W protokole przedstawiono metodę oceny parametrów reaktywnego przekrwienia postokluzyjnego w skórze znieczulonego szczura za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym i inwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
W protokole przedstawiono metodę oceny parametrów reaktywnego przekrwienia postokluzyjnego w skórze znieczulonego szczura za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym i inwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi.
Laserowe obrazowanie kontrastowe plamki (LSCI) to nowoczesna, nieinwazyjna technika oceny perfuzji mikronaczyniowej u ludzi i zwierząt laboratoryjnych. Połączenie LSCI z inwazyjnym pomiarem ciśnienia krwi (BP) i testem okluzji naczyniowej pozwala na badanie postokluzyjnej reaktywnej hiperemii (PORH), zapewniając ocenę rezerwy przepływu krwi mikronaczyniowej i reaktywności naczyniowej. W tym artykule przedstawiono technikę wykorzystania LSCI do rejestrowania i wizualizacji PORH w tylnej łapie szczura w znieczuleniu ogólnym. Specjalny pneumatyczny mankiet jest nadmuchiwany, aby stworzyć tymczasową (180 s) niedrożność naczyń na poziomie kości piszczelowej. Ocena późniejszego PORH (szczytowe wskaźniki przekrwienia i kinetyczne) może dostarczyć dodatkowych informacji na temat mechanizmów i nasilenia badanego procesu patologicznego (wstrząs krążenia, niewydolność serca, nadciśnienie itp.) lub zidentyfikować efekty naczyniowe nowego leku, które nie są widoczne podczas oceny perfuzji w spoczynku. Inwazyjne monitorowanie ciśnienia tętniczego umożliwia obliczenie przewodnictwa naczyniowego skóry i uwzględnienie zmian w hemodynamice układowej, co jest szczególnie ważne w eksperymentalnych modelach krytycznej choroby. Zademonstrowane zostanie również zastosowanie tego podejścia do identyfikacji dysfunkcji mikronaczyniowej w szczurzym modelu wstrząsu krwotocznego.
Dysfunkcja mikrokrążenia bierze udział w patogenezie wielu chorób sercowo-naczyniowych, endokrynologicznych i innych, upośledzając perfuzję i dotlenienie tkanek oraz zakłócając mechanizmy regulacji naczynioruchowej hemodynamiki ogólnoustrojowej (na przykład w nadciśnieniu)1. Zaburzenia mikrokrążenia mają również duże znaczenie patofizjologiczne w mechanizmach dysfunkcji narządowej u pacjentów w stanie krytycznym z urazami, sepsą i różnego rodzaju wstrząsami (krwotocznymi, septycznymi, kardiogennymi itp.)Rozdział 2.
Obecnie w badaniach klinicznych i przedklinicznych do nieinwazyjnej oceny perfuzji tkanek i funkcji mikrokrążenia stosuje się kilka metod opartych na laserze: laserowa przepływomierz dopplerowska (LDF), laserowe obrazowanie dopplerowskie (LDI/LDPI) i laserowe obrazowanie kontrastowe (LSCI). Wśród nich LSCI jest najbardziej obiecujący do nieinwazyjnej oceny perfuzji skóry w klinice. Ma ona wyraźną przewagę nad LDF i LDI/LDPI, ponieważ metoda ta jest łatwa do zastosowania w praktyce i oferuje wizualizację całego obszaru badań zarówno z wysoką rozdzielczością przestrzenną, jak i czasową3. LSCI to technika, która wykorzystuje światło laserowe do tworzenia wzorów plamek, które są następnie analizowane w celu wizualizacji dynamiki przepływu krwi. Zapewnione są oceny mikrokrążenia w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości, które są niezbędne w różnych obszarach badań, takich jak neurobiologia4, chirurgia jamy brzusznej5, dermatologia6 i inne badania naczyniowe 7,8, zarówno w warunkach klinicznych, jak i eksperymentalnych.
