Artykuł metodologiczny

Ustanowienie i ocena modelu szczura cukrzycowego z arteriosclerozą kończyn dolnych

DOI:

10.3791/68991

⸱

2 stycznia 2026

 ,  ,  ,  , 
1The Second Clinical Medical College of Binzhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Shandong Second Medical University, 3Department of Vascular Surgery, YanTai Yuhuangding Hospital Affiliated to Qingdao University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętniczotwardzenie kończyn dolnych jest częstym powikłaniem cukrzycy. Przedstawiamy tutaj nowatorską metodę modelowania zwierząt, która symuluje postęp choroby miażdżycy okluzyjnej poprzez wstrzyknięcie etanolu do naczyń krwionośnych w celu zakłócenia struktury naczyniowej, tworząc tym samym nową platformę do leczenia chorób naczyń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było opracowanie i potwierdzenie nowego modelu szczura arteriosclerosis obliterans (ASO) kończyn dolnych u szczurów z cukrzycą. W przeciwieństwie do tradycyjnej podwiązania tętnic udowych, wstrzyknęliśmy 95% etanolu (0,1 mL) do tętnicy biodrowej zewnętrznej. Po operacji zlokalizowano zgryzowanie tętnic i niedokrwienie kończyn tylnych w dniach 1, 3, 7 i 14 za pomocą ultrasonografii Dopplera, obrazowania termicznego oraz pomiaru masy mięśni na mokrym terenie. Przeprowadzono analizę histologiczną naczyń krwionośnych i tkanek mięśniowych w celu oceny skuteczności i stabilności modelu. Wysokostężeniowy etanol (95%) powoduje uszkodzenie komórek śródbłonka naczyń ważących, prowadząc do zatkania tętnic udowych. W porównaniu z grupą kontrolną, USG Dopplera wykazało stopniowe zmniejszanie średnicy tętnicy oraz zwiększaną prędkość przepływu w dotkniętej kończynie. Obrazowanie termiczne wykazało obniżoną temperaturę kończyn, podczas gdy pomiar masy mięśni wykazał istotne zmniejszenie masy mięśni po stronie ipsilateralnej. Analiza histopatologiczna potwierdziła okluzję światła tętnic, obniżoną gęstość mikronaczyniową oraz postępujące zaostrzenie zmian w czasie. Podsumowując, wstrzyknięcie 95% etanolu do tętnicy biodrowej skutecznie odtwarza patofizjologiczne cechy okluzji tętnicy kończyn dolnych, stanowiąc nowy model do badania tętnicy osklerozy obliterans u szczurów cukrzycowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zator tętnic w kończynie dolnej (DLEAO) jest główną przyczyną niepełnosprawności i śmiertelności u pacjentów z cukrzycą, poważnie obniżając jakość życia i nakładając znaczne obciążenie społeczno-ekonomiczne1. Patogeneza cukrzycowej choroby tętnic obejmuje złożone interakcje między hiperglikemią, dyslipidemią, przewlekłym zapaleniem i dysfunkcją naczyń2. Modele zwierzęce odegrały kluczową rolę w wyjaśnieniu tych mechanizmów, dostarczając kluczowych informacji dla rozwoju terapeutycznego. Modele zwierzęce służą jako cenne narzędzia do symulacji patofizjologii obwodowych chorób tętnic (PAD) u ludzkich pacjentów z cukrzycą. Modele te umożliwiają badania o wysokiej przepustowości, powtarzalne do badania postępu choroby i wyjaśnianie mechanizmów leżących u podstaw. Ponadto badania przedkliniczne z wykorzystaniem modeli zwierzęcych dostarczają niezbędnych danych dla nowych terapii, w tym leków farmakologicznych, terapii genowej oraz podejść medycyny regeneracyjnej (np. terapia komórkami macierzystymi)3. Takie fundamentalne badania są kluczowe dla informowania kolejnych badań klinicznych i rozwoju medycyny translacyjnej.

Obecnie metoda podwiązywania tętnic udowych (FAL) jest szeroko stosowana w laboratoriach do tworzenia modeli szczurów z niedokrwieniem kończyn tylnych4. Takie podejście szybko wywołuje objawy niedokrwienne w kończynach dolnych5; jednak powstała zakrzepica tętnic różni się od progresji patofizjologicznej obserwowanej u pacjentów z cukrzycą z chorobą tętnic kończyn dolnych (LEAD), która obejmuje uszkodzenie śródbłonka, nagromadzenie czynników zapalnych oraz proliferację komórek mięśni gładkich 2,6. Dodatkowo FAL wywołuje szybką neowaskularyzację i tworzenie naczyń pobocznych, przywracając niskoprzepływową perfuzję krótko po modelowaniu 5,7. Jest to w przeciwieństwie do przewlekłego postępu cukrzycowego OŁOWIU. Dlatego istnieje potrzeba opracowania modelu zwierzęcego, który dokładniej odwzoruje mechanizmy patofizjologiczne miażdżycy u człowieka.

W modelach zwierzęcych z cukrzycą mechaniczne uszkodzenie tętnicy udowej intymnej poprzez cewnik balonowy lub indukcję chemiczną (np. stymulację chlorkiem żelaza) skutecznie wywołuje zmiany patologiczne, w tym denudację śródbłonka, infiltrację komórek zapalnych oraz migrację/proliferację komórek mięśni gładkich8. To podejście lepiej odwzorowuje charakterystyczne cechy patologiczne miażdżycy człowieka. W porównaniu z tradycyjnym modelem FAL, główną zaletą metody indukowanej etanolem jest jej zdolność do dokładniejszego symulowania złożonego procesu patofizjologicznego cukrzycowego OŁOWIU. Etanol bezpośrednio zakłóca śródbłonek naczyniowy, aktywując agregację płytek krwi i zakrzepicę, naśladując tym samym początkowe zdarzenie w cukrzycowym LEAD9. Co ważniejsze, stopniowo niszcząc mikrostrukturę naczyniową, etanol skutecznie eliminuje szybką kompensację krążenia bocznego, powszechnie spotykaną w modelu FAL, skutecznie odtwarzając typowy przewlekły stan hipoperfuzji cukrzycowego LEAD10. Natomiast model niedokrwienia indukowanego podwiązaniem tętnicy udowej ma istotne ograniczenia: gryzonie (np. myszy, szczury) szybko kompensują ostre niedokrwienie dzięki dobrze rozwiniętemu krążeniu bocznemu, co prowadzi do niespójnego nasilenia niedokrwiennego i słabego powtórzenia krytycznego niedokrwienia kończyn ludzkich (CLI)11,12. Ponadto ludzka choroba tętnic obwodowych (PAD) wynika głównie z przewlekłego postępu miażdżycy, podczas gdy model podwiązywania tętnic udowych stanowi ostre zdarzenie niedokrwienne – zasadniczo odrębne mechanizmy patofizjologiczne13. Głównym celem tego badania było ustanowienie i scharakteryzowanie stabilnego, długoterminowego modelu eksperymentalnego cukrzycowego miażdżycy kończyn dolnych (LEAOD), który wiernie odzwierciedla postęp choroby u pacjentów. Okluzja indukowana etanolem jest operacyjnie prosta, wymaga jedynie minimalnie inwazyjnych wstrzyków, co zmniejsza barierę techniczną i śmiertelność zwierząt. Jego kluczowe parametry są łatwe do standaryzacji, co zapewnia wysoką powtarzalność. Ponadto metoda jest opłacalna, eliminuje potrzebę specjalistycznego sprzętu i jest łatwo przenoszalna między laboratoriami. Obecnie nadal brakuje trwałych modeli zwierzęcych do weryfikacji nowych interwencji terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało przeprowadzone według protokołu zatwierdzonego przez Komitet Etyki Zwierząt Szpitala Yantai Yuhuangding. W badaniu objęto 40 samców szczurów Sprague-Dawley (waga: 250-300 g, wiek: 6 tygodni) trzymane w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Od 7. tygodnia życia karmiono je dietą wysokotłuszczową i wysokosacharozową¹⁴,¹⁵ ad libitum, z darmowym dostępem do wody przez 8 tygodni. Po 4 tygodniach rozpoczęcia diety cukrzyca została wywołana wstrzykiwaniem z paciorkowca (STZ¹⁶). Po 8 tygodniach potwierdzono pomyślne ustalenie modelu cukrzycowego przed kolejnymi eksperymentami. Operację zamknięcia tętnicy kończyny tylnej wykonano u szczurów w wieku 14 tygodni, jak opisano poniżej.

