Protokół opisuje standardową procedurę operacyjną testowania potencjalnie biodegradowalnych materiałów zarówno syntetycznych, jak i naturalnych, w warunkach aerobowych, z użyciem naturalnego inokulum wody morskiej oraz zautomatyzowanego systemu zamkniętej respirometrii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badania biodegradacji tlenowej materiałów z użyciem naturalnego inokulum morskiego i zamkniętego respirometru
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Właściwa ocena materiałów biodegradowalnych zależy od szerokiego zastosowania standardowych metod testowania. Chociaż takie metody istnieją, zdolności testowe pozostają ograniczone, ograniczone kosztami oraz czasem uruchomienia nowych laboratoriów. Ten zmodyfikowany protokół przesiewowy opiera się na normie ASTM International D6691-24a, Standardowej Metodzie Testowania Tlenowej Biodegradacji Materiałów Plastikowych w środowisku morskim przez zdefiniowane konsorcjum mikroorganizmów lub naturalne inokulum wody morskiej. Ocenia biodegradację materiałów w środowisku morskim, porównując wyniki z pozytywnymi i negatywnymi kontrolami, oraz wykorzystuje naturalne inokulum wody morskiej wzbogacone amonem i fosforanem, aby zapobiec ograniczeniom składników odżywczych. Materiały są wystawione na działanie tej bogatej w składniki odżywcze wody morskiej i inkubowane w temperaturze 30 °C. Respirometr Micro-Oxymax mierzy produkcję biogazu (dwutlenku węgla,CO2) w czasie. Stopień mineralizacji (biodegradacji) określa się poprzez obliczenie proporcji węgla pochodzącego z materiału przekształconego w biogaz-węgiel. Procent produkcjiCO2 , wyrażony jako ułamek zmierzonej lub teoretycznej zawartości węgla, jest podawany jako funkcja czasu. System respirometrii zamkniętej pętli obsługuje różne zbiorniki reaktorowe, przygotowane w trzech kopiach dla każdego materiału: kontrolę ujemną (tylko inokulum wody morskiej) oraz kontrolę dodatnią (chromatografia cienkowarstwowa celuloza). Ta metoda jest ważna do oceny materiałów w środowisku morskim i pomaga zapobiegać globalnemu zanieczyszczeniu.
Wprowadzenie
Odpady plastikowe stanowią zagrożenie dla ekosystemów morskich i zdrowia ludzi1. Rosnące obawy dotyczące zanieczyszczenia plastikiem, wraz z morskimi odpadami pochodzącymi z jakichkolwiek materiałów z oceanu, podkreślają potrzebę zrównoważonych rozwiązań, takich jak ulepszona gospodarka odpadami na końcu życia oraz materiały biodegradowalne, które łatwo ulegają biodegradacji w środowisku morskim. W przeciwieństwie do tradycyjnych syntetycznych tworzyw sztucznych, które utrzymują się przez dziesięciolecia do wieków i generują mikroplastiki gromadzące się w sieciach pokarmowych 2,3,4, materiały biodegradowalne, czyli organiczne składniki węgla, mogą być metabolizowane doCO2 i metanu (CH4) lub asymilowane do biomasy mikrobiologicznej5. Zrozumienie biodegradacji materiałów w wodzie morskiej jest zatem kluczowe dla ilościowego określenia i łagodzenia wpływu odpadów morskich na środowisko.
Biodegradacja w środowisku morskim jest kontrolowana przez interakcję zmiennych przestrzenno-czasowych, w tym dostępności światła i składników odżywczych, ciśnienia, temperatury, składu gatunków mikroorganizmów oraz fizykochemicznej natury i struktury polimeru, które wszystkie decydują o tempie, stopniu i mechanizmie rozkładu6. Te zmienne stanowią poważne wyzwanie dla laboratoryjnych badań biodegradacji symulujących środowiska morskie. Ta standardowa procedura operacyjna (SOP) wykorzystuje naturalną wodę morską jako inokulum, rejestrując obecną społeczność mikroorganizmów in situ oraz rejestruje istotne zmienne, takie jak rozpuszczone w wodzie morskiej substancje odżywcze, cząstki węgla i azotu, chlorofil, zasolenie, pH oraz temperaturę. To kontrolowane, laboratoryjne podejście optymalizuje warunki sprzyjające mineralizacji i umożliwia bezpośrednie pomiary biodegradacji, które nie są możliwe in situ. ASTM International D6691-24a, Standardowa metoda testowania do określania tlenowej biodegradacji materiałów tworzyw sztucznych w środowisku morskim przez zdefiniowane konsorcjum mikrobiologiczne lub naturalne inokulum wody morskiej (dalej ASTM D6691), oraz ten SOP zostały opracowane jako szybkie i niezawodne narzędzie przesiewowe do oceny biodegradowalności materiałów 7,8,9,10.
Zgodnie z normą ASTM D6691, testem przesiewowym dotyczącym biodegradowalności polimerów, protokół ten ocenia biodegradację materiałów w optymalnych warunkach, 30 °C, maksymalną powierzchnię z mielonej próbki oraz nadmiar składników odżywczych nieorganicznych (azot, 130 mg/L; fosfor, 23 mg/L)9, aby wspierać mineralizację i zapobiegać ograniczeniom składników odżywczych. Chociaż testy przesiewowe dostarczają cennych wstępnych informacji, dalsze badania, takie jak cumowania przybrzeżne i głębinowe, które mierzą utratę masy ciała w funkcji czasu, mogą być konieczne do kompleksowej oceny w naturalnych warunkach morskich. Ponieważ te testy cumowania przybrzeżnego i głębinowego szacują biodegradację na podstawie utraty masy ciała w funkcjiczasu 10,11, naukowcy powinni najpierw przeprowadzić ten test przesiewowy, który bezpośrednio mierzy metabolizm mikroorganizmów, zanim przystąpią do eksperymentu in situ z cumowaniem przybrzeżnym i głębinowym morzem, który jest również droższy.
Standardowa metoda testowa ASTM D6691 określa procedury oceny biodegradacji tlenowej nieunoszących się tworzyw sztucznych w środowiskach morskich. Ta norma, wraz ze standardami specyfikacji, takimi jak ASTM D7081 (Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment; koncentrująca się na biodegradowalności w ośrodku wodnym, obecnie wycofana z ASTM i ponownie zakwalifikowana), stanowi ramy do certyfikacji polimerów eksperymentalnych jako morskich biodegradowalnych 9,12. Ogólnie rzecz biorąc, specyfikacja to konsensusowy standard ASTM International, który określa wymagania, które materiał, produkt lub system musi spełniać. Zapewnia, że materiały zaprojektowane do biodegradacji w środowiskach morskich robią to w akceptowalnych terminach i nie uwalniają potencjalnie toksycznych dodatków, takich jak barwniki czy plastyfikatory.
Opierając się na ASTM D6691, protokół ten określa szybkość i stopień biodegradacji tlenowej materiałów (eksperymentalne podłoże) w naturalnej wodzie morskiej i rozszerza pozytywne kontrole materiałów (np. celuloza, papier Kraft, chityna/chitosan), które historycznie wykazują biodegradowalność w środowisku morskim 7,9,10. Celem tej metody jest przesiewanie materiałów w optymalnych warunkach, aby sprawdzić, czy materiały ulegają biodegradacji w środowisku morskim. Inokulum wykorzystuje naturalną społeczność mikroorganizmów obecną w wodzie morskiej, zbieraną zgodnie ze szczególnymi wytycznymi zawartymi w ASTM. Wytyczne te podkreślają wykorzystanie wody morskiej o zasoleniu około 32, zbieranej z miejsca wolnego od zanieczyszczeń, takich jak ścieki, zrzuty chemiczne czy wycieki ropy. Test wykorzystuje zautomatyzowany respirometr zamkniętej pętli z naczyniami reaktorowymi o pojemności 250 mL utrzymywanymi w temperaturze 30 °C, z których każdy zawiera 75 mL wody morskiej i ~20 mg eksperymentalnego lub kontrolnego substratu8. Mineralizacja (biodegradacja) wyraża się jako procent netto wyprodukowanego biogazu węglowego (CO2-C) w stosunku do początkowej masy dodanego węgla. Ta metoda nie uwzględnia asymilacji węgla do biomasy mikroorganizmów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Zbieranie i charakterystyka wody morskiej
- Zidentyfikuj miejsce zbierania wody morskiej nienaruszone przez ścieki, chemikalia, plamy ropy ani silny wpływ słodkiej wody.
- Na miejscu zbioru można zarejestrować źródło (lokalizacja, szerokość i długość geograficzna, głębokość zbioru, całkowita głębokość i temperatura), data pobrania próbki oraz obserwowane warunki wodne.
- Zbieraj i łącz próbki wody morskiej z różnych głębokości, lokalizacji oraz z różnych miejsc pobierania próbek, aby promować zróżnicowany skład społeczności mikroorganizmów.
- W balonie wyługowanym kwasem 20 L zbierać od 10 L do 20 L wody morskiej za pomocą dużej butelki Niskin i transportować z powrotem do laboratorium.
- Z balony przelej 1 L całej podpróbki wody morskiej do butelki z bursztynowym polietylenem o wysokiej gęstości (HDPE) wyługowanej kwasem 1 litrem do analizy laboratoryjnej cząstek węgla i azotu w początkowych warunkach morskich. Z próbki 1 L przefiltruj (0,2 μm; niskoazotowy celulozowy octan) i pobierz podpróbkę 60 mL w butelce z polietylenu ługowanej kwasem do analizy rozpuszczonych składników azotu nieorganicznego i organicznego (N) oraz fosforu (P).
- Oznacz podpróbki nazwą projektu, identyfikatorem próbki i datą. Zmierz stężenia NH4+ metodą indofenolową (4500-NH3)13,14 oraz poziomy 3- PO4 metodą pojedynczego roztworu (4500-P E)13,15. Ilościowo określić cząstki azotu i węgla metodą analizy pierwiastkowej16. Zmierz stężenia chlorofilu-a zgodnie z protokołami określonymi przez Parsons i in.17(10150 A, 10150 C)13.
UWAGA: Analizy jakości wody związane z składnikami odżywczymi są opcjonalne. Protokół ten zakłada, że analizy przeprowadza się w laboratorium zewnętrznym. - Luźno przykryj otwór balony, aby utrzymać warunki tlenowe i przechowywać wodę morską w temperaturze 30 °C w ciemności do 7 dni.
UWAGA: Woda morska może być również napowietrzana za pomocą pompy powietrznej i systemu bąbelkowania.
2. Przygotowanie podłoża eksperymentalnego
- Dodaj 10-15 g eksperymentalnego podłoża (np. naturalnych polisacharydów, drewna, płyty włóknistej, polimerów), które mogą mieć formę pelletów, fragmentów i formowanych kawałków, do słoika do frezowania stali nierdzewnej o pojemności 50 mL z kulą stalową o średnicy 20 mm. Przed rozpoczęciem testu zmielić podłoże eksperymentalne do jednolitego rozmiaru cząstek (0,10-0,25 mm).
- Zanurz słoik do mielenia w ciekłym azocie i trzymaj kruchy przez 15 minut, aż ciekły azot przestanie wrzeć.
UWAGA: Ciekły azot to kriogeniczna ciecz, która może powodować oparzenia, urazy lub odmrożenia. Przeczytaj i przestrzegaj wszystkich kart bezpieczeństwa przed użyciem. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego. - Zabezpiecz słoik do frezowania w zaczepce do młyna kulowego, ustaw parametry instrumentu na 30 Hz i 2:30 min, po czym naciśnij Start. Powtórz 4 razy, z 30 sekundami chłodzenia w ciekłym azocie między próbami. Jeśli materiał jest polimerem o niskiej temperaturze przejścia szkła, wykonuj dodatkowe cykle mielenia w razie potrzeby, aby uzyskać równomierny rozkład wielkości cząstek.
- Zweryfikować jednorodność rozmiarów i scharakteryzować rozkład rozmiarów cząstek za pomocą analizy sitowej, zgodnie z normą ASTM D1921-9618. Złóż standardowe sita obejmujące oczekiwany zakres rozmiarów cząstek, z najmniejszym rozmiarem siatki na dole. Umieść zmieloną próbkę na górnym sicie i zabezpiecz stos sita w mechanicznej shakerze. Mieszaj, aż cząstki przejdą przez siatkę. Zbierz i zważ zachowany materiał z każdego sita, aby obliczyć rozkład wielkości cząstek. Używaj tego samego zestawu sitek w różnych metodach leczenia, aby zachować porównawczość. Zanotuj dystrybucję na arkuszu danych.
- Określ zawartość węgla na podpróbkę suchą masy mielonego podłoża eksperymentalnego za pomocą analizy pierwiastkowej16.
UWAGA: Protokół ten zakłada, że analiza pierwiastkowa jest przeprowadzana w laboratorium zewnętrznym.
3. Przygotowanie dodatkowych składników odżywczych do wody morskiej
- Napełnij kolbę wolumetryczną o pojemności 2 lub 4 litry wodą morską do połowy. Całkowita objętość potrzebna zależy od liczby zbiorników reaktorowych przeznaczonych do eksperymentu. Każdy zbiornik reaktora będzie zawierał 75 mL wody morskiej. Jeśli źródło wody morskiej zawiera wysokie stężenie cząstek organicznych, przesiej wodę morską przez siatkę o średnicy 20 μm, aby wyeliminować niejednorodne zanieczyszczenia przez duże cząstki.
- Używając precyzyjnej wagi o czułości do 0,001 g, przygotuj wagę i odważ 0,5 g/l chlorku amonu (NH4Cl), a następnie 0,1 g/l fosforanu potasu monozasadowego (KH2PO4) na podstawie 2 L lub 4 L wody morskiej.
UWAGA: Chlorek amonu może powodować uszkodzenia lub podrażnienia oczu. Przeczytaj i przestrzegaj wszystkich kart bezpieczeństwa przed użyciem oraz załóż odpowiednie środki ochrony osobistej.
UWAGA: Utylizacja chlorku amonu i fosforanu potasu jednozasadowych odpadów w dedykowanych pojemnikach na odpady niebezpieczne zgodnie z procedurami instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami. Niewielkie ilości rozcieńczonych 4Cl i KH2PO4 mogą kwalifikować się do utylizacji po rozcieńczeniu obfitą wodą, jeśli instytucja i lokalne władze oczyszczające kanalizację na to pozwolą. - Dodaj nieorganiczne składniki odżywcze do kolby objętościowej 2 lub 4 L, dostosuj do odpowiedniej objętości wodą morską, dodaj baton mieszankowy i mieszaj na tacyce, aż wszystkie sole się rozpuszczą. Rozwiązanie powinno być przezroczyste, bez widocznych cząstek stałych.
- Podpróbka 20-30 ml wody morskiej uzupełnionej składnikami odżywczymi do pomiaru pH i zasolenia. Przefiltruj dodatkowe 60 mL przez 0,2 μm niskoazotowy celulozowy filtr do butelki z polietylenu ługowanej kwasem do analizy rozpuszczonych nieorganicznych azotów i p, zgodnie ze standardowymi metodami z kroku 1.5.
- Mierz pH i zasolenie na stole, zgodnie z instrukcjami producenta. Dla pełnomocnej wody morskiej spodziewany jest spadek pH o około jednej jednostki ze względu na kwasowość suplementu.
4. Przygotowanie do inkubacji zbiornika reaktora
- Wymywaj wszystkie szkła kwasowe, w tym naczynia reaktorowe o pojemności 250 mL na próbki oraz pipetę objętościową 75 mL w kwasie solnym 10% (HCl) przez 24 godziny, a następnie płukaj 3 razy wodą dejonizowaną.
UWAGA: HCl może powodować poważne oparzenia i uszkodzenia oczu. Przeczytaj i przestrzegaj wszystkich kart bezpieczeństwa przed użyciem. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego.
UWAGA: 10% odpadów HCl można zneutralizować wodorowęglanem sodu, tworząc roztwór neutralny przed utylizacją. Przeprowadz neutralizację zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych oraz obowiązującymi lokalnymi przepisami. - Autoklawowanie pustych zbiorników reaktora o pojemności 250 mL kwasem, pokrywek z portami, silikonowych uszczelek O-ringów i nakrętek w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut przed dniem eksperymentu.
- Oznacz fiolki z próbkami numerem/ID kanału odpowiadającym naczyniom otrzymującym próbki lub materiały kontrolne.
- Używając wagi analitycznej, staruj fiolkę (z kapslem) i odważ 20 mg (± 0,1 mg) eksperymentalnego lub kontrolnego, zapisuj pełną wagę odczytu i odłóż na bok. Powtarzam to dla wszystkich eksperymentalnych i kontrolnych replik.
