Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

31 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Streszczenie

Obrazowanie wapnia jest kluczowe do badania dynamiki nerwowej i funkcji mózgu. Jednak obecne metody obrazowania wapnia u larw Drosophila są trudne ze względu na artefakty ruchu i wymagania specjalistycznego sprzętu. Przedstawiamy praktyczną, niskokosztową metodę wykonywania obrazowania wapnia in vivo i ex vivo u larw Drosophila w trzecim stadium, wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchamiania próbek. Udostępniamy także niestandardowe skrypty R oraz ramy do analizy danych, ułatwiające pomiary zmian wapnia w różnych warunkach eksperymentalnych. Dzięki temu podejściu z powodzeniem zarejestrowaliśmy przejściowe zjawiska wapnia w parze larwalnych neuronów OUN z minimalnymi artefaktami ruchu, wykazując powtarzalność w różnych preparatach. Metoda ta jest kompatybilna ze standardowymi systemami konfokalnymi z obrotowym dyskiem i może być adaptowana do samodzielnych lub komercyjnych układów dwufotonowych, co sprawia, że jest dostępna dla laboratoriów dysponujących różnymi zasobami. Takie podejście może zwiększyć dostępność do badań obrazowania wapnia larw i może być dostosowane do badania efektów zarówno bodźców zewnętrznych, takich jak zapachy, jak i wewnętrznych, takich jak neuromodulatory.

Wprowadzenie

Zrozumienie dynamiki wapnia w neuronach jest kluczowe dla rozwikłania złożonych mechanizmów leżących u podstaw sygnalizacji nerwowej i funkcjonowania mózgu, ponieważ jony wapnia odgrywają kluczową rolę w modulacji aktywności neuronów i wywoływaniu odpowiedzi komórkowych na bodźce. Dynamikę wapnia w neuronach można monitorować za pomocą obrazowania wapnia, które dostarcza w czasie rzeczywistym informacji o sygnalizacji pośredniczonej wapniem u szerokiego zakresu organizmów, w tym larwy Drosophila. Larwa Drosophila wyłania się jako potężny model do badania funkcji obwodów leżących u podstaw zachowań. Jest jednym z zaledwie trzech organizmów, dla których wygenerowano kompletny synaptyczny konektom mózgu1. Larwa jest podatna na szereg zaawansowanych narzędzi umożliwiających obrazowanie i manipulację neuronami zarówno na poziomie całego mózgu, jak i pojedynczego neuronu 2,3.

Możliwość pomiaru dynamiki wapnia w neuronach larwalnych Drosophila za pomocą obrazowania wapnia była kluczowa dla postępu badań neurobiologicznych4. Najnowsze osiągnięcia w obrazowaniu wapnia umożliwiły pomiar dynamiki wapnia na poziomie pojedynczych synaps u larwy5 do wieloneuronalnych zapisów u larw6. Obrazowanie wapnia można wykonać in vivo, gdzie zdarzenia wapnia są rejestrowane w naturalnych kontekstach fizjologicznych całej larwy 4,7,8,9, lub ex vivo, gdzie zdarzenia wapnia są rejestrowane w rozczłonkowanych tkankach larwalnych zachowanych w symulowanych warunkach fizjologicznych10. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy wykorzystali różne wersje metody obrazowania wapnia u larw Drosophila, aby odkryć fundamentalne mechanizmy obwodów nerwowych, doznań, uczenia się i pamięci oraz zachowań 8,11,12,13,14,15,16,17 . Jednak badania obrazowania wapnia larw są ograniczone ze względu na potrzebę specjalistycznego sprzętu oraz problemy z interpretacją danych spowodowane artefaktami ruchowymi.

Przedstawiamy tutaj opłacalną i łatwą do wdrożenia metodologię zarówno obrazowania wapnia in vivo, jak i ex vivo u larw Drosophila melanogaster w trzecim stadium. Obrazujemy dynamikę wapnia w Keystone-LN, inhibującym neuronze węchowym18,19, w całych preparatach larwalnych, aby zaprezentować obrazowanie wapnia in vivo, oraz w rozciętych mózgach larw, aby zaprezentować obrazowanie wapnia ex vivo. Całe larwy i rozczłonkowane mózgi pozostają żywotne i reagujące przez około 10-15 minut w naszych warunkach obrazowania, co pozwala na pozyskanie wielu badań bodźców na próbkę. Aby sprostać wyzwaniu unieruchomienia całych larw lub próbek tkanek, jednocześnie utrzymując żywotność tkanek i zmniejszając zmienność eksperymentalną, zoptymalizowaliśmy wykorzystanie GLUture, biokompatybilnego cyjanoakrylanowego kleju tkankowego.

W porównaniu z tradycyjnymi metodami unieruchamiania larw, takimi jak osadzanie lub przypinanie agarozą, to podejście oparte na kleju redukuje artefakty ruchu, jednocześnie zachowując żywotność tkanek20,21; W porównaniu do systemów obrazowania dwufotonowego układ obrotowego dysku obniża koszty instrumentacji i poprawia dostępność dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. Na koniec opisujemy proste podejścia do obrazowania, połączone z niestandardowymi skryptami R do analizy danych. Nasze podejście może zwiększyć dostępność badań obrazowania wapnia larw i może być dostosowane do badania efektów zarówno bodźców zewnętrznych, takich jak zapachy, jak i bodźców wewnętrznych, takich jak neuromodulatory.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie larw Drosophila w trzecim stadium do obrazowania wapnia

  1. Utrzymuj muchy na standardowej karmie muchowej (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 25 °C, z wilgotnością względną (RH) 50-60% i 12-godzinnym cyklem światła/ciemności.
  2. Aby wyrazić białko czerwone fluorescencyjne (RFP) do identyfikacji neuronów oraz GCaMP6f (wskaźnik wapnia) w interesującym neuronze ('X'), krzyżują dziewicze samice X-Gal4 z samcami noszącymi UAS-GCaMP6f i UAS-tdTomato22.
    UWAGA: W tym badaniu linia Keystone-Gal4 została wykorzystana do sterowania ekspresją tdTomato i GCaMP6f w pojedynczej parze hamujących lokalnych neuronów (Keystone-LN) w mózgu larwalnym18,19.
  3. Po pozwoleniu samcom i samicy na kopulację i składanie jaj przez 48 godzin, przenieś dorosłe do świeżej fiolki.
  4. Larwy trzeciego stadium (około 120 godzin po złożeniu jaj) należy wyodrębnić na roztworze sacharozy 15%. Użyj mikropipety P1000, aby przenieść unoszące się larwy do szklanej zlewki o pojemności 1 000 mL.
  5. Myj larwy 3-4 razy, zastępując wodę w zlewce za każdym razem na 800 ml świeżej wody destylowanej. Pozwól larwam odpocząć przez 10 minut, zanim przejdziesz do dalszej części protokołu.

2. Protokół głodzenia dla larw Drosophila w trzecim stadium (w przypadku testów głodowych vs. niegłodzących)

  1. Przygotuj dwie komory karmienia, umieszczając mały kwadrat chusteczki laboratoryjnej w 6-centymetrowych szalkach Petriego. W warunkach niegłodowych dodaj 350 μL roztworu sacharozy 0,2 M; w warunkach głodowych dodaj 350 μL wody destylowanej.
  2. Przenieś równą liczbę umytych larw do każdej komory żerowej. Pozwól larwam żerować się sacharozą (niegłodzącą) lub wodą destylowaną (głodzoną) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

3. Obrazowanie wapnia in vivo

UWAGA: Wszystkie eksperymenty z użyciem kleju tkankowego powinny być przeprowadzane zgodnie ze standardowymi praktykami bezpieczeństwa laboratoryjnego. Wymagany jest osobisty sprzęt ochrony osobistej (PPE), w tym rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny oraz gogle ochronne lub przyłbica na twarz; Rękawiczek bawełnianych należy unikać ze względu na reakcje egzotermiczne z cyjanoakrylanem. Unikaj kontaktu kleju ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. W przypadku łączenia skóry mocz to miejsce w ciepłej wodzie z mydłem i delikatnie rozdzielaj; W przypadku ekspozycji oczu płucz letnią wodą przez ≥5 minut i natychmiast zgłoś się po pomoc medyczną. Klej należy trzymać z dala od otwartych płomieni i wysokiej temperatury, ponieważ utwardzony klej może uwalniać drażniące opary w przypadku spalenia. Klej przechowywaj w temperaturze ≤30 °C, z dala od wilgoci i bezpośredniego światła słonecznego, w szczelnie zamkniętym pojemniku, gdy nie jest używany.

  1. Przygotuj bufor obrazowy wapnia o następującym składzie: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glukoza 10 mM oraz HEPES 10 mM. Przechowuj w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana.
    UWAGA: Zmodyfikowana sól fizjologiczna zawierająca 110 mM NaCl jest powszechnie akceptowaną formułą do rozwarstwiania i obrazowania larwalnego OUN i mieści się w typowym zakresie stosowanym w badaniach elektrofizjologicznych i obrazowych (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.
  2. Na szklanym szkle mikroskopu o grubości 24 x 50 mm (1,5 mm) stworzyć studnię, używając wazeliny podanej ze strzykawki.
  3. Umieść niewielką kroplę miejscowego kleju tkankowego (60% 2-oktyl i 40% n-butylowy cyjanoakrylan) na środku szkła pokrywy. Rozprowadz klej równomiernie w cienką, jednolitą warstwę za pomocą szklanego pręta.
  4. Ostrożnie przenieś jedną larwę na klej za pomocą szczotki lub cienkiego drutu. Delikatnie przyciskaj brzuszną stronę larwy do kleju. Pozwól klejowi wyschnąć, aby larwa była całkowicie unieruchomiona.
  5. Gdy larwa zostanie unieruchomiona, umieść szkło pokrywkowe na odwróconym stopniu mikroskopu (Rysunek 1A).

4. Obrazowanie wapnia ex vivo

  1. Przygotuj bufor do sekcji larw o następującym składzie: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glukoza 10 mM oraz HEPES 10 mM. Przechowuj w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana.
  2. Przeanalizuj rozwarstwienia mózgu opisane przez Ishimoto i Sano10. Krótko, używając szczotki lub cienkiego drutu, przenieś jedną larwę do 3,5 cm szalki Petriego, na której na dnie nałożono elastomer silikonowy.
  3. Pod mikroskopem sekcyjnym ustaw larwę tak, by brzuszna strona była skierowana do góry i zlokalizuj mózg. Za pomocą nożyczek do sekcji wykonaj cięcie około jednej trzeciej długości przedniego końca larwy. Zrób kolejne cięcie przy haczykach ustnych. Zachowaj mózg podczas usuwania haczyków na ciało i usta (zaadaptowane z Janelia Flylight Protocol27).
  4. Zidentyfikuj skupisko nerwów zawierających neurony ruchowe z rdzenia brzusznego. Za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij mózg od reszty rozciętej larwy. Przytnij nadmiar tkanek z mózgu.
    UWAGA: Delikatne dotykanie – nadmierna siła może spowodować uszkodzenie tkanek, ponieważ mózg jest delikatny.
  5. Przygotuj szkło do mikroskopu z klejem tkankowym do obrazowania wapnia, zgodnie z krokami 3.2 do 3.3.
  6. Za pomocą mikropipety P10 ostrożnie aspiruj rozcinany mózg 5 μL roztworu rozdziału z szalki Petriego. Powoli wypychaj mózg na klej. Zanim klej wyschnie, ułóż mózg w pozycji grzbietowej do góry (z dwoma płatami mózgu skierowanymi w dół, a grzbietowym rdzeniem brzusznym skierowanym do góry).
  7. Za pomocą mikropipety P200 przenieś 100 μL buforu obrazowania wapnia na unieruchomiony mózg larwy na szybę osłonową.
  8. Umieść szkło pokrywkowe z mózgiem na odwróconym mikroskopie, połączonym z obrotowym panelem konfokalnym skanerem oraz kamerą CCD do obrazowania wapnia (Rysunek 1B).
    UWAGA: W przypadku przygotowań ex-vivo upewnij się, że mózg jest prawidłowo ustawiony, gdy klej jest jeszcze mokry. Aby uzyskać optymalną jakość obrazu, ułóż mózg tak, aby ROI był najbliżej obiektywu mikroskopu i unikaj nakładania nadmiaru kleju w pobliżu ROI.

5. Protokół obrazowania

  1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania wapnia za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wykonuj zdjęcia za pomocą obiektywu 10x/1.4 NA z filtrem przełączającym się między laserem GFP (wzbudzenie 488 nm, intensywność 70%, emisja 525 nm/50 m, OD8) a laserem RFP (wzbudzenie 561 nm, intensywność 50%, emisja 610 nm/75 m, OD8). Ustaw ekspozycję na 100 ms do 1000 ms, wzmocnienie na poziomie 50% odpowiadającej wartości ekspozycji oraz współczynnik binningu 2 podczas przechwytywania obrazu.
  2. Ustawij mikroskop na 10-krotne powiększenie i zlokalizuj mózg pod jasnym polem oświetleniowym.
  3. Zidentyfikuj interesujący neuron, wyszukując sygnał tdTomato za pomocą lasera RFP (wzbudzenie ustawione na 561 nm).
    UWAGA: Wybierz nasycenie i zmniejsz gammę, aby ustawić właściwą wartość ekspozycji.
  4. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania (ROI) należy przełączyć się na laser GFP (wzbudzenie ustawione na 488 nm), aby przechwycić sygnały GCaMP6f. Upewnij się, że sygnały tdTomato i GCaMP są współlokalizowane przed przechwyceniem obrazów stosu obu kanałów.
    UWAGA: Dostosuj ustawienia obrazu dla nagrań stosowych tdTomato i GCaMP6f, aby zmaksymalizować fluorescencję.
  5. Rejestruj jednocześnie dwie oddzielne nagrania sygnałów tdTomato i GCaMP6f w seriach czasowych z prędkością 0,5 klatki na sekundę (łącznie 2 minuty).
    UWAGA: Rozcięty mózg larwy pozostaje żywotny przez około 10 minut w tych warunkach buforowania; Po tym czasie sygnały się pogarszają.
  6. Gdy próbka jest gotowa do obrazowania, rejestruj jednocześnie dwa oddzielne nagrania w szeregach czasowych sygnałów tdTomato i GCaMP6f z prędkością 0,5 klatki na sekundę (łącznie 2 minuty).
    UWAGA: Rozcięty mózg larwy pozostaje żywotny przez około 10 minut w tych warunkach buforowania; Po tym czasie sygnały się pogarszają.
    UWAGA: Podczas analizy ilościowej zalecamy zwiększenie mocy lasera oraz dostosowywanie wzmocnienia ekspozycji detektora w razie potrzeby, przy zachowaniu liniowego skalowania intensywności.

6. Przetwarzanie i analiza danych

  1. Otwórz i zaimportuj stosy sygnałów tdTomato i GCaMP6f do ImageJ (NIH)28.
  2. Aby zidentyfikować właściwy obszar zainteresowania (ROI), połącz sygnały tdTomato i GCaMP6f, aby potwierdzić kolokalizację. Po weryfikacji rozdziel kanały tdTomato i GCaMP6f.
  3. W górnym menu wybierz Wtyczki | Nowy i kliknij na Makra , aby zainicjować nowe makro. Następnie zaimportuj niestandardowe makra oparte na ROI do ImageJ. Wybierz stos GCaMP6f i naciśnij Uruchom, aby analizować wapń.
  4. Przetwarzaj sygnały fluorescencyjne za pomocą niestandardowego makro ImageJ (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). Makro najpierw generuje projekcje maksymalnej intensywności, wykonuje korekcję ruchu za pomocą wtyczki StackReg (tryb rejestracji sztywnej )29 oraz stosuje korektę wybielacza.
  5. Pojawi się okienko "Wymagane działania" z prośbą o ręczny wybór ROI, co pozwala użytkownikom ręcznie narysować szeroki ROI. Kliknij OK , aby kontynuować analizę. Aby wykonać korekcję ruchu, upewnij się, że prostokątne pudełko pokrywa cały zwrot z inwestycji we wszystkich klatkach dla dokładnej korekcji ruchu, zachowując jednocześnie lokalny kształt przestrzenny i zwrot z inwestycji w różnych klatkach.
    UWAGA: Nagrania były rejestrowane w ImageJ przy użyciu StackReg. Gdy ruch w płaszczyźnie był duży (skumulowane przesunięcie XY > 1 μM) lub osiowy dryf Z prowadził do utraty ostrości, rejestracja stawała się niewiarygodna lub próbka całkowicie traciła się w oknie obrazowania. W związku z tym próbki wykazujące ekstremalny dryf lub spadek sygnałów wapnia (>30%) były automatycznie oznaczane i wykluczane z dalszej analizy, aby zapewnić dokładne pomiary aktywności neuronalnej. Te progi są zgodne z powszechnie stosowanymi metodami kontroli jakości w badaniach obrazowania wapnia 30,31,32,33. Wykluczenie zapewniało również, że do analiz wykorzystywano wyłącznie stabilne nagrania z wiarygodnymi przejściami wapnia powiązanymi ze stymulacją.
  6. Do analizy należy wyodrębnić ślady fluorescencji z ręcznie definiowanych cyklicznych ROI, prowadzone przez autokorelację pikseli; zwroty z inwestycji obejmują całe pole neuronów kluczowych.
    1. Wyodrębnij surowe dane intensywności fluorescencji dla dwóch fluoroforów: GCaMP6f/GFP i tdTomato/RFP, używając niestandardowych makro w ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, zobacz Tabelę materiałów).
    2. Zastosuj przesuwane okno o zwrotie z inwestycji 20 x 20 pikseli i rozmiarze kroku 10 pikseli na polu widzenia. Dla każdego ROI makro oblicza: (1) intensywność we wszystkich klatkach, (2) różnicę wahań bazowych (czyli różnicę między maksymalną a minimalną wartością intensywności w pierwszych 10 klatkach) oraz (3) maksymalną zmianę intensywności klatka do klatki (ΔF). ROI pokazujące wahania intensywności poniżej 10 jednostek zostaną wyeliminowane, a do dalszej analizy wybrane zostaną tylko najostrzejsze wartości ΔF.
    3. Normalizuj ślady fluorescencji za pomocą następujących metod:
      1. Normalizacja Fmax i Fmin: Oblicz znormalizowane Δ według wzoru:
        figure-protocol-1
        Gdy F to surowa fluorescencja w każdym punkcie czasowym, Fmin to minimalna fluorescencja (punkt odniesienia), a Fmax to maksymalna fluorescencja podczas rejestracji.
      2. Normalizacja ΔF/F 0: Dodatkowo wykonaj normalizację ΔF/Fo, gdzie Fo (linia bazowa) jest określana przez pierwsze 10 klatek każdego nagrania, według wzoru:
        figure-protocol-2
        Gdzie Ft to fluorescencja w czasie t, a F0 to wartość bazowa obliczona z pierwszych 10 klatek.
  7. Po wyodrębnieniu sygnałów GCaMP6f kliknij lewym przyciskiem i wybierz Wszystko, wytnij i wklej , aby przenieść wszystkie wartości do nowego arkusza Excela. W górnym menu wybierz Data | Tekst do kolumn. Pojawi się wyskakujące okienko z kreskiem "Tekst-do-kolumny". W kroku 1 wybierz Ograniczono, a następnie kliknij Dalej. W kroku 2, w sekcji Ograniczniki, wybierz Tabulator i Przecinek, a następnie kliknij Dalej. W kroku 3 wybierz Zakończ.
    OPCJONALNIE: Aby wyrysować znormalizowane sygnały wapnia, podświetl Fnorm_FminFmax i wybierz Scatterplot.
  8. Szukaj pliku .csv zawierającego: (1) surowe wartości fluorescencji F, (2) ΔF/Fo oraz (3) Fnorm (znormalizowaną intensywność fluorescencji). Zorganizuj ostateczny zbiór danych w cztery kolumny: (1) czas (klatki), (2) stan próby (głodzony lub karmiony), (3) replikuj ID (pojedyncza próbka) oraz (4) znormalizowana intensywność (wartości Fnorm skalowane od 0 do 1).
  9. Na koniec przeprowadź analizę i wizualizację danych w R z użyciem niestandardowych skryptów R (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. zobacz Tabelę materiałów).
    1. Zaimportuj niestandardowy skrypt R do nowego projektu R. Upewnij się, że wymagane pakiety R, w tym ggplot2, dplyr i readr, są zainstalowane i zaktualizowane przed przeprowadzeniem analizy.
    2. Zaczynając od linii 1 niestandardowego skryptu R, naciśnij Run ciągłie, aby przeprowadzić analizę wapnia. Upewnij się również, że wyjście zawiera mapy ciepła ilustrujące znormalizowaną intensywność wapnia dla pierwszych 30 klatek, 60 klatek oraz wszystkich klatek zapisu szeregu czasowego, a także wykresy pudełkowe pokazujące medianę znormalizowanych intensywności.
    3. Oceń znaczenie znormalizowanej intensywności wapnia za pomocą testu Mann-Whitney U .

7. Utylizacja odpadów i dekontaminacja

  1. Po eksperymentach usuń brudne zanieczyszczenia z narzędzi i powierzchni pod bieżącą wodą, a następnie dezynfekuj 70% etanolem lub 10% wybielaczem, a następnie sterylną wodą. Pracuj na zdezynfekowanej powierzchni i myj ręce po zdjęciu rękawiczek; Nie jedz ani nie pij w laboratorium.
  2. Przed utylizacją umieść tkanki larwalne i zanieczyszczone jednorazowe przedmioty w workach z zagrożeniem biologicznym i autoklawie.
  3. Wyrzucaj w pełni utwardzone odpady klejowe do zwykłych śmieci; Nieutwardzone kleje i skażone jednorazowe materiały muszą być zbierane w szczelnym, oznakowanym pojemniku na niebezpieczne odpady chemiczne.
  4. Wszystkie ostre przedmioty (ostrza, igły, tłuczone szkło) umieść w pojemniku odpornym na przebicie ostrych przedmiotów.
  5. Zbieraj łatwopalne rozpuszczalniki (etanol, aceton) w oznakowanych, łatwopalnych pojemnikach na odpady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować nasze podejście do obrazowania wapnia larw, z powodzeniem zastosowaliśmy je zarówno do in vivo, jak i ex-vivo preparatów larw Drosophila (Rysunek 2 i Rysunek 3, Wideo 1, Wideo 2, Wideo 3 i Wideo 4). Zmierzyliśmy dynamikę wapnia u larw Drosophila w trzecim stadium ekspresyjnym GCaMP6f i Td-Tomato w jednej parze Keystone-LN w mózgu larwy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisujemy podejście zarówno do obrazowania wapnia in vivo , jak i ex vivo u larw Drosophila melanogaster w trzecim stadium. Obrazowaliśmy dynamikę wapnia u Keystone-LN, hamującego neuronu lokalnego u larwy Drosophila . Mierzyliśmy dynamikę wapnia Keystone-LN w całych preparatach larwalnych (in vivo) oraz w rozczłonkowanych preparatach mózgu larw (ex vivo) (Rysunek 1).

Wcześniej przeprowadziliśmy jakościow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr. Jeffreyowi Harperowi, który udostępnił nam obrotowy dyskowy mikroskop konfokalny w swoim laboratorium do tych eksperymentów. Jesteśmy wdzięczni za dar w postaci wędki muchowej: w; UAS-GCaMP6f/CyO, płaczcie; UAS-tdTomato od dr Jung Hwan Kima. Prace te były wspierane ze środków National Science Foundation w ramach numerów 2341202 i 2129234. Rysunek 1 został stworzony za pomocą Biorender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fly Stocks & Fly Stock Konserwacja
Karma dla muchy NutriflyGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoPrezent od dr JH Kim 
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Odczynniki do protokołu Starvation
6 cm szalka PetriegoGenesee Scientific32-106G
SacharozaMillipore SigmaS0389-500G
Odczynniki do obrazowania i rozcinania bufora
Chlorek wapniaJ.T. Baker, Avantor SciencesJT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-glukozaThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hydroksyetylo)-1-piperazynylo]-kwas etansulfonowyJ.T. Baker, Avantor SciencesJT4018-1CAS: 4018-01, 100g
Chlorek magnezuVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
Chlorek potasuThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
Chlorek soduEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Narzędzia i odczynniki do sekcji
Bufor rozcinającyTekst przedstawiony
Szalki Petriego Olympus, 60 x 15mm z wentylacjąGenesee Scientific32-105
Sylgard 184 Elastomer BaseNauki o mikroskopii elektronowej24236-10A
Sylgard 184 Środek do utwardzania bazy elastomerowejNauki o mikroskopii elektronowej24236-10B
Pęseta typu 5, EMSNauki o mikroskopii elektronowej78320-5
Nożyczki sprężynowe Vannas - 3mm krawędzi tnącejNarzędzia Nauki Ścisłej15000-00
Sprzęt obrazujący i montażowy/odczynniki
Moduł skanera konfokalnegoYokogawaCSU-W1Podłączony do mikroskopu
Bufor obrazowaniaTekst przedstawiony
Mikroskop odwróconyLeica MicrosystemsDMi8 Podłączony do obrotowego dysku konfokalnego skanera oraz kamery CCD
Szkło okładkowe mikroskopu, 24mm x 50mm, #1,5 grubościGlobe Scientific Inc.1415-15
MWI Veterinary GLUTURE Klej MiejscowyFisher ScientificNC0632797
Czysta wazelinaWalgreens912556
Linki do publicznie dostępnych zasobów
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Film z protokołem Janelii Flylighthttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Bibliografia

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Larwa Drosophilaobrazowanie in vivoobrazowanie ex vivokonfokalny mikroskop z dyskiem obrotowymkorekcja ruchufluorescencja GCaMP6funieruchomienie tkankianaliza ROI
Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.