Badania biodegradacji tlenowej materiałów z użyciem naturalnego inokulum morskiego i zamkniętego respirometru

Podsumowanie

Protokół opisuje standardową procedurę operacyjną testowania potencjalnie biodegradowalnych materiałów zarówno syntetycznych, jak i naturalnych, w warunkach aerobowych, z użyciem naturalnego inokulum wody morskiej oraz zautomatyzowanego systemu zamkniętej respirometrii.

Streszczenie

Właściwa ocena materiałów biodegradowalnych zależy od szerokiego zastosowania standardowych metod testowania. Chociaż takie metody istnieją, zdolności testowe pozostają ograniczone, ograniczone kosztami oraz czasem uruchomienia nowych laboratoriów. Ten zmodyfikowany protokół przesiewowy opiera się na normie ASTM International D6691-24a, Standardowej Metodzie Testowania Tlenowej Biodegradacji Materiałów Plastikowych w środowisku morskim przez zdefiniowane konsorcjum mikroorganizmów lub naturalne inokulum wody morskiej. Ocenia biodegradację materiałów w środowisku morskim, porównując wyniki z pozytywnymi i negatywnymi kontrolami, oraz wykorzystuje naturalne inokulum wody morskiej wzbogacone amonem i fosforanem, aby zapobiec ograniczeniom składników odżywczych. Materiały są wystawione na działanie tej bogatej w składniki odżywcze wody morskiej i inkubowane w temperaturze 30 °C. Respirometr Micro-Oxymax mierzy produkcję biogazu (dwutlenku węgla,_CO2) w czasie. Stopień mineralizacji (biodegradacji) określa się poprzez obliczenie proporcji węgla pochodzącego z materiału przekształconego w biogaz-węgiel. Procent produkcji_CO2 , wyrażony jako ułamek zmierzonej lub teoretycznej zawartości węgla, jest podawany jako funkcja czasu. System respirometrii zamkniętej pętli obsługuje różne zbiorniki reaktorowe, przygotowane w trzech kopiach dla każdego materiału: kontrolę ujemną (tylko inokulum wody morskiej) oraz kontrolę dodatnią (chromatografia cienkowarstwowa celuloza). Ta metoda jest ważna do oceny materiałów w środowisku morskim i pomaga zapobiegać globalnemu zanieczyszczeniu.

Wprowadzenie

Odpady plastikowe stanowią zagrożenie dla ekosystemów morskich i zdrowia ludzi¹. Rosnące obawy dotyczące zanieczyszczenia plastikiem, wraz z morskimi odpadami pochodzącymi z jakichkolwiek materiałów z oceanu, podkreślają potrzebę zrównoważonych rozwiązań, takich jak ulepszona gospodarka odpadami na końcu życia oraz materiały biodegradowalne, które łatwo ulegają biodegradacji w środowisku morskim. W przeciwieństwie do tradycyjnych syntetycznych tworzyw sztucznych, które utrzymują się przez dziesięciolecia do wieków i generują mikroplastiki gromadzące się w sieciach pokarmowych ^2,3,4, materiały biodegradowalne, czyli organiczne składniki węgla, mogą być metabolizowane do_CO2 i metanu (CH₄) lub asymilowane do biomasy mikrobiologicznej⁵. Zrozumienie biodegradacji materiałów w wodzie morskiej jest zatem kluczowe dla ilościowego określenia i łagodzenia wpływu odpadów morskich na środowisko.

Biodegradacja w środowisku morskim jest kontrolowana przez interakcję zmiennych przestrzenno-czasowych, w tym dostępności światła i składników odżywczych, ciśnienia, temperatury, składu gatunków mikroorganizmów oraz fizykochemicznej natury i struktury polimeru, które wszystkie decydują o tempie, stopniu i mechanizmie rozkładu⁶. Te zmienne stanowią poważne wyzwanie dla laboratoryjnych badań biodegradacji symulujących środowiska morskie. Ta standardowa procedura operacyjna (SOP) wykorzystuje naturalną wodę morską jako inokulum, rejestrując obecną społeczność mikroorganizmów in situ oraz rejestruje istotne zmienne, takie jak rozpuszczone w wodzie morskiej substancje odżywcze, cząstki węgla i azotu, chlorofil, zasolenie, pH oraz temperaturę. To kontrolowane, laboratoryjne podejście optymalizuje warunki sprzyjające mineralizacji i umożliwia bezpośrednie pomiary biodegradacji, które nie są możliwe in situ. ASTM International D6691-24a, Standardowa metoda testowania do określania tlenowej biodegradacji materiałów tworzyw sztucznych w środowisku morskim przez zdefiniowane konsorcjum mikrobiologiczne lub naturalne inokulum wody morskiej (dalej ASTM D6691), oraz ten SOP zostały opracowane jako szybkie i niezawodne narzędzie przesiewowe do oceny biodegradowalności materiałów 7,8,9,10.

Zgodnie z normą ASTM D6691, testem przesiewowym dotyczącym biodegradowalności polimerów, protokół ten ocenia biodegradację materiałów w optymalnych warunkach, 30 °C, maksymalną powierzchnię z mielonej próbki oraz nadmiar składników odżywczych nieorganicznych (azot, 130 mg/L; fosfor, 23 mg/L)⁹, aby wspierać mineralizację i zapobiegać ograniczeniom składników odżywczych. Chociaż testy przesiewowe dostarczają cennych wstępnych informacji, dalsze badania, takie jak cumowania przybrzeżne i głębinowe, które mierzą utratę masy ciała w funkcji czasu, mogą być konieczne do kompleksowej oceny w naturalnych warunkach morskich. Ponieważ te testy cumowania przybrzeżnego i głębinowego szacują biodegradację na podstawie utraty masy ciała w funkcji^{czasu 10,11}, naukowcy powinni najpierw przeprowadzić ten test przesiewowy, który bezpośrednio mierzy metabolizm mikroorganizmów, zanim przystąpią do eksperymentu in situ z cumowaniem przybrzeżnym i głębinowym morzem, który jest również droższy.

Standardowa metoda testowa ASTM D6691 określa procedury oceny biodegradacji tlenowej nieunoszących się tworzyw sztucznych w środowiskach morskich. Ta norma, wraz ze standardami specyfikacji, takimi jak ASTM D7081 (Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment; koncentrująca się na biodegradowalności w ośrodku wodnym, obecnie wycofana z ASTM i ponownie zakwalifikowana), stanowi ramy do certyfikacji polimerów eksperymentalnych jako morskich biodegradowalnych ^9,12. Ogólnie rzecz biorąc, specyfikacja to konsensusowy standard ASTM International, który określa wymagania, które materiał, produkt lub system musi spełniać. Zapewnia, że materiały zaprojektowane do biodegradacji w środowiskach morskich robią to w akceptowalnych terminach i nie uwalniają potencjalnie toksycznych dodatków, takich jak barwniki czy plastyfikatory.

Opierając się na ASTM D6691, protokół ten określa szybkość i stopień biodegradacji tlenowej materiałów (eksperymentalne podłoże) w naturalnej wodzie morskiej i rozszerza pozytywne kontrole materiałów (np. celuloza, papier Kraft, chityna/chitosan), które historycznie wykazują biodegradowalność w środowisku morskim ^7,9,10. Celem tej metody jest przesiewanie materiałów w optymalnych warunkach, aby sprawdzić, czy materiały ulegają biodegradacji w środowisku morskim. Inokulum wykorzystuje naturalną społeczność mikroorganizmów obecną w wodzie morskiej, zbieraną zgodnie ze szczególnymi wytycznymi zawartymi w ASTM. Wytyczne te podkreślają wykorzystanie wody morskiej o zasoleniu około 32, zbieranej z miejsca wolnego od zanieczyszczeń, takich jak ścieki, zrzuty chemiczne czy wycieki ropy. Test wykorzystuje zautomatyzowany respirometr zamkniętej pętli z naczyniami reaktorowymi o pojemności 250 mL utrzymywanymi w temperaturze 30 °C, z których każdy zawiera 75 mL wody morskiej i ~20 mg eksperymentalnego lub kontrolnego substratu⁸. Mineralizacja (biodegradacja) wyraża się jako procent netto wyprodukowanego biogazu węglowego (CO_2-C) w stosunku do początkowej masy dodanego węgla. Ta metoda nie uwzględnia asymilacji węgla do biomasy mikroorganizmów.

Protokół

1. Zbieranie i charakterystyka wody morskiej

1. Zidentyfikuj miejsce zbierania wody morskiej nienaruszone przez ścieki, chemikalia, plamy ropy ani silny wpływ słodkiej wody.
2. Na miejscu zbioru można zarejestrować źródło (lokalizacja, szerokość i długość geograficzna, głębokość zbioru, całkowita głębokość i temperatura), data pobrania próbki oraz obserwowane warunki wodne.
3. Zbieraj i łącz próbki wody morskiej z różnych głębokości, lokalizacji oraz z różnych miejsc pobierania próbek, aby promować zróżnicowany skład społeczności mikroorganizmów.
4. W balonie wyługowanym kwasem 20 L zbierać od 10 L do 20 L wody morskiej za pomocą dużej butelki Niskin i transportować z powrotem do laboratorium.
5. Z balony przelej 1 L całej podpróbki wody morskiej do butelki z bursztynowym polietylenem o wysokiej gęstości (HDPE) wyługowanej kwasem 1 litrem do analizy laboratoryjnej cząstek węgla i azotu w początkowych warunkach morskich. Z próbki 1 L przefiltruj (0,2 μm; niskoazotowy celulozowy octan) i pobierz podpróbkę 60 mL w butelce z polietylenu ługowanej kwasem do analizy rozpuszczonych składników azotu nieorganicznego i organicznego (N) oraz fosforu (P).
6. Oznacz podpróbki nazwą projektu, identyfikatorem próbki i datą. Zmierz stężenia NH₄⁺ metodą indofenolową (4500-NH3)^13,14 oraz poziomy ^3- PO₄ metodą pojedynczego roztworu (4500-P E)^13,15. Ilościowo określić cząstki azotu i węgla metodą analizy pierwiastkowej¹⁶. Zmierz stężenia chlorofilu-a zgodnie z protokołami określonymi przez Parsons i ^in.17(10150 A, 10150 C)¹³.
   UWAGA: Analizy jakości wody związane z składnikami odżywczymi są opcjonalne. Protokół ten zakłada, że analizy przeprowadza się w laboratorium zewnętrznym.
7. Luźno przykryj otwór balony, aby utrzymać warunki tlenowe i przechowywać wodę morską w temperaturze 30 °C w ciemności do 7 dni.
   UWAGA: Woda morska może być również napowietrzana za pomocą pompy powietrznej i systemu bąbelkowania.

2. Przygotowanie podłoża eksperymentalnego

1. Dodaj 10-15 g eksperymentalnego podłoża (np. naturalnych polisacharydów, drewna, płyty włóknistej, polimerów), które mogą mieć formę pelletów, fragmentów i formowanych kawałków, do słoika do frezowania stali nierdzewnej o pojemności 50 mL z kulą stalową o średnicy 20 mm. Przed rozpoczęciem testu zmielić podłoże eksperymentalne do jednolitego rozmiaru cząstek (0,10-0,25 mm).
2. Zanurz słoik do mielenia w ciekłym azocie i trzymaj kruchy przez 15 minut, aż ciekły azot przestanie wrzeć.
   UWAGA: Ciekły azot to kriogeniczna ciecz, która może powodować oparzenia, urazy lub odmrożenia. Przeczytaj i przestrzegaj wszystkich kart bezpieczeństwa przed użyciem. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego.
3. Zabezpiecz słoik do frezowania w zaczepce do młyna kulowego, ustaw parametry instrumentu na 30 Hz i 2:30 min, po czym naciśnij Start. Powtórz 4 razy, z 30 sekundami chłodzenia w ciekłym azocie między próbami. Jeśli materiał jest polimerem o niskiej temperaturze przejścia szkła, wykonuj dodatkowe cykle mielenia w razie potrzeby, aby uzyskać równomierny rozkład wielkości cząstek.
4. Zweryfikować jednorodność rozmiarów i scharakteryzować rozkład rozmiarów cząstek za pomocą analizy sitowej, zgodnie z normą ASTM D1921-96¹⁸. Złóż standardowe sita obejmujące oczekiwany zakres rozmiarów cząstek, z najmniejszym rozmiarem siatki na dole. Umieść zmieloną próbkę na górnym sicie i zabezpiecz stos sita w mechanicznej shakerze. Mieszaj, aż cząstki przejdą przez siatkę. Zbierz i zważ zachowany materiał z każdego sita, aby obliczyć rozkład wielkości cząstek. Używaj tego samego zestawu sitek w różnych metodach leczenia, aby zachować porównawczość. Zanotuj dystrybucję na arkuszu danych.
5. Określ zawartość węgla na podpróbkę suchą masy mielonego podłoża eksperymentalnego za pomocą analizy pierwiastkowej¹⁶.
   UWAGA: Protokół ten zakłada, że analiza pierwiastkowa jest przeprowadzana w laboratorium zewnętrznym.

3. Przygotowanie dodatkowych składników odżywczych do wody morskiej

1. Napełnij kolbę wolumetryczną o pojemności 2 lub 4 litry wodą morską do połowy. Całkowita objętość potrzebna zależy od liczby zbiorników reaktorowych przeznaczonych do eksperymentu. Każdy zbiornik reaktora będzie zawierał 75 mL wody morskiej. Jeśli źródło wody morskiej zawiera wysokie stężenie cząstek organicznych, przesiej wodę morską przez siatkę o średnicy 20 μm, aby wyeliminować niejednorodne zanieczyszczenia przez duże cząstki.
2. Używając precyzyjnej wagi o czułości do 0,001 g, przygotuj wagę i odważ 0,5 g/l chlorku amonu (NH₄Cl), a następnie 0,1 g/l fosforanu potasu monozasadowego (KH₂PO₄) na podstawie 2 L lub 4 L wody morskiej.
   UWAGA: Chlorek amonu może powodować uszkodzenia lub podrażnienia oczu. Przeczytaj i przestrzegaj wszystkich kart bezpieczeństwa przed użyciem oraz załóż odpowiednie środki ochrony osobistej.
   UWAGA: Utylizacja chlorku amonu i fosforanu potasu jednozasadowych odpadów w dedykowanych pojemnikach na odpady niebezpieczne zgodnie z procedurami instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami. Niewielkie ilości rozcieńczonych 4Cl i KH₂PO₄ mogą kwalifikować się do utylizacji po rozcieńczeniu obfitą wodą, jeśli instytucja i lokalne władze oczyszczające kanalizację na to pozwolą.
3. Dodaj nieorganiczne składniki odżywcze do kolby objętościowej 2 lub 4 L, dostosuj do odpowiedniej objętości wodą morską, dodaj baton mieszankowy i mieszaj na tacyce, aż wszystkie sole się rozpuszczą. Rozwiązanie powinno być przezroczyste, bez widocznych cząstek stałych.
4. Podpróbka 20-30 ml wody morskiej uzupełnionej składnikami odżywczymi do pomiaru pH i zasolenia. Przefiltruj dodatkowe 60 mL przez 0,2 μm niskoazotowy celulozowy filtr do butelki z polietylenu ługowanej kwasem do analizy rozpuszczonych nieorganicznych azotów i p, zgodnie ze standardowymi metodami z kroku 1.5.
5. Mierz pH i zasolenie na stole, zgodnie z instrukcjami producenta. Dla pełnomocnej wody morskiej spodziewany jest spadek pH o około jednej jednostki ze względu na kwasowość suplementu.

4. Przygotowanie do inkubacji zbiornika reaktora

1. Wymywaj wszystkie szkła kwasowe, w tym naczynia reaktorowe o pojemności 250 mL na próbki oraz pipetę objętościową 75 mL w kwasie solnym 10% (HCl) przez 24 godziny, a następnie płukaj 3 razy wodą dejonizowaną.
   UWAGA: HCl może powodować poważne oparzenia i uszkodzenia oczu. Przeczytaj i przestrzegaj wszystkich kart bezpieczeństwa przed użyciem. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego.
   UWAGA: 10% odpadów HCl można zneutralizować wodorowęglanem sodu, tworząc roztwór neutralny przed utylizacją. Przeprowadz neutralizację zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych oraz obowiązującymi lokalnymi przepisami.
2. Autoklawowanie pustych zbiorników reaktora o pojemności 250 mL kwasem, pokrywek z portami, silikonowych uszczelek O-ringów i nakrętek w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut przed dniem eksperymentu.
3. Oznacz fiolki z próbkami numerem/ID kanału odpowiadającym naczyniom otrzymującym próbki lub materiały kontrolne.
4. Używając wagi analitycznej, staruj fiolkę (z kapslem) i odważ 20 mg (± 0,1 mg) eksperymentalnego lub kontrolnego, zapisuj pełną wagę odczytu i odłóż na bok. Powtarzam to dla wszystkich eksperymentalnych i kontrolnych replik.
   UWAGA: Upewnij się, że wagi są dokładne. Zaleca się ważenie wszystkich podłoży tego samego dnia i przez tę samą osobę.
5. Włącz inkubator dzień przed dodaniem zbiorników i ustaw temperaturę na 30 °C. Włącz respirometr co najmniej 2 godziny przed przeprowadzeniem diagnostyki systemu i kalibracji czujnika zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Przygotowanie zbiornika reaktora może być kontynuowane, gdy temperatura inkubatora osiągnie i utrzymuje się na poziomie 30 ± 2 °C.
6. Przygotuj kartę danych, zapisując identyfikatory próbek/repliki oraz odpowiadający im numer kanału. Uporządkuj naczynia reaktora i zespoły pokrywek (pokrywa z portami/O-ring) według numeru kanału/ID (upewnij się, że każdy zbiornik jest wyraźnie oznaczony). Sprawdź o-ringi oraz pokrywki/porty, aby upewnić się, że są czyste, suche i nienaruszone.

5. Ustawianie zbiorników reaktorowych

1. Użyj kwaśnie ługowanej pipety wolumetrycznej o pojemności 75 mL oraz zmotoryzowanego regulatora pipet, aby podać 75 ml wody morskiej z dodatkiem odżywczym do każdego zbiornika reaktora.
2. Wyjmij jedną jednorazową pipetę wody morskiej (~3 mL) z każdego naczynia i odłóż ją na czystej powierzchni obok niej. Ta woda morska zostanie użyta do płukania zmielonych podłoży eksperymentalnych i kontrolnych z fiolki z tarem (Rysunek 1).
3. Przenieś podłoża do odpowiednich naczyń.
4. Umieść uszczelkę O na krawędzi zbiornika reaktora, a następnie załóż pokrywę z dwoma otworami bezpośrednio na uszczelkę O. Zabezpiecz uszczelkę O-ring i pokrywę za pomocą nakrętki.
5. Dopasuj zbiornik reaktora do odpowiadających mu linii gazowych/kondensacyjnych. Mocno włóż przewody gazowe do odpowiednich portów wlotowych/wylotowych w pokrywie naczynia.
6. Włącz platformę shaker na 0,05 x g (tryb ciągły). Przeprowadz wizualną kontrolę, aby upewnić się, że wszystkie naczynia są zabezpieczone, a następnie zamknij drzwi inkubatora.
7. Rejestruj temperaturę inkubatora (odczyt i sondę termistoru) oraz ciśnienie atmosferyczne za pomocą barometru.

Rysunek 1: Ustawienie i przygotowanie naczynia. (A) dodanie wody morskiej, (B) dodanie próbki oraz (C) dodanie uszczelki O, metalowej pokrywki i nakrętki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

6. Rozpoczęcie systemu respirometrycznego

1. Uruchom oprogramowanie na podłączonym komputerze. Sprawdź, czy system wykrywa sprzęt przez połączenie RS-232. Jeśli sprzęt nie zostanie znaleziony, powiadomienie poinformuje, że urządzenie nie jest podłączone i program musi zostać ponownie uruchomiony.
2. W głównym menu oprogramowania wybierz Narzędzia > Diagnostyka > Podstawowe operacje. Kliknij Zapisz plik loga. Kliknij zawory i czujniki. Oprogramowanie wskaże PASS lub FAIL dla każdego testu. Przechodzić do dwupunktowej kalibracji czujnika_CO2 tylko wtedy, gdy oba testy przejdą pozytywnie.

7. Kalibracja czujnika_CO2

1. Podłącz kolumnę wapna sodowego do portu azotowego na tylnym panelu pompy próbki, aby usunąć OTCO₂ i zerową kalibrację. Upewnij się, że limonka soda wygląda na kredowobiałą, a nie przebarwioną (np. różową lub fioletową).
2. Wybierz narzędzia > kalibrację. Kliknij Start Calibration w prawym dolnym rogu. Na żądanie dostosuj przepływ próbki do 0,5 L/min za pomocą sterowania pompą próbkową na przednim panelu. Kliknij OK.
3. Gdy timer osiągnie zero, naciśnij przyciski przesunięcia w górę i w dół na czujniku CO₂ , aby ustawić odczyt na ekranie do 0,000 (lub jak najbliżej możliwego). Wartości zmieniają się na zielone, gdy mieszczą się w akceptowalnym zakresie. Kliknij Następny gaz.
4. Na żądanie podłącz butlę kalibracyjną do portu kalibracyjnego na tylnym panelu pompy próbki. Dostosuj ciśnienie gazu kalibracyjnego na wylotzie do 5 PSIG. Upewnij się, że nadmiar gazu przepływa przez złączkę T, dzięki czemu użytkownik może usłyszeć i wyczuć gaz w pobliżu złącza, zanim klikniesz OK.
5. Gdy timer osiągnie zero, naciśnij przyciski Up i Down na czujniku CO₂ , aby dostosować odczyt na ekranie do 2,700 (lub jak najbliżej możliwości). Wartości zmieniają się na zielone, gdy mieszczą się w akceptowalnym zakresie. Kliknij Następny gaz , aby zakończyć kalibrację.
   UWAGA: Stężenia gazów rozpiętych są określane przez certyfikowaną mieszankę gazów pierwotnych standardowych, zgodnie z dokumentacją w certyfikacie analizy dostawcy.

8. Konfiguracja eksperymentu w oprogramowaniu

1. Wybierz Eksperyment > Konfiguracja. Wpisz numery kanałów startowych i końcowych z menu rozwijanych na podstawie zajętych kanałów.
   1. Ustaw próg odświeżania (%) na 0,50, interwał odświeżania na N.A., a okno odświeżania (sek) na auto.
   2. W sekcji Różne ustawienia zaznacz pole dla czujników oczyszczania; upewnij się, że nie są wybrane automatyczne pomiary objętości, dodatnia zużycia_O2 oraz tryb włączenia otwartego przepływu.
   3. Ustaw interwał próbek (godziny) na 8:00, a czas trwania eksperymentu (godziny) na N.A. Ustaw jednostki gazu i czasu w razie potrzeby.
   4. Jeśli używasz pierwotnej sondy temperatury do korekcji temperatury inkubacji, upewnij się, że nie jest wybrane ręcznie wprowadzać temperatury komory. Zaznacz opcję Wentylacja i upewnij się, że nie jest wybrany tryb odpływu.
   5. Upewnij się, że nie jest wybrany tryb beztlenowego wentylacji.
2. Wybierz ustawienie komory. Wprowadzamy opisowe etykiety kanałów (np. NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. Kliknij Utilities. Kliknij Komórki w kolumnie EN tylko dla zajętych kanałów. Kliknij Ograniczenie. Oprogramowanie wskaże PASS lub FAIL dla każdego kanału. Kontynuuj tylko wtedy, gdy wszystkie testy restrykcyjne przejdą.
4. Kliknij Volume (Głośność ), aby zmierzyć objętość przestrzeni głowy.
   UWAGA: Objętość przestrzeni powietrznej równa się objętości powietrza w zbiorniku reaktora próbkowego i rury zamkniętej pętli. Potwierdzam, że objętości są rozsądne dla rozmiaru naczynia i długości rur.
5. Kliknij Leakage. Oprogramowanie wskaże PASS lub FAIL dla każdego kanału na podstawie głośności przestrzeni głowy. Jeśli kanał zawiodł, wykonaj następujące kroki.
   1. Upewnij się, że uszczelka O-ring jest czysta, wolna od cząstek i włókien oraz prawidłowo osadzona między krawędzią naczynia a metalową pokrywką.
   2. Dokręć. Sprawdź połączenie i rurki na portach wejścia/wyjścia oraz złączkach. Przycinaj zużyte lub odkształcone końce rur ostrym ostrzem, aby zapewnić czyste, proste cięcie.
   3. Jeśli kanał nadal się psuje, wymień uszczelkę O-ring na nową, kompatybilną określoną przez producenta.
6. Kliknij Volume (Głośność ), aby ponownie zmierzyć objętości przestrzeni głowy. Kliknij Zamknij się. Upewnij się, że kolumna Volume zakładki Komora Setup jest wypełniona dla wszystkich zajętych kanałów.
7. W menu głównym wybierz Narzędzia > Menu Serwis. Potwierdź, że główna sonda temperatury, mierząca temperaturę inkubatora, wynosi 30 °C ± 2 °C i jest stabilna.
8. Kliknij Uruchom. Zapisz plik pod opisową nazwą zawierającą datę (np. 030325PositiveControlValidation). Zapisz nazwę pliku na kartce danych.
9. Wybierz Eksperyment > Zobacz > Wykresy , aby zobaczyć wykresy w czasie rzeczywistym. Produkcja biogazu objawia się dodatnimi wskaźnikami produkcji_CO2 . Kontrola ujemna może wahać się około zera; jednak ich średnia stopa powinna wynosić zero lub dodatnia.
10. Jeśli system zawiera suszarki kondensacyjne, codziennie prowadz rejestr widocznej kondensacji w rurkach. Delikatnie porusz rurki, aby zakłócić zatory i umożliwić odpływ, jeśli to konieczne.
11. Aktualizuj pliki danych (pliki tekstowe ASCII) na końcu każdego przedziału próbkowania. Dane, w tym temperatura, procent gazu (skład gazu), szybkość i akumulacja, mogą być pobierane do różnych innych pakietów oprogramowania podczas eksperymentu lub na jego zakończenie.
    1. Aby otworzyć .dat pliki w arkuszu kalkulacyjnym, uruchom Excela i wybierz Plik > Otwarte. Przejdź do folderu zawierającego plik .dat. W rozwijanym menu typu pliku wybierz Wszystkie pliki i wybierz wybrany plik.
    2. Gdy kreator importu tekstu zażąda powiadomienia, wybierz Delimited jako typ pliku i kliknij Dalej.
    3. W ogranicznikach zaznacz przecinek (Coma). Upewnij się, że nie są wybrane inne ograniczniki. Okno podglądu powinno wyświetlać dane podzielone na kolumny. Kliknij Zakończ, aby załadować dane do arkusza kalkulacyjnego.
    4. Zapisz plik w formacie .xlsx lub .csv do dalszej analizy i archiwizacji.
12. Okresowo analizuj dane, aby upewnić się, że powtórzenia leczenia są spójne. Standardowy błąd replikacji leczenia powinien wynosić mniej niż 5% średniej skumulowanej produkcji_CO2 . Powtarzanie testów nie spełnia tego progu.
13. Kliknij Stop po zakończeniu inkubacji.
    1. Inkubacje mogą trwać od 10 do 90 dni. Jeśli materiały testowe są wysoce biodegradowalne, przerwij inkubację, gdy skumulowana produkcja_CO2 osiągnie plateau, lub przedłuż ją, jeśli po 90 dniach nie zaobserwuje się degradacji.
    2. Zakończ eksperymenty, gdy przez co najmniej 5 dni nie zaobserwowano netto produkcji gazu zarówno w jednostkach kontrolnych, jak i testowych. Żadna produkcja netto nie jest definiowana jako zmiana biodegradacji mniejsza niż 1% w ciągu 5 dni.
14. Wyłącz system albo przygotuj się do kolejnego eksperymentu.

9. Rozkład eksperymentu

1. Rejestruj temperaturę inkubatora (pomiar termistora i inkubatora). Odłącz rurę od zbiorników reaktora od respirometru i zważ każdą próbkę zbiornika reaktora za pomocą precyzyjnej wagi. Zapisz wagę, aby ustalić, czy w okresie inkubacji doszło do utraty wagi/wody.
2. Pobrano 20-30 ml wody morskiej z każdego zbiornika reaktora, aby zmierzyć pH i zasolenie oraz porównać te wartości z tymi zarejestrowanymi w kroku 3.4 w celu potwierdzenia stabilności podczas inkubacji. Przefiltruj dodatkowe 60 mL przez 0,2 μm niskoazotowy filtr celulozowy do butelki z polietylenu ługowanej kwasowo do analizy rozpuszczonych nieorganicznych N i P, stosując standardowe metody z etapu 1.5.
   UWAGA: Próbki pozostałości wody morskiej mogą być filtrowane w celu usunięcia pozostałych plastików, rozcieńczane w celu zmniejszenia stężenia składników odżywczych oraz usuwane przez odpływ zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
3. Płukaj naczynia, uszczelki O, metalowe pokrywki i zakrętki z wodą z kranu. Umieść szkło w kąpieli z kwasem HCl 10% na co najmniej 24 godziny. Autoklawuj i przykryj folią aluminiową na kolejną inkubację

10. Obliczanie procentowej biodegradacji

1. Oblicz całkowity węgiel w podłożu eksperymentalnym/kontrolnym w następujący sposób:
   
   gdzie % C (zawartość węgla) jest określane za pomocą analizy pierwiastkowej.
   UWAGA: Całkowity węgiel w podłożu eksperymentalnym i kontrolnym może przejść następującą transformację biochemiczną podczas inkubacji tlenowej:
   C + O₂ → CO₂
   Każdy mmol (12 mg) węgla organicznego z podłoża eksperymentalnego/kontrolnego może zostać przekształcony w 1 mmol gazowego_CO2. Jeden mmol produkowanego gazu zajmuje 22,4 mL przy standardowej temperaturze i ciśnieniu (STP).
2. Oblicz procent biodegradacji następująco:
   
   gdzie C_g = ilość gazowego węgla wytworzonego z podłoża eksperymentalnego/kontrolnego oraz negatywna kontrola (tylko inokulum wody morskiej), mmole, a C_i = ilość dodanego węgla w podłożu eksperymentalnym, mmole.
3. Oblicz błąd standardowy, s_e, procentu biodegradacji w następujący sposób:
   
   gdzie n1 i n2 = liczba replikowanych zbiorników eksperymentalnych/kontrolnych i reaktora z ujemną kontrolą, odpowiednio, a s = odchylenie standardowe całkowitej ilości gazowego węgla powstałego.
4. Oblicz 95% granice ufności (CL) w następujący sposób:
   
   gdzie t = wartość rozkładu t dla 95% prawdopodobieństwa przy (n1 + n2 − 2) stopniach swobody, więc n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Koniec protokołu

1. Po zakończeniu obliczeń i analizy danych należy skompilować wyniki do raportu końcowego lub wprowadzić je do wspólnej bazy danych zgodnie z planami zarządzania danymi projektowymi lub instytucjonalnymi. Upewnij się, że wszystkie materiały są utylizowane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi niebezpiecznych odpadów instytucjonalnych, a cały sprzęt jest czyszczony i przechowywany.

Wyniki

Przedstawiono wyniki testów biodegradacji morskiej. Biodegradację oceniono dla każdej próbki, mierząc proporcję węgla przekształconego w dwutlenek węgla. Wykresy rozkładu skumulatywnego, szybkościowego i procentowego zazwyczaj wykazują fazę opóźnienia, następnie fazę wzrostu, a ostatecznie plateau. Czas i wielkość tych faz zależą od materiału próbki, warunków eksperymentalnych oraz składu inokulum wody morskiej.

Woda morska zbierana przez cały rok z zatoki umiarkowanej wykazuje zmienność w skł...

Dyskusja

Wydajność w kontroli dodatniej determinuje trafność testu. Wymagana jest minimalna biodegradacja 70% łatwo morskiego biodegradowalnego podłoża pozytywnej kontroli (np. celuloza analitycznej, papier Kraft itp.), na podstawie teoretycznej maksymalnej wydajności gazu. Ten benchmark weryfikuje korzystne warunki i wystarczającą aktywność mikroorganizmów w naturalnej wodzie morskiej podczas inkubacji. Nieosiągnięcie tego progu wskazuje na potencjalny problem z przygotowaniem replikacji, obsługą inokulum w wodzie morskiej (czyl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 & mikro; m, 47 mm filtr z octanem celulozy	Geotech Geofilter	83100056	Filtruj wodę morską
100 mL pipeta wolumetryczna	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Klasa A; wypłukany kwasem i spłukany wodą dejonizowaną
Szklane zlewki 100-600 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Klasa A; wypłukany kwasem i spłukany wodą dejonizowaną
Kule frezujące 20 mm	Retsch	53680062	Stal nierdzewna. Stosowany z mieleniem do mielenia polimerów kriogenicznie
50 mL słoje do mielenia	Retsch	14620216	Stal nierdzewna. Stosowany z kulami mielącymi Mixer Mill 400 oraz 20 mm do kriogenicznego mielenia polimeru
75 mL pipeta wolumetryczna	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Klasa A; wypłukany kwasem i spłukany wodą dejonizowaną
Pompa powietrza i system bąbelkowania	Tetra	77846	Napowietrzaj wodę morską podczas równowagi przed inkubacją
Folia aluminiowa	Fisherbrand	01-213-100	Osłona do autoclavu i czystego przechowywania
Chlorek amonu (NH4Cl)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	Skok składników odżywczych w wodzie morskiej
Bilans analityczny	Mettler	AT201	Do ważenia podłoży eksperymentalnych i kontrolnych
Autoklaw	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Sterylizacja naczyń i zespołów pokrywek
Bazowy Micro-Oxymax 120VAC jednokanałowy	Columbus Instruments	0135-8000	Używany do przechowywania dodatniej kontroli i polimerów
Gaz kalibracyjny	Airgas	X03NI92P3000001	Podstawowe standardowe mieszanki gazów; 2,7% dwutlenku węgla, 4,5% metanu – równoważą azot
Monitor komputerowy	Dell	210-BMKK	Monitor hub Dell Pro 24 Plus USB-C. Używany z komputerem do uruchamiania oprogramowania Micro-Oxymax
Rękawice kriogeniczne	Thermo Fisher Naukowy, Tempshield, Rękawice Kriogeniczne	11-394-306	Używane do pracy z ciekłym azotem
Termometr tarczowy	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	Skalibrowany termometr do temperatury wody morskiej w momencie pobierania
Jednorazowe pipety	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Przepłukaj boki naczynia, aby uwolnić materiał
ENC52 Obudowa kontrolowana temperaturą i światłem	Columbus Instruments	4740-4054	Utrzymuj temperaturę i warunki oświetleniowe
Szczypce do kolb	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Używane do obsługi słoików do mielenia w ciekłym azocie
Kolby, 250 mL	DWK Nauki o Życiu	14395-250	Naczynia reaktora próbkowego
Fiolki z szklanymi powłokami z zamknięciami typu korek	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Przechowywanie próbek
Przenośny głębiomierz H22PX	West Marine, Norcross Marine	6849368	Określ głębokość miejsca zbierania wody morskiej
Przenośny GPS 73	Garmin	10-01504-00	Wykorzystywane do określenia lokalizacji miejsca zbierania wody morskiej
HDPE Pan	Thermo Scientific, Nalgene	13-359-26	Używany do łukowania kwasowo szkła i wyrobów chemicznych; w roztworze 10% HCl
Kwas solny (roztwór wody kwaśnej)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	Certyfikowany ACS Plus, 36,5 do 38,0%. Kontrola czujników CO2 oraz szkło z wymywaniem kwasem
Laminarny okap	Nauka o lotnictwie	FLOW-48-A	Minimalizacja zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu podczas przygotowania próbki
Large Niskin; Tylko butelka Beta Plus - 8,2L pozioma, PVC	Nauka przede wszystkim	3-1980-H65	Do zbierania wody morskiej z nabrzeża lub łodzi
Paska na ciekły azot	Thermo Fisher Naukowy, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Trzymaj ciekły azot i nbsp;
Zbiornik do transferu ciekłego azotu, 10 L	Thermo Scientific	TY509X2	Przechowuj i wydawaj ciekły azot do kriomłynowania
Ciekły azot, przemysłowy, 22 PSI	Airgas	NI 180LT22	Wykorzystywane do kruchości i mielenia polimerów
Mechaniczny potrząsacz sita	Humbolt, Grainger	5DPL6	Analiza sitowa dla rozkładu rozmiarów cząstek
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	Silikonowa szczelka o-ring, metalowy port z 3 złączkami oraz nakrętką GL45
Interfejs rozszerzający Micro-Oxymax 10 kanałów	Columbus Instruments	0135-8101	Komponent systemu respirometrycznego
Mikro-Oxymax Respirometr (czujnik CO2)	Columbus Instruments	0135-8403	Niedyspersyjna podczerwień
Młyn mieszający 400	Retsch	207450001	Młyn mieszający 400. Wykorzystywane do kriogenicznego mielenia polimerów
Zmotoryzowany kontroler pipety	Eppendorf	4430000018	Transfer wody morskiej do zbiorników reaktora próbkującego
Bursztynowa butelka laboratoryjna o grubym pysku HDPE o charakterze wąskim usta, 1 L	Thermo Scientific, Nalgene	02-923-5	Dyskretna próbka wody morskiej z całej wody
Siatka nylonowa 20 mikronów	ELKO Filtering Co.	41718	Używany do przesiewania surowej wody morskiej w celu usunięcia większych, niejednorodnych cząstek
Otwarta orbitalna potrząsaczka	Thermo Fisher Scientific	SK4000	Utrzymanie ruchu orbitalnego zbiorników reaktora podczas inkubacji
Komputer OptiPlex 5090 o małej formie	Dell	C0SL03	Komputer Desktom używany do uruchamiania oprogramowania Micro-Oxymax
Miernik pH/Cond	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Miernik pH i przewodności stołowej do pomiaru początkowego i ostatecznego inokulum wody morskiej
Butelka polietylenowa, 60 mL	Qorpak	PLC-03564	Dyskretna próbka wody morskiej z filtrem
Fosforan potasu monozasadowy (KH2(PO4))	Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents	BP362-500	Skok składników odżywczych w wodzie morskiej
Precyzyjna równowaga	Sartorius	Practum2102-1S	Do ważenia tary i całej masy naczyń
Okrągły baloner, 20 l	Thermo Fisher Scientific	02961A	Ługowanie kwasem do magazynowania wody morskiej
Gogle ochronne	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	Stalowa łopatka laboratoryjna
Sita	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	Stalowe sita. Liczba i rozmiary sit zależą od testowanego materiału.
Celuloza Sigmacell, typ 101	Sigma-Aldrich	435236-250G	Proszek, podłoże z dodatnim kontrolowaniem
Wodorowęglan sodu	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	S233-500	Sprawdzenie czujnika CO2
Siarczyn sodu, bezwodni, 98%	Thermo Fisher Naukowe, Termonaukowe Chemikalia	AAA1793336	Sprawdzenie czujnika CO2
Termometr/sonda termistorowa	Fisherbrand	15-079-700	Sprawdź temperaturę inkubatora
Barometr precyzyjny z tarczą śledzenia	Fisherbrand	14-648-51	Rekordowe ciśnienie atmosferyczne na początku eksperymentu
Victor Medium Duty Hydrogen, Metan Dwustopniowy Regulator, CGA - 350	AirGas	VIC0781-3559	Regulator gazu kalibracyjnego
Kolby objętościowe, 2 L	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	Klasa A; kwas wypłukiwał i spłukiwał wodą dejonizowaną. Używana do przygotowywania wody morskiej z dodatkiem odżywczym.
Wagi	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	Polietylen