1. Chirurgiczne wywołanie arteriosklerozy kończyn tylnych u szczurów cukrzycowych

  1. Przygotuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne zgodnie z Tabelą Materiałów oraz przedstawioną na Rysunku 1.
  2. Znieczulaj szczura za pomocą aparatu znieczulonego, dostarczając izofluran (1,5-2,5%) oraz tlen (O2, 1-2 L/min). Utrzymuj spontaniczne oddychanie przez cały czas. Ocena głębokości znieczulenia za pomocą odruchu zaciskania palców, aby zapewnić chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.
  3. Połóż szczura na pozycji leżącej na platformie ograniczającej. Usuń owłosienie z brzucha na kończyny dolne za pomocą kremu depilacyjnego i żyletki.
  4. Zabezpiecz kończyny. Dezynfekuj skórę tylnych kończyn alkoholem. Zrób nacięcie o średnicy 2-3 cm na przyśrodkowej części prawego uda, używając zakrzywionych kleszczy i nożyczek.
    UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne były wykonywane przez doświadczonego chirurga, aby zapewnić spójność i powtarzalność modeli zwierzęcych.
  5. Pod mikroskopem rozciągnij otaczające tkanki, aby odsłonić zewnętrzną tętnicę biodrową/żyłę oraz nerw udowy. Odizoluj naczynia i nerw. Prześledzić tętnicę biodrową zewnętrzną aż do jej rozgałęzienia na tętnice powierzchowne i głębokie udowe.
  6. Zaciskaj środkowy segment tętnicy udowej i głęboką tętnicę udową klipsami naczyniowymi. Powoli wstrzykuj 0,1 mL 95% etanolu do dalszej zewnętrznej tętnicy biodrowej. Po 60 sekundach usuń klipsy; Uzyskanie hemostazy przez ucisk. Zamykaj ranę warstwa po warstwie.
    UWAGA: Podczas podawania zaobserwowano natychmiastowe blanszowanie tętnicy oraz przejściowe drżenie stopy po ipsilateralnej stronie, co potwierdza skuteczne podanie etanolu wewnątrznaczyniowego.
  7. Nie unieruchamiaj uszkodzonej kończyny po operacji. Podawaj domięśniowo zastrzyk z sodem penicyliny (400 000 IU), aby zapobiec infekcji.
    UWAGA: W tym modelu jednostronnej okluzji tętniczej kończyny dolnej kończyny kontrolną pełni funkcję kontroli. Czas zatkania jest obliczany od 24 godzin po zabiegu.

2. Określenie temperatury dolnej kończyny

  1. Znieczul szczura i ułóż go w pozycji leżącej na platformie chirurgicznej.
  2. Ogol obie tylne kończyny i ułóż je symetrycznie.
  3. Zmierz temperaturę obu kończyn tylnych za pomocą systemu termografii na podczerwień.

3. Średnica tętnic i prędkość przepływu krwi

  1. Znieczul szczura.
  2. Przygotuj system USG i sondę.
    1. Włącz aparat USG, naciskając przycisk zasilania na przednim panelu.
    2. Wybierz sondę liniową o wysokiej częstotliwości (np. 40 MHz) i podłącz ją do systemu.
    3. Nałóż dużą ilość żelu sprzężenia akustycznego na powierzchnię sondy.
  3. Zlokalizuj powierzchowną tętnicę udową.
    1. Połóż szczura na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.
    2. Ogol futro od okolicy uda przyśrodkowej po obu stronach, około 1-2 cm powyżej stawu kolana, używając elektrycznych obcinaczek.
    3. Delikatnie umieść sondę prostopadle do powierzchni skóry nad ogolonym obszarem.
    4. Sreguluj pozycję sondy w trybie B, aby zobrazować tętnicę udową jako pulsującą, bezechową strukturę rurkową.
  4. Zmierz średnicę tętnic.
    1. Zamroź obraz w trybie B, naciskając przycisk Zamrażanie na komputerze lub w interfejsie programowym.
    2. Wybierz narzędzie Pomiar z menu na ekranie.
    3. Użyj funkcji zacisku , aby zmierzyć średnicę wewnętrzną od ściany od bliskiej do dalszej ściany tętnice.
    4. Powtórz pomiar trzy razy w tym samym miejscu i zapisz wartość średnią.
  5. Zmierz prędkość przepływu krwi.
    1. Przełącz się na tryb impulsowej fali Dopplera , klikając ikonę PW Dopplera .
    2. Ustaw bramkę próbki nad środkiem lumenu tętnicy.
    3. Reguluj kąt Dopplera do ≤ 60° za pomocą narzędzia do korekcji kąta.
    4. Naciśnij Aktualizuj lub Uchwycij , aby zarejestrować przebieg prędkości przez co najmniej trzy cykle serca.
    5. Skorzystaj z automatycznej funkcji śledzenia oprogramowania, aby obliczyć szczytową prędkość skurczową (PSV) i prędkość końcowo-rozkurczową (EDV).
    6. Zapisz dane, klikając Zapisz i eksportując wyniki do pliku kalkulacyjnego (np. CSV, Excel).

4. Waga mięśni

  1. Po głębokiej znieczuleniu uśpij szczura przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Rozciąć mięśnie niedzenie żołądka z obu kończyn tylnych, zachowując ścięgna Achillesa (Rysunek 2).
  3. Natychmiast umieść mięśnie na elektronicznej wagi, aby zmierzyć masę mokrą.
  4. Używaj mięśni przeciwległych jako kontroli.
  5. Porównaj pomiary z czterech punktów czasowych i przedstawij je na wykresie krzywej.

5. Analiza histopatologiczna

  1. W każdym z czterech punktów czasowych szybko uśpij jedną grupę szczurów.
  2. Natychmiast pobierz obustronne tętnice udowe.
  3. Utrwal tkanki tętnic w 4% paradehydu.
  4. Osadz tkanki w parafinie i pokroj je na grubość 5 μm.
  5. Wykonaj barwienie hematoksyliny i eozyny (H&E) w celu zbadania zmian histopatologicznych.

6. Analiza statystyczna

  1. Wyraż wszystkie dane jako średnią ± odchyleniu standardowym (SD). Rozważ różnice statystycznie istotne przy wartości p <0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu wykorzystano intraarterialne zastrzyki etanolu do ustanowienia modelu u cukrzycowych szczurów SD (n = 40). Model charakteryzował się skutecznością na poziomie 85% (33/40), opartą na ultradźwiękowym potwierdzeniu zmniejszonej średnicy tętnicy przeciwbocznej i prędkości przepływu krwi w ciągu 14 dni po podaniu. Odnotowano wskaźnik śmiertelności związany z modelem na poziomie 8% (5/40), głównie w początkowym okresie. Chociaż cytotoksyczność etanolu niesie ryzyko niespecyficznych uszkodzeń tkanek, takich jak zgorze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, udało nam się z powodzeniem opracować model postępującego zatkania tętnic na szczurach, który wiernie naśladuje objawy kliniczne obserwowane u pacjentów z cukrzycą. Konsekwentne oceny hipoperfuzji kończyn tylnych osiągano dzięki pomiarom ultrasonograficznym i ocenie mokrej masy mięśni przez okresy przekraczające dwa tygodnie. Podwiązanie tętnicy udowej wywołało powierzchowne zamknięcie naczyń warytorycznych, jednocześnie umożliwiając recyrkulację krwi przez nienaruszony głęboki układ żylny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały wsparte przez Chiński Fundusz Innowacji Uniwersyteckich (Grant nr 2024GR043).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GraphPad wersja 8.0.1RRID:SCR_002798
Termometr na podczerwień oparty na telefonieHIKMICROHM-TJP10B-3AMF
Szczur Sprague-DawleyJinan Pengyue Eksperymentalna Hodowla Zwierząt Spółka, Ltd.250 g
Aparat USGVevo 2100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnes, J. A., Eid, M. A., Creager, M. A., Goodney, P. P. Epidemiology and risk of amputation in patients with diabetes mellitus and peripheral artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (8), 1808-1817 (2020).
  2. Yang, S. L., et al. Pathophysiology of peripheral arterial disease in diabetes mellitus. J Diabetes. 9 (2), 133-140 (2017).
  3. Ko, S. H., Bandyk, D. F. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia. Semin Vasc Surg. 27 (1), 23-31 (2014).
  4. Krishna, S. M., et al. Development of a two-stage limb ischemia model to better simulate human peripheral artery disease. Sci Rep. 10 (1), 3449(2020).
  5. Wang, H., et al. Effect of miR-206 on lower limb ischemia-reperfusion injury in rat and its mechanism. Sci Rep. 13 (1), 21574(2023).
  6. Creager, M. A., Lüscher, T. F., Cosentino, F., Beckman, J. A. Diabetes and vascular disease: pathophysiology, clinical consequences, and medical therapy: part I. Circulation. 108 (12), 1527-1532 (2003).
  7. Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol. 152 (6), 1667-1679 (1998).
  8. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  9. Parsi, K. Interaction of detergent sclerosants with cell membranes. Phlebology. 30 (5), 306-315 (2015).
  10. Hellenthal, K. E. M., Brabenec, L., Gross, E. R., Wagner, N. M. TRP channels as sensors of aldehyde and oxidative stress. Biomolecules. 11 (10), 1401(2021).
  11. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  12. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. (23), e1035(2009).
  14. Rai, V., Moellmer, R., Agrawal, D. K. Clinically relevant experimental rodent models of diabetic foot ulcer. Mol Cell Biochem. 477 (4), 1239-1247 (2022).
  15. Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Res. 2016, 2902351(2016).
  16. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Curr Protoc. 1 (4), e78(2021).
  17. Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. J Vasc Surg. 56 (6), 1669-1679 (2012).
  18. Goto, T., et al. Search for appropriate experimental methods to create stable hind-limb ischemia in mouse. Tokai J Exp Clin Med. 31 (3), 128-132 (2006).
  19. Parikh, P. P., et al. A reliable mouse model of hind limb gangrene. Ann Vasc Surg. 48, 222-232 (2018).
  20. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (2), 205-212 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Niedokrwienie ko czyn dolnychwstrzykni cie etanolu do t tnicyzamkni cie t tnicy udowejbadanie Doppleremobrazowanie termowizyjnepomiar masy mi nianaliza histologicznauszkodzenie r db onka naczyniowego
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły