy. Otwieraj filmy w ImageJ używając pliku > import > AVI. Jeśli trzeba, przekonwertuj wideo na stos obrazów za pomocą stosów > obrazów > konwertować obrazy na stos.
    2. Skalibruj skalę pomiarową. Użyj Analizuj > Ustaw Skalę, wprowadź znaną średnicę pola (np. 4 mm dla obiektywu 10×) i włącz opcję Global, aby zastosować skalę we wszystkich pomiarach.
    3. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI). Użyj narzędzi ROI (linia, wielokąt, prostokąt) do oznaczania osi długiej i krótkiej komory podczas systoli końcowej i rozgorowej (Rysunek 1). Zarządzaj zwrotem z inwestycji za pomocą narzędzi Analyze > > Revenue Manager.
  2. Zmierz średnice i powierzchnie do obliczania parametrów funkcjonalnych (Plik uzupełniający 1)
    1. Określ powierzchnię komory (używając przybliżenia elipsy) za pomocą równania 1:
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      Gdzie DL = długa średnica, DS = krótka średnica.
    2. Oszacuj objętość komory w ED i ES za pomocą wzoru na objętość elipsoidalną (Równanie 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
    3. Oblicz ułamkową zmianę powierzchni (FAC) i ułamkowe skrócenie (FS) za pomocą równania 3 i równania 4:
      FAC (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      gdzie VAD = powierzchnia komory w ED; VAS = powierzchnia komory w ES; DDL = oś długa w ED; DSS = krótka oś w ES.
    4. Określ objętość skoku (SV) za pomocą równania 5:
      SV = VVD - VVS (5)
    5. Oblicz frakcję wyrzutową (EF) za pomocą równania 6:
      EF (%) = (SV / VVD) × 100 (6)
  3. Automatyczna analiza w ZembryoAnalyzer
    1. Uruchom i załaduj nagrane wideo. Otwórz ZembryoAnalyzer (dostępny pod adresem: https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser) i użyj File > Open Video , aby zaimportować pożądany film.
    2. Wykonaj automatyczne wykrywanie regionu serca. Kliknij przycisk Detect Heart , aby oprogramowanie automatycznie lokalizowało obszar zainteresowania (ROI) na podstawie wahań jasności w klatkach wideo. W razie potrzeby dostosuj zwrot z inwestycji ręcznie, używając narzędzi prostokątnych, elipsowych lub wielokątnych.
    3. Wykonaj automatyczne oszacowanie tętna. Pozwól oprogramowaniu analizować zmiany jasności w obrębie wykrytego ROI. Tętno oblicza się poprzez identyfikację okresowych szczytów intensywności. Algorytm stosuje filtrowanie progowe, aby usunąć szum i fałszywe alarmy, zapewniając dokładne wykrywanie bitów.
    4. Eksportuj wyniki. Eksportuj dane o tętnie i odpowiadające im wykresy intensywności, używając Eksportuj > PDF lub Eksportuj > Excel. Opcjonalnie zapisz surowe dane w formacie CSV lub JSON do dalszego przetwarzania statystycznego.
  4. Oblicz przepływ serca (CO) za pomocą równania 7:
    CO = SV × HR (7)

5. Ocena zastosowania protokołu w testach kardiotoksyczności z użyciem toksynów

  1. Zważ chlorek kadmu i przygotuj roztwór roboczy, rozpuszczając go bezpośrednio w ośrodku E3 do końcowego stężenia 3 mg/L.
  2. Przenieś zarodki do szalek Petriego zawierających roztwór kadmowy 24 godziny po zapłodnieniu (HPF).
  3. Inkubuj zarodki w roztworze kadmowym do 96 hpf w temperaturze 28 °C± 1 °C w cyklu światła i 10 godzin ciemności.
  4. Wymieniaj roztwór kadmowy codziennie, aby utrzymać stałą ekspozycję.
  5. Przy 96 hpf nagrywać wysokorozdzielcze filmy kardiologiczne, jak wcześniej opisano, zarodków do późniejszego pomiaru i analizy parametrów funkcji serca.
    UWAGA: Stosuj ten protokół ekspozycji na kadm do symulacji rozwojowej toksyczności serca w zarodkach danio pręgowanych, jak opisano w poprzednim badaniu16.

6. Zarządzanie danymi i replikacje

  1. Zapisuj wszystkie pomiary w uporządkowanych arkuszach kalkulacyjnych. Uwzględnij identyfikację zarodka, grupę leczenia oraz wszystkie obliczone parametry.
  2. Upewnij się, że co najmniej 20-30 zarodków w każdej grupie zostanie przeanalizowanych pod kątem wiarygodności statystycznej.
    UWAGA: Nagrania wideo regionu serca mogą być przechowywane i analizowane w późniejszym momencie bez naruszania dokładności pomiarów morfometrycznych czy funkcjonalnych. W naszych wewnętrznych porównaniach wyniki analiz natychmiastowych i opóźnionych były spójne dla parametrów kluczowych sercowych, co wspierało powtarzalność opóźnionej oceny opartej na wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten umożliwia ilościową analizę rozwoju serca danio pręgowanego po 96 godzinach po zapłodnieniu (HPF), uwzględniając parametry strukturalne i funkcjonalne, takie jak rozmiar komory, kurczliwość, objętość uderzeniowa oraz frakcja wyrzutowa.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy jasnego pola komory danio dano w stanie rozgrzania (ED) i systoli końcowej (ES), wraz z odpowiadającymi wykresami słupkowymi pokazującymi średnie pomiary powierzchni komory (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z ważnych etapów tego protokołu jest dokładna identyfikacja i selekcja morfologicznie prawidłowych zarodków po 6 godzinach po zapłodnieniu (HPF). Zarodki wykazujące oznaki krzepnięcia, opóźnień rozwojowych lub nieprawidłowości strukturalnych mogą znacząco zaburzyć spójność i interpretowalność pomiarów układu sercowo-naczyniowego. Wczesne usunięcie nieprzeżywalnych lub zdeformowanych zarodków zapewnia wiarygodny punkt odniesienia do oceny rozwoju i funkcji serca. Prawidłowa orientacja zarodków podczas obrazowania, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały sfinansowane przez Ministerstwo Nauki, Rozwoju Technologicznego i Innowacji Republiki Serbii, na mocy umowy instytucjonalnej z Uniwersytetem w Belgradzie, Wydziałem Medycyny, na realizację i finansowanie działalności badawczej w 2025 roku. Numer rejestracji umowy dotyczącej finansowania instytucjonalnego w 2025 roku to 451-03-137/2025-03/200110. Uprzejmie prosimy, aby ten numer został uwzględniony w podziękowaniach wszystkich publikacji powstałych w ramach zatwierdzonych podprojektów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 & mikro; m Filtr membranowyMilliporeSLGP033RS0,22 & mikro; m Filtr membranowy
1 N HCl rozwiązanieSigma-Aldrich320331Roztwór kwasu solnego do regulacji pH
Rozwiązanie 1 N NaOHSigma-Aldrich72068Roztwór wodorotlenku sodu do regulacji pH
Dorosły danio danio (Danio rerio)Lokalny ośrodek hodowlanyNie maOrganizm modelowy
Zbiorniki hodowlane z siatką//Rozdzielanie dorosłych osobników na tarło
CaCl?· 2H? OSigma-AldrichC5670Chlorek wapnia dwuodkładowy, odczynnikowy
Chlorek kadmuSigma-Aldrich202908Toksyczny środek stosowany do ekspozycji na 3 mg/L
Komercyjna pasza dla danio danychMini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac/Wysokobiałkowa pasza płatkowa lub granulowana odpowiednia dla danio pręgowanego
Aparat cyfrowy (mikroskop)Fotonika HamamatsuORCA-Flash4.0 V3Kamera do nagrywania wideo przy 30 fps
Blok grzewczyEppendorf5382000010Urządzenie ogrzewane z kontrolowaną temperaturą
Oprogramowanie ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/Oprogramowanie do przetwarzania obrazów open-source
Mikroskop światła odwróconegoNikonTi2-EMikroskop z aparatem cyfrowym, 40 razy; oraz 100&; Cele
KClSigma-AldrichP3911Chlorek potasu, odczynnik
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia (1,2%)Thermo Fisher Scientific16520050Do osadzania zarodków
Błękit metylenowy (1%)Sigma-AldrichM9140Środek przeciwgrzybiczy dodany do medium E3
MgCl?· 6H? OSigma-AldrichM9272Heksahydrat chlorku magnezu, odczynnikowy
NaClSigma-AldrichS9888Chlorek sodu, odczynnik
Sterylne szalki Petriego (100 mm)Corning430167Plastikowe szalki Petriego do hodowli zarodków
Sterylne szalki Petriego (35 mm)MatTek CorporationP35G-1.5-14-CSzklarze Petriego z szklanym dnem do montowania zarodków
Ultraczysta woda destylowanaMilliporeOdniesienie do Milli-QWoda do przygotowania roztworu
Oprogramowanie ZembryoAnalyzerGitHub (Darko Puflovic)https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyserOprogramowanie do analizy funkcji serca

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat RevDrug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  2. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14129(2023).
  3. Narumanchi, S., et al. Zebrafish heart failure models. Front Cell Dev Biol. 9, 662583(2021).
  4. Clément, Y., Torbey, P., Gilardi-Hebenstreit, P., Crollius, H. R. Enhancer-gene maps in the human and zebrafish genomes using evolutionary linkage conservation. Nucleic Acids Res. 48 (5), 2357-2371 (2020).
  5. Kemmler, C. L., Riemslagh, F. W., Moran, H. R., Mosimann, C. From stripes to a beating heart: Early cardiac development in zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 8 (2), 17(2021).
  6. Bowley, G., et al. Zebrafish as a tractable model of human cardiovascular disease. Br J Pharmacol. 179 (5), 900-917 (2022).
  7. Echeazarra, L., Hortigón-Vinagre, M. P., Casis, O., Gallego, M. Adult and developing zebrafish as suitable models for cardiac electrophysiology and pathology in research and industry. Front. Physiol. 11, 607860(2021).
  8. Foo, Y. Y., et al. Effects of extended pharmacological disruption of zebrafish embryonic heart biomechanical environment on cardiac function, morphology, and gene expression. Dev Dyn. 250 (12), 1759-1777 (2021).
  9. M Männer, J. The functional significance of cardiac looping: comparative embryology, anatomy, and physiology of the looped design of vertebrate hearts. J Cardiovasc Dev Dis. 11 (8), 252(2024).
  10. Park, H., Yun, B. H., Lim, W., Song, G. Dinitramine induces cardiotoxicity and morphological alterations on zebrafish embryo development. AquatToxicol. 240, 105982(2021).
  11. Schlaeppi, A., Graves, A., Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy of fast cardiac dynamics in zebrafish embryos. J Vis Exp. 174, e62741(2021).
  12. Motta, E. R. Development of microscopy strategies for rapid imaging of zebrafish heart development. Doctoral dissertation. , Université de Strasbourg. https://theses.fr/2020STRAJ043 (2020).
  13. Spomer, W., Pfriem, A., Alshut, R., Just, S., Pylatiuk, C. High-throughput screening of zebrafish embryos using automated heart detection and imaging. J Lab Autom. 17 (6), 435-442 (2012).
  14. Santoso, F., et al. An overview of methods for cardiac rhythm detection in zebrafish. Biomed. 8 (9), 329(2020).
  15. Teixidó, E., et al. Automated morphological feature assessment for zebrafish embryo developmental toxicity screens. Toxicol Sci. 167 (2), 438-449 (2019).
  16. Mitovic, N., et al. Cadmium significantly changes major morphometrical points and cardiovascular functional parameters during early development of zebrafish. Environ Toxicol. Pharmacol. 87, 103723(2021).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Spomer, W., Pfriem, A., Alshut, R., Just, S., Pylatiuk, C. High-throughput screening of zebrafish embryos using automated heart detection and imaging. J Lab Autom. 17 (6), 435-442 (2012).
  19. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Front Physiol. 5, 344(2014).
  20. Liebling, M., et al. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos viapostacquisition synchronization of nongated slice sequences. J Biomed Opt. 10 (5), 054001(2005).
  21. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  22. Sargazi, S., et al. Fluorescent-based nanosensors for selective detection of a wide range of biological macromolecules: A comprehensive review. Int J Biol Macromol. 206, 115-147 (2022).
  23. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  24. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  25. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  26. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68941

Tagi

Zebrafish Cardiac ImagingCardiac Function AnalysisBrightfield MicroscopyVideo AnalysisVentricular DimensionsStroke VolumeHeart RateEjection FractionCardiac OutputEmbryonic Cardiotoxicity

Powiązane artykuły