UWAGA: Upewnij się, że wagi są dokładne. Zaleca się ważenie wszystkich podłoży tego samego dnia i przez tę samą osobę. - Włącz inkubator dzień przed dodaniem zbiorników i ustaw temperaturę na 30 °C. Włącz respirometr co najmniej 2 godziny przed przeprowadzeniem diagnostyki systemu i kalibracji czujnika zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Przygotowanie zbiornika reaktora może być kontynuowane, gdy temperatura inkubatora osiągnie i utrzymuje się na poziomie 30 ± 2 °C. - Przygotuj kartę danych, zapisując identyfikatory próbek/repliki oraz odpowiadający im numer kanału. Uporządkuj naczynia reaktora i zespoły pokrywek (pokrywa z portami/O-ring) według numeru kanału/ID (upewnij się, że każdy zbiornik jest wyraźnie oznaczony). Sprawdź o-ringi oraz pokrywki/porty, aby upewnić się, że są czyste, suche i nienaruszone.
5. Ustawianie zbiorników reaktorowych
- Użyj kwaśnie ługowanej pipety wolumetrycznej o pojemności 75 mL oraz zmotoryzowanego regulatora pipet, aby podać 75 ml wody morskiej z dodatkiem odżywczym do każdego zbiornika reaktora.
- Wyjmij jedną jednorazową pipetę wody morskiej (~3 mL) z każdego naczynia i odłóż ją na czystej powierzchni obok niej. Ta woda morska zostanie użyta do płukania zmielonych podłoży eksperymentalnych i kontrolnych z fiolki z tarem (Rysunek 1).
- Przenieś podłoża do odpowiednich naczyń.
- Umieść uszczelkę O na krawędzi zbiornika reaktora, a następnie załóż pokrywę z dwoma otworami bezpośrednio na uszczelkę O. Zabezpiecz uszczelkę O-ring i pokrywę za pomocą nakrętki.
- Dopasuj zbiornik reaktora do odpowiadających mu linii gazowych/kondensacyjnych. Mocno włóż przewody gazowe do odpowiednich portów wlotowych/wylotowych w pokrywie naczynia.
- Włącz platformę shaker na 0,05 x g (tryb ciągły). Przeprowadz wizualną kontrolę, aby upewnić się, że wszystkie naczynia są zabezpieczone, a następnie zamknij drzwi inkubatora.
- Rejestruj temperaturę inkubatora (odczyt i sondę termistoru) oraz ciśnienie atmosferyczne za pomocą barometru.
Rysunek 1: Ustawienie i przygotowanie naczynia. (A) dodanie wody morskiej, (B) dodanie próbki oraz (C) dodanie uszczelki O, metalowej pokrywki i nakrętki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
6. Rozpoczęcie systemu respirometrycznego
- Uruchom oprogramowanie na podłączonym komputerze. Sprawdź, czy system wykrywa sprzęt przez połączenie RS-232. Jeśli sprzęt nie zostanie znaleziony, powiadomienie poinformuje, że urządzenie nie jest podłączone i program musi zostać ponownie uruchomiony.
- W głównym menu oprogramowania wybierz Narzędzia > Diagnostyka > Podstawowe operacje. Kliknij Zapisz plik loga. Kliknij zawory i czujniki. Oprogramowanie wskaże PASS lub FAIL dla każdego testu. Przechodzić do dwupunktowej kalibracji czujnikaCO2 tylko wtedy, gdy oba testy przejdą pozytywnie.
7. Kalibracja czujnikaCO2
- Podłącz kolumnę wapna sodowego do portu azotowego na tylnym panelu pompy próbki, aby usunąć OTCO2 i zerową kalibrację. Upewnij się, że limonka soda wygląda na kredowobiałą, a nie przebarwioną (np. różową lub fioletową).
- Wybierz narzędzia > kalibrację. Kliknij Start Calibration w prawym dolnym rogu. Na żądanie dostosuj przepływ próbki do 0,5 L/min za pomocą sterowania pompą próbkową na przednim panelu. Kliknij OK.
- Gdy timer osiągnie zero, naciśnij przyciski przesunięcia w górę i w dół na czujniku CO2 , aby ustawić odczyt na ekranie do 0,000 (lub jak najbliżej możliwego). Wartości zmieniają się na zielone, gdy mieszczą się w akceptowalnym zakresie. Kliknij Następny gaz.
- Na żądanie podłącz butlę kalibracyjną do portu kalibracyjnego na tylnym panelu pompy próbki. Dostosuj ciśnienie gazu kalibracyjnego na wylotzie do 5 PSIG. Upewnij się, że nadmiar gazu przepływa przez złączkę T, dzięki czemu użytkownik może usłyszeć i wyczuć gaz w pobliżu złącza, zanim klikniesz OK.
- Gdy timer osiągnie zero, naciśnij przyciski Up i Down na czujniku CO2 , aby dostosować odczyt na ekranie do 2,700 (lub jak najbliżej możliwości). Wartości zmieniają się na zielone, gdy mieszczą się w akceptowalnym zakresie. Kliknij Następny gaz , aby zakończyć kalibrację.
UWAGA: Stężenia gazów rozpiętych są określane przez certyfikowaną mieszankę gazów pierwotnych standardowych, zgodnie z dokumentacją w certyfikacie analizy dostawcy.
8. Konfiguracja eksperymentu w oprogramowaniu
- Wybierz Eksperyment > Konfiguracja. Wpisz numery kanałów startowych i końcowych z menu rozwijanych na podstawie zajętych kanałów.
- Ustaw próg odświeżania (%) na 0,50, interwał odświeżania na N.A., a okno odświeżania (sek) na auto.
- W sekcji Różne ustawienia zaznacz pole dla czujników oczyszczania; upewnij się, że nie są wybrane automatyczne pomiary objętości, dodatnia zużyciaO2 oraz tryb włączenia otwartego przepływu.
- Ustaw interwał próbek (godziny) na 8:00, a czas trwania eksperymentu (godziny) na N.A. Ustaw jednostki gazu i czasu w razie potrzeby.
- Jeśli używasz pierwotnej sondy temperatury do korekcji temperatury inkubacji, upewnij się, że nie jest wybrane ręcznie wprowadzać temperatury komory. Zaznacz opcję Wentylacja i upewnij się, że nie jest wybrany tryb odpływu.
- Upewnij się, że nie jest wybrany tryb beztlenowego wentylacji.
- Wybierz ustawienie komory. Wprowadzamy opisowe etykiety kanałów (np. NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
- Kliknij Utilities. Kliknij Komórki w kolumnie EN tylko dla zajętych kanałów. Kliknij Ograniczenie. Oprogramowanie wskaże PASS lub FAIL dla każdego kanału. Kontynuuj tylko wtedy, gdy wszystkie testy restrykcyjne przejdą.
- Kliknij Volume (Głośność ), aby zmierzyć objętość przestrzeni głowy.
UWAGA: Objętość przestrzeni powietrznej równa się objętości powietrza w zbiorniku reaktora próbkowego i rury zamkniętej pętli. Potwierdzam, że objętości są rozsądne dla rozmiaru naczynia i długości rur. - Kliknij Leakage. Oprogramowanie wskaże PASS lub FAIL dla każdego kanału na podstawie głośności przestrzeni głowy. Jeśli kanał zawiodł, wykonaj następujące kroki.
- Upewnij się, że uszczelka O-ring jest czysta, wolna od cząstek i włókien oraz prawidłowo osadzona między krawędzią naczynia a metalową pokrywką.
- Dokręć. Sprawdź połączenie i rurki na portach wejścia/wyjścia oraz złączkach. Przycinaj zużyte lub odkształcone końce rur ostrym ostrzem, aby zapewnić czyste, proste cięcie.
- Jeśli kanał nadal się psuje, wymień uszczelkę O-ring na nową, kompatybilną określoną przez producenta.
- Kliknij Volume (Głośność ), aby ponownie zmierzyć objętości przestrzeni głowy. Kliknij Zamknij się. Upewnij się, że kolumna Volume zakładki Komora Setup jest wypełniona dla wszystkich zajętych kanałów.
- W menu głównym wybierz Narzędzia > Menu Serwis. Potwierdź, że główna sonda temperatury, mierząca temperaturę inkubatora, wynosi 30 °C ± 2 °C i jest stabilna.
- Kliknij Uruchom. Zapisz plik pod opisową nazwą zawierającą datę (np. 030325PositiveControlValidation). Zapisz nazwę pliku na kartce danych.
- Wybierz Eksperyment > Zobacz > Wykresy , aby zobaczyć wykresy w czasie rzeczywistym. Produkcja biogazu objawia się dodatnimi wskaźnikami produkcjiCO2 . Kontrola ujemna może wahać się około zera; jednak ich średnia stopa powinna wynosić zero lub dodatnia.
- Jeśli system zawiera suszarki kondensacyjne, codziennie prowadz rejestr widocznej kondensacji w rurkach. Delikatnie porusz rurki, aby zakłócić zatory i umożliwić odpływ, jeśli to konieczne.
- Aktualizuj pliki danych (pliki tekstowe ASCII) na końcu każdego przedziału próbkowania. Dane, w tym temperatura, procent gazu (skład gazu), szybkość i akumulacja, mogą być pobierane do różnych innych pakietów oprogramowania podczas eksperymentu lub na jego zakończenie.
- Aby otworzyć .dat pliki w arkuszu kalkulacyjnym, uruchom Excela i wybierz Plik > Otwarte. Przejdź do folderu zawierającego plik .dat. W rozwijanym menu typu pliku wybierz Wszystkie pliki i wybierz wybrany plik.
- Gdy kreator importu tekstu zażąda powiadomienia, wybierz Delimited jako typ pliku i kliknij Dalej.
- W ogranicznikach zaznacz przecinek (Coma). Upewnij się, że nie są wybrane inne ograniczniki. Okno podglądu powinno wyświetlać dane podzielone na kolumny. Kliknij Zakończ, aby załadować dane do arkusza kalkulacyjnego.
- Zapisz plik w formacie .xlsx lub .csv do dalszej analizy i archiwizacji.
- Okresowo analizuj dane, aby upewnić się, że powtórzenia leczenia są spójne. Standardowy błąd replikacji leczenia powinien wynosić mniej niż 5% średniej skumulowanej produkcjiCO2 . Powtarzanie testów nie spełnia tego progu.
- Kliknij Stop po zakończeniu inkubacji.
- Inkubacje mogą trwać od 10 do 90 dni. Jeśli materiały testowe są wysoce biodegradowalne, przerwij inkubację, gdy skumulowana produkcjaCO2 osiągnie plateau, lub przedłuż ją, jeśli po 90 dniach nie zaobserwuje się degradacji.
- Zakończ eksperymenty, gdy przez co najmniej 5 dni nie zaobserwowano netto produkcji gazu zarówno w jednostkach kontrolnych, jak i testowych. Żadna produkcja netto nie jest definiowana jako zmiana biodegradacji mniejsza niż 1% w ciągu 5 dni.
- Wyłącz system albo przygotuj się do kolejnego eksperymentu.
9. Rozkład eksperymentu
- Rejestruj temperaturę inkubatora (pomiar termistora i inkubatora). Odłącz rurę od zbiorników reaktora od respirometru i zważ każdą próbkę zbiornika reaktora za pomocą precyzyjnej wagi. Zapisz wagę, aby ustalić, czy w okresie inkubacji doszło do utraty wagi/wody.
- Pobrano 20-30 ml wody morskiej z każdego zbiornika reaktora, aby zmierzyć pH i zasolenie oraz porównać te wartości z tymi zarejestrowanymi w kroku 3.4 w celu potwierdzenia stabilności podczas inkubacji. Przefiltruj dodatkowe 60 mL przez 0,2 μm niskoazotowy filtr celulozowy do butelki z polietylenu ługowanej kwasowo do analizy rozpuszczonych nieorganicznych N i P, stosując standardowe metody z etapu 1.5.
UWAGA: Próbki pozostałości wody morskiej mogą być filtrowane w celu usunięcia pozostałych plastików, rozcieńczane w celu zmniejszenia stężenia składników odżywczych oraz usuwane przez odpływ zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi. - Płukaj naczynia, uszczelki O, metalowe pokrywki i zakrętki z wodą z kranu. Umieść szkło w kąpieli z kwasem HCl 10% na co najmniej 24 godziny. Autoklawuj i przykryj folią aluminiową na kolejną inkubację
10. Obliczanie procentowej biodegradacji
- Oblicz całkowity węgiel w podłożu eksperymentalnym/kontrolnym w następujący sposób:
gdzie % C (zawartość węgla) jest określane za pomocą analizy pierwiastkowej.
UWAGA: Całkowity węgiel w podłożu eksperymentalnym i kontrolnym może przejść następującą transformację biochemiczną podczas inkubacji tlenowej:
C + O2 → CO2
Każdy mmol (12 mg) węgla organicznego z podłoża eksperymentalnego/kontrolnego może zostać przekształcony w 1 mmol gazowegoCO2. Jeden mmol produkowanego gazu zajmuje 22,4 mL przy standardowej temperaturze i ciśnieniu (STP). - Oblicz procent biodegradacji następująco:
gdzie Cg = ilość gazowego węgla wytworzonego z podłoża eksperymentalnego/kontrolnego oraz negatywna kontrola (tylko inokulum wody morskiej), mmole, a Ci = ilość dodanego węgla w podłożu eksperymentalnym, mmole. - Oblicz błąd standardowy, se, procentu biodegradacji w następujący sposób:
gdzie n1 i n2 = liczba replikowanych zbiorników eksperymentalnych/kontrolnych i reaktora z ujemną kontrolą, odpowiednio, a s = odchylenie standardowe całkowitej ilości gazowego węgla powstałego. - Oblicz 95% granice ufności (CL) w następujący sposób:
gdzie t = wartość rozkładu t dla 95% prawdopodobieństwa przy (n1 + n2 − 2) stopniach swobody, więc n = 3 + 3 − 2 = 4.
11. Koniec protokołu
- Po zakończeniu obliczeń i analizy danych należy skompilować wyniki do raportu końcowego lub wprowadzić je do wspólnej bazy danych zgodnie z planami zarządzania danymi projektowymi lub instytucjonalnymi. Upewnij się, że wszystkie materiały są utylizowane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi niebezpiecznych odpadów instytucjonalnych, a cały sprzęt jest czyszczony i przechowywany.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiono wyniki testów biodegradacji morskiej. Biodegradację oceniono dla każdej próbki, mierząc proporcję węgla przekształconego w dwutlenek węgla. Wykresy rozkładu skumulatywnego, szybkościowego i procentowego zazwyczaj wykazują fazę opóźnienia, następnie fazę wzrostu, a ostatecznie plateau. Czas i wielkość tych faz zależą od materiału próbki, warunków eksperymentalnych oraz składu inokulum wody morskiej.
Woda morska zbierana przez cały rok z zatoki umiarkowanej wykazuje zmienność w skł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wydajność w kontroli dodatniej determinuje trafność testu. Wymagana jest minimalna biodegradacja 70% łatwo morskiego biodegradowalnego podłoża pozytywnej kontroli (np. celuloza analitycznej, papier Kraft itp.), na podstawie teoretycznej maksymalnej wydajności gazu. Ten benchmark weryfikuje korzystne warunki i wystarczającą aktywność mikroorganizmów w naturalnej wodzie morskiej podczas inkubacji. Nieosiągnięcie tego progu wskazuje na potencjalny problem z przygotowaniem replikacji, obsługą inokulum w wodzie morskiej (czyl...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Columbus Instruments oraz Laboratorium Biodegradowalności w Szkole Nauk i Technologii Morskiej na Uniwersytecie Massachusetts Dartmouth za wsparcie techniczne i dostęp do obiektów. Środki na system Micro-Oxymax Respirometry w Columbus Instruments oraz uruchomienie laboratorium zapewniły PrimaLoft oraz Massachusetts Technology Collaborative.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,2 & mikro; m, 47 mm filtr z octanem celulozy | Geotech Geofilter | 83100056 | Filtruj wodę morską |
| 100 mL pipeta wolumetryczna | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2U | Klasa A; wypłukany kwasem i spłukany wodą dejonizowaną |
| Szklane zlewki 100-600 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 50-194-5690 | Klasa A; wypłukany kwasem i spłukany wodą dejonizowaną |
| Kule frezujące 20 mm | Retsch | 53680062 | Stal nierdzewna. Stosowany z mieleniem do mielenia polimerów kriogenicznie |
| 50 mL słoje do mielenia | Retsch | 14620216 | Stal nierdzewna. Stosowany z kulami mielącymi Mixer Mill 400 oraz 20 mm do kriogenicznego mielenia polimeru |
| 75 mL pipeta wolumetryczna | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2T | Klasa A; wypłukany kwasem i spłukany wodą dejonizowaną |
| Pompa powietrza i system bąbelkowania | Tetra | 77846 | Napowietrzaj wodę morską podczas równowagi przed inkubacją |
| Folia aluminiowa | Fisherbrand | 01-213-100 | Osłona do autoclavu i czystego przechowywania |
| Chlorek amonu (NH4Cl) | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | A661-500 | Skok składników odżywczych w wodzie morskiej |
| Bilans analityczny | Mettler | AT201 | Do ważenia podłoży eksperymentalnych i kontrolnych |
| Autoklaw | Tuttnauer | MFI-TTN-3870EA | Sterylizacja naczyń i zespołów pokrywek |
| Bazowy Micro-Oxymax 120VAC jednokanałowy | Columbus Instruments | 0135-8000 | Używany do przechowywania dodatniej kontroli i polimerów |
| Gaz kalibracyjny | Airgas | X03NI92P3000001 | Podstawowe standardowe mieszanki gazów; 2,7% dwutlenku węgla, 4,5% metanu – równoważą azot |
| Monitor komputerowy | Dell | 210-BMKK | Monitor hub Dell Pro 24 Plus USB-C. Używany z komputerem do uruchamiania oprogramowania Micro-Oxymax |
| Rękawice kriogeniczne | Thermo Fisher Naukowy, Tempshield, Rękawice Kriogeniczne | 11-394-306 | Używane do pracy z ciekłym azotem |
| Termometr tarczowy | Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac | 13-201-433 | Skalibrowany termometr do temperatury wody morskiej w momencie pobierania |
| Jednorazowe pipety | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-711-7M | Przepłukaj boki naczynia, aby uwolnić materiał |
| ENC52 Obudowa kontrolowana temperaturą i światłem | Columbus Instruments | 4740-4054 | Utrzymuj temperaturę i warunki oświetleniowe |
| Szczypce do kolb | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | S07387 | Używane do obsługi słoików do mielenia w ciekłym azocie |
| Kolby, 250 mL | DWK Nauki o Życiu | 14395-250 | Naczynia reaktora próbkowego |
| Fiolki z szklanymi powłokami z zamknięciami typu korek | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-339-26D | Przechowywanie próbek |
| Przenośny głębiomierz H22PX | West Marine, Norcross Marine | 6849368 | Określ głębokość miejsca zbierania wody morskiej |
| Przenośny GPS 73 | Garmin | 10-01504-00 | Wykorzystywane do określenia lokalizacji miejsca zbierania wody morskiej |
| HDPE Pan | Thermo Scientific, Nalgene | 13-359-26 | Używany do łukowania kwasowo szkła i wyrobów chemicznych; w roztworze 10% HCl |
| Kwas solny (roztwór wody kwaśnej) | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | A144-212 | Certyfikowany ACS Plus, 36,5 do 38,0%. Kontrola czujników CO2 oraz szkło z wymywaniem kwasem |
| Laminarny okap | Nauka o lotnictwie | FLOW-48-A | Minimalizacja zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu podczas przygotowania próbki |
| Large Niskin; Tylko butelka Beta Plus - 8,2L pozioma, PVC | Nauka przede wszystkim | 3-1980-H65 | Do zbierania wody morskiej z nabrzeża lub łodzi |
| Paska na ciekły azot | Thermo Fisher Naukowy, Bel Art Magic Touch 2 | 11-999-063 | Trzymaj ciekły azot i nbsp; |
| Zbiornik do transferu ciekłego azotu, 10 L | Thermo Scientific | TY509X2 | Przechowuj i wydawaj ciekły azot do kriomłynowania |
| Ciekły azot, przemysłowy, 22 PSI | Airgas | NI 180LT22 | Wykorzystywane do kruchości i mielenia polimerów |
| Mechaniczny potrząsacz sita | Humbolt, Grainger | 5DPL6 | Analiza sitowa dla rozkładu rozmiarów cząstek |
| Micro-Oxymax | Columbus Instrumentts | 7395-113-D64 | Silikonowa szczelka o-ring, metalowy port z 3 złączkami oraz nakrętką GL45 |
| Interfejs rozszerzający Micro-Oxymax 10 kanałów | Columbus Instruments | 0135-8101 | Komponent systemu respirometrycznego |
| Mikro-Oxymax Respirometr (czujnik CO2) | Columbus Instruments | 0135-8403 | Niedyspersyjna podczerwień |
| Młyn mieszający 400 | Retsch | 207450001 | Młyn mieszający 400. Wykorzystywane do kriogenicznego mielenia polimerów |
| Zmotoryzowany kontroler pipety | Eppendorf | 4430000018 | Transfer wody morskiej do zbiorników reaktora próbkującego |
| Bursztynowa butelka laboratoryjna o grubym pysku HDPE o charakterze wąskim usta, 1 L | Thermo Scientific, Nalgene | 02-923-5 | Dyskretna próbka wody morskiej z całej wody |
| Siatka nylonowa 20 mikronów | ELKO Filtering Co. | 41718 | Używany do przesiewania surowej wody morskiej w celu usunięcia większych, niejednorodnych cząstek |
| Otwarta orbitalna potrząsaczka | Thermo Fisher Scientific | SK4000 | Utrzymanie ruchu orbitalnego zbiorników reaktora podczas inkubacji |
| Komputer OptiPlex 5090 o małej formie | Dell | C0SL03 | Komputer Desktom używany do uruchamiania oprogramowania Micro-Oxymax |
| Miernik pH/Cond | Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic | 30046252 | Miernik pH i przewodności stołowej do pomiaru początkowego i ostatecznego inokulum wody morskiej |
| Butelka polietylenowa, 60 mL | Qorpak | PLC-03564 | Dyskretna próbka wody morskiej z filtrem |
| Fosforan potasu monozasadowy (KH2(PO4)) | Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents | BP362-500 | Skok składników odżywczych w wodzie morskiej |
| Precyzyjna równowaga | Sartorius | Practum2102-1S | Do ważenia tary i całej masy naczyń |
| Okrągły baloner, 20 l | Thermo Fisher Scientific | 02961A | Ługowanie kwasem do magazynowania wody morskiej |
| Gogle ochronne | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 19-181-513 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula | 01-257-567 | Stalowa łopatka laboratoryjna |
| Sita | Advantech, Grainger | 40PR18-40PR55 | Stalowe sita. Liczba i rozmiary sit zależą od testowanego materiału. |
| Celuloza Sigmacell, typ 101 | Sigma-Aldrich | 435236-250G | Proszek, podłoże z dodatnim kontrolowaniem |
| Wodorowęglan sodu | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | S233-500 | Sprawdzenie czujnika CO2 |
| Siarczyn sodu, bezwodni, 98% | Thermo Fisher Naukowe, Termonaukowe Chemikalia | AAA1793336 | Sprawdzenie czujnika CO2 |
| Termometr/sonda termistorowa | Fisherbrand | 15-079-700 | Sprawdź temperaturę inkubatora |
| Barometr precyzyjny z tarczą śledzenia | Fisherbrand | 14-648-51 | Rekordowe ciśnienie atmosferyczne na początku eksperymentu |
| Victor Medium Duty Hydrogen, Metan Dwustopniowy Regulator, CGA - 350 | AirGas | VIC0781-3559 | Regulator gazu kalibracyjnego |
| Kolby objętościowe, 2 L | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | FB4002000 | Klasa A; kwas wypłukiwał i spłukiwał wodą dejonizowaną. Używana do przygotowywania wody morskiej z dodatkiem odżywczym. |
| Wagi | Thermo Fisher Scientific | 02-202-101 | Polietylen |
Bibliografia
- Avio, C. G., Gorbi, S., Regoli, F. Plastics and microplastics in the oceans: From emerging pollutants to emerged threat. Marine Environ Res. 128, 2-11 (2017).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine Poll Bullet. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Andrady, A. L. Plastics and Environmental Sustainability. , John Wiley and Sons. (2015).
- Rosato, A., et al. Bacterial colonization dynamics of different microplastic types in an anoxic salt marsh sediment and impact of adsorbed polychlorinated biphenyls on the plastisphere. Environ Poll. 315, 120411(2022).
- Flury, M., Narayan, R. Biodegradable plastic as an integral part of the solution to plastic waste pollution of the environment. Curr Opin Green Sustain Chem. 30, 100490(2021).
- Chamas, A., et al. Degradation rates of plastics in the environment. ACS Sustain Chem Eng. 8 (9), 3494-3511 (2020).
- Allen, A. L., Mayer, J., Stote, R., Kaplan, D. L. Simulated marine respirometry of biodegradable polymers. J Environ Poly Degradat. 2, 237-244 (1994).
- Briassoulis, D., Pikasi, A., Papardaki, N. G., Mistriotis, A. Biodegradation of plastics in the pelagic environment of the coastal zone - Proposed test method under controlled laboratory conditions. Sci Tot Environ. 912, 168889(2024).
- Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum ASTM D6691-24a, ASTM International. , ASTM International. (2024).
- Ratto, J. A., Russo, J., Allen, A., Hebert, J., Wirsen, C. Biodegradable polymers in the marine environment: A tiered approach to assessing microbial degradability. Biopol Polysacch Agroprot ACS Symp Series. 786, 316-336 (2001).
- Standard Test Method for Weight Attrition of Plastic Materials in the Marine Environment by Open System Aquarium Incubations, ASTM-D7473-12. , ASTM International. (2012).
- Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment ASTM D7081-05 (withdrawn 2014). , ASTM International. (2005).
- American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 24th, Washington, DC. (2023).
- Scheiner, D. Determination of ammonia and Kjeldahl nitrogen by indophenol method. Water Res. 10 (1), 31-36 (1976).
- Murphy, J., Riley, J. P. A single-solution method for the determination of soluble phosphate in seawater. J Marine Biol Assoc U K. 37, 9-14 (1958).
- Kirsten, W. Organic Elemental Analysis: Ultramicro, Micro, and Trace Methods. , Academic Press/Harcourt Brace Jovanovich. (1983).
- Parsons, T. R., Maita, Y., Lalli, C. Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. , Pergamon Press. (1989).
- Standard Test Methods for Particle Size (Sieve Analysis) of Plastic Materials, ASTM D1921-96. , ASTM International. (1996).
- Gilbert, J. A., et al. The taxonomic and functional diversity of microbes at a temperate coastal site: a 'multi-omic' study of seasonal and diel temporal variation. PLoS ONE. 5 (11), e15545(2010).
- Chafee, M., et al. Recurrent patterns of microdiversity in a temperate coastal marine environment. ISME J. 12 (1), 237-252 (2018).
- Jannasch, H. W., Eimhjellen, K., Wirsen, C. O., Farmanfarmaian, A. Microbial degradation of organic matter in the deep sea. Science. 171 (3972), 672-675 (1971).
- Zumstein, M. T., et al. Biodegradation of synthetic polymers in soils: Tracking carbon into CO2 and microbial biomass. Sci Adv. 4, eaas9024(2018).
- Zumstein, M. T., Narayan, R., Kohler, H. P. E., McNeill, K., Sander, M. Dos and do nots when assessing the biodegradation of plastics. Science. 366 (6470), 9967-9969 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