Prosta ocena wartości perfuzji skóry w spoczynku jest często mało pouczająca dla identyfikacji zaburzeń mikronaczyniowych. Wynika to zarówno z nieodłącznych cech funkcjonalnych krążenia skórnego (duża zmienność, zależność od temperatury, stresu i innych czynników), jak i "fałszywie normalnej" perfuzji tkanek podczas kompensacyjnej odpowiedzi organizmu (na przykład wzrost pojemności minutowej serca we wczesnych stadiach wstrząsu septycznego). Dodatkowe wykorzystanie standardowego obciążenia funkcjonalnego pozwala na lepszą ocenę mikrokrążenia i identyfikację dysfunkcji mikrokrążenia ukrytej w warunkach spoczynku1. Wiadomo również, że LSCI jest przydatny w ocenie mikrokrążenia skórnego pod wpływem bodźców farmakologicznych9.
Połączenie LSCI z testem okluzji naczyniowej pozwala na nieinwazyjną ocenę zjawiska postokluzyjnej reaktywnej hiperemii (PORH), która odzwierciedla ważne parametry funkcjonalne mikrokrążenia, w szczególności rezerwę przepływu krwi i reaktywność mikrokrążenia10. Podejście to jest szeroko stosowane w badaniach klinicznych w celu identyfikacji funkcjonalnych nieprawidłowości mikrokrążenia, które nie są widoczne na podstawie wyjściowych pomiarów perfuzji11, ale ocena PORH jest rzadka w przedklinicznych badaniach na zwierzętach 12,13. W porównaniu z badaniami klinicznymi, zastosowanie testu okluzji naczyń krwionośnych w eksperymencie in vivo daje badaczowi dodatkowe możliwości oceny mechanizmów PORH, patogenezy ciężkich chorób oraz farmakodynamiki leków wazoaktywnych. Oczywiście, możliwości te muszą mieścić się w granicach współczesnych standardów bioetycznych dotyczących humanitarnego traktowania zwierząt.
Protokół ten przedstawia metodę oceny parametrów PORH w skórze znieczulonego szczura za pomocą LSCI i inwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi. Ta ostatnia polega na cewnikowaniu tętnicy szyjnej szczura i umożliwia pomiar średniego ciśnienia tętniczego (MAP) i częstości tętna. Dodatkowo można pobrać próbki krwi tętniczej do badań laboratoryjnych (np. gazometrii krwi). Warto zauważyć, że protokół ten jest przede wszystkim zorientowany na ostry eksperyment, który nie polega na wybudzeniu zwierzęcia z narkozy po zakończeniu procedur eksperymentalnych (na przykład modelowania krytycznej choroby). Proponowana przez nas metoda oceny mikrokrążenia u szczurów jest stosunkowo prosta i będzie szczególnie przydatna w badaniach porównawczych fizjologii i patofizjologii naczyń krwionośnych, w tym w ocenie dysfunkcji śródbłonka, a także w badaniach przedklinicznych nowych leków wazoaktywnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisane poniżej procedury zostały wykonane w ramach protokołu zatwierdzonego przez Komisję ds. Oceny Etycznej Federalnego Centrum Badawczo-Klinicznego Medycyny Intensywnej Terapii i Rehabilitacji.
1. Przygotowanie mankietu pneumatycznego do niedrożności naczyń
2. Przygotowanie cewnika tętniczego, stacji roboczej i narzędzi chirurgicznych
3. Znieczulenie i postępowanie przedoperacyjne
UWAGA: Wszystkie środki znieczulające mogą hamować oddychanie i krążenie. Właściwe dawkowanie w zależności od gatunku zwierzęcia, szczepu, wieku i stanu zdrowia ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia śmiertelnego przedawkowania. Personel musi być przeszkolony w zakresie znieczulenia zwierząt i monitorowania parametrów życiowych. Procedury muszą zostać zatwierdzone przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) lub równoważny organ etyczny. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z igłami, skalpelami i innymi ostrymi narzędziami. Zawsze używaj pojemnika na ostre przedmioty do natychmiastowej utylizacji. Nigdy nie nawijaj igieł. Należy pamiętać o ryzyku zranień igłami, które mogą przenosić czynniki odzwierzęce lub powodować urazy fizyczne.
4. Cewnikowanie lewej tętnicy szyjnej
5. Inwazyjny pomiar ciśnienia krwi
6. Pomiar perfuzji skóry za pomocą LSCI
7. Test okluzji naczyniowej i ocena PORH
(1)
(2)
(3)8. Procedury doświadczalne i powtarzane pomiary
9. Zakończenie eksperymentu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisana powyżej metoda oceny funkcji mikrokrążenia została przez nas zastosowana w serii doświadczeń z modelowaniem wstrząsu krwotocznego (utrata krwi o 35% obliczonej objętości krwi) u samców szczurów rasy Wistar o masie ciała 250-300 g. W grupie zwierząt z krwotokiem (HS, n = 13) ocenę parametrów PORH przy jednoczesnym monitorowaniu inwazyjnego ciśnienia tętniczego wykonano 30 min po zakończeniu krwotoku. W grupie kontrolnej zwierząt operowanych pozorowo (Sham, n = 10) krwotok nie zosta...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W tym artykule opisano zmodernizowaną technologię oceny mikrokrążenia skórnego i reaktywności naczyniowej w eksperymencie in vivo na gryzoniach. Aby skutecznie i ustandaryzować stosowanie tej metody w badaniach fizjologicznych i farmakologicznych, należy wziąć pod uwagę kilka dodatkowych kwestii. W powyższym protokole szczury są znieczulane kombinacją tiletaminy + zolazepamu + ksylazyny, co jest podyktowane głównie lokalnymi standardami pracy ze zwierzętami laboratoryjnymi i ograniczonym dostępem do buprenorfiny, ketamin...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Prace te były wspierane przez Rosyjską Fundację Naukową w ramach projektu 24-25-00310.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła atraumatyczna ze szwem chirurgicznym nylonowym, 4C-0,5x16-4/0-N | Medtekhnika, Rosja | N/A | Niebieski. Długość 75 cm. USP 4/0 (MP1.5). Do szycia rany pooperacyjnej |
| Cewnik do tętnicy szyjnej szczura z igłą strzykawkową z końcem 22 G | SciCat, Rosja | N/A | PE-50, długość 12 cm, OD=0,9 mm, ID= 0,6 mm.Z jednym pierścieniem mocującym |
| Jednorazowy przetwornik ciśnienia Deltran | Produkty medyczne stanu Utah, Stany Zjednoczone | 6069 | Przewód 12" |
| Zawór 3-drogowy DiscofixC do terapii infuzyjnej i monitorowania | B. Braun, Niemcy | 16494C | |
| Heparyna | Belmedpreparaty, Białoruś | N/A | Heparyna sodowa 5000 j.m./ml, ampułki 5 ml |
| Lidokainy | Velpharm, Rosja | N/A | Roztwór do wstrzykiwań 20 mg/ml, ampułki 2 ml |
| Mankiet pneumatyczny "Systole" | Neurobotics, Rosja | N/A | Część nieinwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi u gryzoni. Ogon typu 5-10 mm (szczury) |
| Chlorek sodu | Pharmasyntez, Rosja | N/A | Roztwór do infuzji 0,9%, 250 ml |
| Oprogramowanie LabChart8 | ADInstruments, Australia | N/A | Wersja 8.1.13 |
| Oprogramowanie MATLAB | MathWorks Inc., Stany Zjednoczone | Nie dotyczy | Wersja R2019b |
| Sterylna strzykawka do jednorazowego użytku, 1 mL, 3-częściowa | Huaian City Hengchun Medical Product Co. Ltd., Chiny | Nie dotyczy | Igła 27 G |
| Sterylna strzykawka do jednorazowego użytku, 2 (2,5) mL, 3-częściowa | Vogt Medical Vertrieb GmbH, Niemcy | 1310524 | Igła 23 G |
| Szew SILK-S | Polytechmed, Rosja | N/A | Nienasiąkliwa, pleciona, wykonana z naturalnego jedwabiu z powłoką silikonową, w kasecie w kolorze czarnym. USP 4/0 (MP1.5). Długość 100 m. Do podwiązywania naczyń krwionośnych |
| Xyla (Książe) | Interchemie, Holandia | Nie dotyczy | Ksylazyna 20 mg/ml, 50 ml |
| Zoletil 100 powiedział: | Virbac, Francja | Nie dotyczy | Tiletamina HCl 50 mg/ml, zolazepam HCl 50 mg/mL, 5 ml |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie