Artykuł metodologiczny

Zastosowanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w analizie subfrakcji lipoprotein istotnych w miażdżycowej chorobie sercowo-naczyniowej

DOI:

10.3791/68996

⸱

24 października 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu opracowanie metody analizy subfrakcji lipoprotein w oparciu o elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, która stanowi ważną podstawę diagnostyczną do oceny ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Może podzielić LDL na siedem podfrakcji. LDL1 i LDL2 są charakteryzowane jako duże cząstki, podczas gdy LDL3 do LDL7 są charakteryzowane jako małe cząstki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cholesterol lipoprotein o niskiej gęstości (LDL-C) jest kluczowym czynnikiem w rozwoju miażdżycowej choroby sercowo-naczyniowej (ASCVD). Podwyższony poziom LDL-C jest ściśle związany z tworzeniem się blaszek miażdżycowych i ryzykiem zdarzeń sercowo-naczyniowych. Jednak niejednorodność LDL znacząco wpływa na jego zdolność do promowania miażdżycy. Badania wskazują, że cząsteczki lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) można dalej podzielić na LDL o małej gęstości (sdLDL) i LDL o dużej wyporności (lbLDL). Wśród nich sdLDL jest bardziej skłonny do przenikania przez śródzetek naczyń krwionośnych i ma silniejszą aktywność oksydacyjną, co jest szczególnie związane z ASCVD. U pacjentów z zespołem metabolicznym, cukrzycą i hipertriglicerydemią poziom LDL-C może być prawidłowy, ale odsetek sdLDL jest podwyższony, co prowadzi do niedoszacowania ryzyka sercowo-naczyniowego. Dlatego dokładne wykrywanie podfrakcji LDL ma kluczowe znaczenie dla stratyfikacji ryzyka ASCVD i optymalizacji strategii interwencji.

Tradycyjne metody wykrywania LDL-C, takie jak wzór Friedewalda i bezpośredni pomiar, odzwierciedlają tylko poziom cholesterolu całkowitego i nie mogą rozróżnić podfrakcji. Metody wykrywania podfrakcji LDL-C obejmują techniki ultrawirowania (UC), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Jednak metody te mają wysokie wymagania techniczne, skomplikowane operacje lub drogi sprzęt, co czyni je niepraktycznymi do powszechnego stosowania klinicznego.

Technologia elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) oddziela cząsteczki lipoprotein poprzez efekt sita molekularnego i różnice ładunków. Technika ta wykorzystuje niedenaturujące gradientowe systemy żelowe w połączeniu ze specyficznymi barwnikami, takimi jak czerń Sudan, oferując wysoką rozdzielczość, dużą powtarzalność i łatwość obsługi. Typowanie lipoprotein przy użyciu technologii PAGE może zapewnić bardziej kompleksową i precyzyjną ocenę poziomu lipoprotein u pacjentów, pomagając w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia klinicznego. W artykule przedstawiono pięć reprezentatywnych wyników. Średnia wielkość cząstek LDL w próbce A, B, C, D, E wynosi odpowiednio 275,3 A, 266,6 A, 258,2 A, 257,4 A i 252,9 A, co wskazuje odpowiednio na niskie, marginalne, łagodne, umiarkowane i ciężkie ryzyko chorób sercowo-naczyniowych spowodowanych dyslipidemią.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia z 2021 r. choroby układu krążenia (CVD) pozostają główną przyczyną zgonów wśród chorób ludzkich. Raport wskazuje, że w 2019 r. 17,9 miliona ludzi na całym świecie zmarło z powodu chorób układu krążenia, co stanowi prawie jedną trzecią zgonów na świecie1. ASCVD, rodzaj choroby układu krążenia, jest główną przyczyną zgonów wśród mieszkańców miast i wsi w Chinach, stanowiąc ponad 40% wszystkich zgonów2. Miażdżyca jest przewlekłą chorobą zapalną naczyń krwionośnych wywoływaną zarówno przez tradycyjne, jak i nietradycyjne czynniki ryzyka3. Charakteryzuje się odkładaniem się lipidów w ścianie tętnicy4, proliferacją i zwapnieniem tkanki włóknistej, co ostatecznie prowadzi do pogrubienia ściany naczynia, zmniejszenia elastyczności i zwężenia światła. Dyslipidemia jest najważniejszym czynnikiem ryzyka ASCVD, przy czym LDL-C jest patogennym czynnikiem ryzyka ASCVD, odgrywając kluczową rolę w rozwoju ASCVD5. Liczne badania epidemiologiczne, badania randomizacji mendlowskiej i randomizowane badania kontrolowane konsekwentnie wykazały, że poziomy LDL-C w osoczu są dodatnio skorelowane z ryzykiem ASCVD. Obniżenie poziomu LDL-C może obniżyć ryzyko ASCVD6.

LDL jest główną lipoproteiną odpowiedzialną za transport endogennego cholesterolu w organizmie7. Osocze LDL jest niejednorodne, składa się z różnych cząstek o różnych rozmiarach, gęstościach i składzie chemicznym8. Cząstki LbLDL mają mniejszą gęstość i większy rozmiar, podczas gdy cząstki sdLDL mają większą gęstość i mniejszy rozmiar. Heterogeniczność LDL leży u podstaw jego zróżnicowanych skutków biologicznych9. Cząstki LbLDL mają większą średnicę (≥ 25,5 nm), mniejszą gęstość (blisko 1,02 g/ml) i luźną morfologię, składają się z LDL1 i LDL2. Cząsteczki LbLDL zawierają większą ilość estrów cholesterolu. Są mniej podatne na utlenienie lub penetrację śródbłonka naczyniowego, dzięki czemu są stosunkowo bezpieczniejsze. Natomiast cząstki sdLDL mają mniejszą średnicę (< 25,5 nm)10, większą gęstość (bliską 1,06 g/ml) i gęstą strukturę, składającą się od LDL3 do LDL7. Cząsteczki SdLDL zawierają mniejszą ilość estru cholesterolu, ale wyższy poziom trójglicerydów i apolipoproteiny B (ApoB) w porównaniu z lbLDL. Ich właściwości fizyczne sprawiają, że z większym prawdopodobieństwem przenikają przez barierę śródbłonka tętniczego. Pod podśródbłonkiem cząsteczki sdLDL są utleniane przez reaktywne formy tlenu (ROS), tworząc utleniony LDL (ox-LDL)11. Ox-LDL hamuje aktywność śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS), zmniejsza produkcję NO i indukuje komórki śródbłonka do ekspresji VCAM-1 / MCP-1, promując adhezję i migrację monocytów12. Migrujące komórki jednojądrzaste śródbłonka różnicują się w makrofagi, które bez ograniczeń pobierają ox-LDL przez receptory zmiataczy. Nagromadzenie wewnątrzkomórkowego estru cholesterolu przekształca się w komórki piankowate, które są podstawowymi składnikami miażdżycowych smug lipidowych. Komórki piankowate wydzielają czynniki zapalne, takie jak IL-1β i TNF-α, które dodatkowo rozszerzają stres oksydacyjny i uszkodzenia śródbłonka, tworząc pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego13. Może aktywować zapalenie komórek śródbłonka, wspomaga tworzenie komórek piankowatych i przyspiesza postęp płytki nazębnej. Dwa duże badania kohortowe wykazały, że sdLDL-C ma większą kliniczną wartość referencyjną niż LDL-C w przewidywaniu i ocenie potencjalnego ryzyka ASCVD14,15. Jednak tradycyjna metoda wykrywania LDL-C nie może badać podfrakcji lipoprotein ze względu na ograniczenia metody.

Cząsteczki LDL (LDL-P) odzwierciedlają liczbę cząsteczek LDL na jednostkę objętości krwi i służą jako nośniki dla cząsteczek LDL, z których każda zawiera jedną cząsteczkę ApoB i wiele cząsteczek cholesterolu. LDL-C reprezentuje całkowitą masę cholesterolu przenoszonego przez te cząsteczki. Na poziom LDL-C ma wpływ liczba cząsteczek LDL i gęstość cholesterolu, które mogą nie odzwierciedlać w pełni rzeczywistego ryzyka16. Na przykład pacjenci z zespołem metabolicznym, cukrzycą lub hipertriglicerydemią mogą mieć normalny poziom LDL-C, ale nienormalnie podwyższony LDL-P (z powodu mniejszych cząstek i niższej zawartości cholesterolu). Nawet jeśli poziom LDL-C osiąga cel, wysoki poziom LDL-P może nadal zwiększać resztkowe ryzyko sercowo-naczyniowe. Badania wykazały, że LDL-P jest bardziej predykcyjny niż jakikolwiek inny parametr związany z LDL17. Analiza podfrakcji lipoprotein ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy ASCVD, oceny ryzyka resztkowego i kierowania precyzyjnym leczeniem. W ostatnich latach krajowe wytyczne zalecały również subfrakcje LDL jako wskaźniki oceny ryzyka ASCVD lub monitorowania leczenia18.

ASCVD jest główną przyczyną zgonów na świecie. Jego strategie zapobiegania i kontroli w dużym stopniu zależą od gospodarki lipidowej. Obecnie badania przesiewowe osób z dyslipidemią w praktyce klinicznej opierają się przede wszystkim na tradycyjnych czterech testach lipidowych, w tym trójglicerydów (TG), cholesterolu całkowitego (TC), cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości (HDL-C) i LDL-C. Ponadto inne markery lipidowe, takie jak lipoproteina (a), apolipoproteina A1 (ApoA1) i ApoB, są stosowane głównie w populacjach wysokiego ryzyka ASCVD19, takich jak pacjenci z cukrzycą, pacjenci z nadciśnieniem tętniczym i palacze lub ci, u których poziom LDL-C został kontrolowany, ale nadal stanowi wysokie ryzyko.

Wraz z postępem badań coraz bardziej widoczne stają się ograniczenia tradycyjnych testów lipidowych, szczególnie w zakresie skuteczności wczesnego ostrzegania i wyjaśniania ryzyka resztkowego. U znacznej liczby pacjentów z ASCVD początkowo rozpoznaje się prawidłowy poziom lipidów, co sprawia, że LDL-C jest nieskuteczny w pierwotnym ostrzeganiu. Dane epidemiologiczne pokazują, że około 20% pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym ma poziom LDL-C w normalnym zakresie (<3,4 mmol/L) przy przyjęciu, co sugeruje, że tradycyjne badania lipidowe mogą pomijać osoby wysokiego ryzyka. Co więcej, nawet po osiągnięciu docelowych parametrów LDL-C, pacjenci z ASCVD mogą nadal borykać się z wysokim resztkowym ryzykiem sercowo-naczyniowym. U tych pacjentów większości resztkowych zdarzeń wieńcowych nie można wytłumaczyć obniżeniem poziomu LDL-C. W związku z tym proste badanie LDL-C może nie w pełni zaspokoić potrzeby kliniczne w zakresie diagnostyki i leczenia ASCVD, ponieważ rutynowe testy lipidowe nie są w stanie odróżnić lbLDL-C od sdLDL-C.

Wiele badań potwierdziło wyraźną korelację między subfrakcjami lipoprotein a ASCVD. Nieprawidłowe wyniki testów subfrakcji lipoprotein mogą służyć jako ostrzeżenie przed pierwotnym zapobieganiem ASCVD u osób z prawidłowym poziomem lipidów, pomagając zidentyfikować ukryte grupy wysokiego ryzyka. W przypadku wtórnej prewencji ASCVD, w której poziomy LDL-C mieszczą się już w docelowych zakresach, badanie subfrakcji lipoprotein może pomóc w ocenie ryzyka resztkowego i ukierunkowaniu dalszego leczenia20. W związku z tym oczekuje się, że wykrycie nowych podfrakcji LDL zapewni nowe cele w zakresie zapobiegania i leczenia dyslipidemii i ASCVD w porównaniu z tradycyjnymi testami lipidowymi.

System detekcji i analizy w naszym laboratorium wykorzystuje przede wszystkim PAGE do rozdzielania podfrakcji lipoprotein na podstawie ich wielkości i ładunku. Cząsteczki lipoprotein są rozdzielane głównie według wielkości w wyniku przesiewania molekularnego w matrycy poliakrylamidu przez PAGE. Małe cząsteczki migrują szybko, podczas gdy duże cząsteczki są hamowane przez niedrożność steryczną i migrują powoli. A im więcej ładunku niesie ze sobą cząsteczka, tym szybciej migruje. Ta metoda może szybko podzielić lipoproteiny na dwanaście podfrakcji. LDL dzieli się na siedem podfrakcji, oznaczonych jako LDL1 do LDL7. Wszystkie mają różne rozmiary, gęstości, właściwości fizykochemiczne, zachowania metaboliczne i potencjał miażdżycowy. LDL1 i LDL2 są klasyfikowane jako lbLDL, podczas gdy LDL3 do LDL7 są klasyfikowane jako sdLDL. Techniki wykrywania subfrakcji lipoprotein obejmują UC, HPLC i NMR. Jednak ze względu na wysokie wymagania sprzętowe, skomplikowaną obsługę i czasochłonność, ich zastosowanie kliniczne jest stosunkowo ograniczone21. Metoda PAGE skutecznie oddziela różne podfrakcje LDL, dzięki czemu jest bardziej przyjazna dla użytkownika w porównaniu z innymi technikami. Zastosowany sprzęt jest ekonomiczny i przenośny, dzięki czemu jest bardziej odpowiedni do powszechnego użytku w rutynowych laboratoriach klinicznych. Badanie to ma na celu walidację PAGE jako szybkiej i opłacalnej metody analizy subfrakcji LDL w próbkach surowicy w celu wsparcia procesu podejmowania decyzji klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki w tym badaniu są oceniane i zatwierdzane przez Komisję ds. Oceny Etyki Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Guangdong (numer zatwierdzenia: KY2025-435-01). Wszyscy uczestnicy podpisali pisemną świadomą zgodę przed eksperymentem.

1. Przygotowanie zestawu

  1. Przygotowanie buforu żelowego
    1. Przygotowanie 30% akrylamidu (ACR): Odważyć 30 g akrylamidu, dodać 80 ml wody dejonizowanej, wymieszać do rozpuszczenia i dostosować do 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia.
    2. Przygotowanie 1% bisakryloamidu (BIS): Odważyć 1 g bisakryloamidu, dodać 80 ml wody dejonizowanej, wymieszać do rozpuszczenia i dostosować do 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia.
    3. Przygotowanie 25% sacharozy: Odważyć 25 g sacharozy, dodać 70 ml wody dejonizowanej, wymieszać do rozpuszczenia i dostosować do 100 ml do przechowywania w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotowanie 10% nadsiarczanu amonu (APS): Rozpuścić 0,1 g nadsiarczanu amonu w 1 ml wody dejonizowanej i natychmiast zużyć.
    5. Przygotowanie 1M Tris (pH = 6,8): Odważyć 121,14 g trishydroksymetyloaminometanu, dodać 800 ml wody dejonizowanej, wymieszać do rozpuszczenia i dostosować wartość pH do 6,8, a następnie uzupełnić do 1000 ml.
    6. Przygotowanie 1M Tris (pH = 8,6): Odważyć 121,14 g trishydroksymetyloaminometanu, dodać 800 ml wody dejonizowanej, wymieszać do rozpuszczenia i dostosować wartość pH do 8,6, a następnie uzupełnić do 1000 ml.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z akrylamidem należy nosić rękawice z kauczuku butylowego, okulary ochronne, odzież ochronną i pracować w dygestorium. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast przemyć wodą z mydłem, a następnie zasięgnąć porady lekarza. W przypadku inhalacji wyprowadzić się na świeże powietrze.
  2. Przygotowanie żelu separacyjnego
    1. Weź czystą szklaną rurkę i uszczelnij dolną warstwę folią uszczelniającą.
    2. Dodaj kolejno 8,29 ml 30% ACR, 17,76 ml 1% BIS, 10 ml 25% sacharozy, 1 ml 10% APS, 10 ml 1M Tris (pH = 8,6), 0,1 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 32,85 ml wody dejonizowanej do czystej zlewki. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać 80 ml ługu macierzystego (o stężeniu poliakrylamidu 3,3%) i dodaj do szklanej probówki w ilości 1,2 ml na korzeń. Polimeryzować w temperaturze pokojowej przez 60 minut i uszczelnić ciecz oczyszczoną wodą, aby zapewnić płaską powierzchnię cieczy.
  3. Przygotowanie skoncentrowanego kleju
    1. Dodaj kolejno 4,07 ml 30% ACR, 3,05 ml 1% BIS, 5 ml 25% sacharozy, 0,5 ml 10% APS, 5 ml 1M Tris (pH = 6,8), 0,05 ml TEMED i 32,33 ml wody dejonizowanej do czystej zlewki po kolei, dobrze wymieszaj, aby uzyskać 50 ml ługu macierzystego (o stężeniu poliakrylamidu 3,05%), dodać do szklanej probówki w ilości 0,2 ml na korzeń. Polimeryzować w temperaturze pokojowej przez 60 minut i uszczelnić ciecz oczyszczoną wodą, aby zapewnić płaską powierzchnię cieczy.
  4. Przygotowanie roztworu konserwującego
    1. Odważyć 6,4 g Tris, 75 g sacharozy, 2,5 ml gliceryny i 0,3 ml PC-300 (antybakteryjnego środka konserwującego) i dodać 800 ml wody dejonizowanej, wymieszać do rozpuszczenia, dostosować wartość pH do 6,8, a na koniec rozcieńczyć do 1000 ml. Stężenie Tris-HCl wynosi około 52 mM.
  5. Przygotowanie czarnego roztworu barwiącego Sudan
    1. Odważyć 0,03 g Sudan black i rozpuścić go w mieszaninie 2 ml glikolu etylenowego, 6 ml bezwodnego etanolu i 2 ml dimetylosulfotlenku. Po przefiltrowaniu podzielić go na 1 ml na fiolkę.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z czerń Sudanu i dimetylosulfotlenku należy nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi. Operacje muszą być wykonywane w wentylowanym środowisku. Po ekspozycji należy natychmiast spłukać skórę i oczy wodą, a następnie w razie potrzeby zwrócić się o pomoc lekarską.
  6. Opakowanie wewnętrzne
    1. Kompletne opakowanie zgodnie z wymaganiami dotyczącymi składu zestawu.

2. Skład zestawu

  1. Upewnij się, że produkt zawiera prefabrykowane kolumny, roztwór konserwujący i roztwór do czarnego barwienia Sudan. Prefabrykowane kolumny powinny zawierać akrylamid, bisakrylamid, sacharozę, nadsiarczan amonu, tris i tetrametyloetylenodiaminę. Długość słupa prefabrykowanego wynosi 75 ± 0,5 mm, średnica wewnętrzna 5,5 ± 0,02 mm, a średnica zewnętrzna 7,0 ± 0,02 mm. Roztwór konserwujący powinien zawierać Tris, sacharozę, glicerynę i konserwanty. Roztwór do barwienia Sudan black powinien zawierać Sudan black, glikol etylenowy, bezwodny etanol i dimetylosulfotlenek. Upewnij się, że specyfikacje opakowania różnią się w zależności od ilości prefabrykowanych kolumn. Jedna porcja odczynnika musi mieć jedną prefabrykowaną kolumnę. Nie należy łączyć zestawów odczynników z różnych partii, ponieważ może to wpłynąć na wyniki eksperymentów.

3. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie pacjenta: Upewnij się, że pacjent jest na czczo podczas pobierania próbek krwi.
  2. Użyć probówek do pobierania próbek żelu do separacji surowicy i przeprowadzić pobieranie próbek zgodnie ze standardową procedurą operacyjną. Krew musi zostać oddzielona tak szybko, jak to możliwe po pobraniu krwi, aby uniknąć hemolizy.
  3. Zbadać próbki surowicy po rozdzieleniu tak szybko, jak to możliwe, w temperaturze pokojowej. Jeżeli natychmiastowe przeprowadzenie badania nie jest możliwe, należy przechowywać próbki w temperaturze 2–8 °C przez okres do 7 dni lub w temperaturze –20 °C przez okres do 30 dni.
  4. Przywróć próbki do temperatury pokojowej i całkowicie wymieszaj przed użyciem, szczególnie w przypadku próbek zamrożonych i rozmrożonych. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie jest niedozwolone, ponieważ może to zagrozić integralności próbki. Zarówno lipemia, jak i hemoliza próbki mogą wpływać na wyniki testów. Jeśli jest to łagodna lipemia lub próbka hemolizy, zaleca się szybkie wirowanie przy 14 462 x g w temperaturze pokojowej przez 15 minut. W przypadku próbek lipemii użyj pipety, aby zassać całą przezroczystą warstwę od dołu. W przypadku próbek do hemolizy należy pobrać supernatant. Następnie przenieś go do nowej probówki wirówkowej i zabarwij. Jeśli jednak lipemia lub hemoliza są bardzo ciężkie, zaleca się ponowne pobranie krwi.

4. Kroki operacji

  1. Preparat
    1. Wyjmij prefabrykowane kolumny i próbki do testu. Za pomocą pipety odessać resztki cieczy konserwującej z portu próbki prefabrykowanych kolumn. Zrównoważyć prefabrykowane kolumny i próbki do temperatury pokojowej i rozpuścić 14,3 g elektroforetycznego proszku buforowego w 800 ml wody dejonizowanej.
  2. Barwnik
    1. Weź czyste probówki wirówkowe i ponumeruj je. Liczba probówek jest zgodna z kolejnością probówek do pobierania krwi. Dodać probówki wirówkowe o proporcji 50 μl próbki do 10 μl czarnego roztworu barwiącego Sudan, dobrze wymieszać i odstawić na 30 minut w temperaturze pokojowej do zabarwienia.
      UWAGA: Zasada barwienia Sudan black opiera się na jej właściwościach lipofilowych. Może indukować określone reakcje chromogenne z substancjami lipidowymi, takimi jak obojętne tłuszcze, fosfolipidy i sterydy w komórkach, w wyniku czego powstają brązowo-czarne lub ciemne czarne cząsteczki. W tym systemie zoptymalizowaliśmy czas barwienia i dawkowanie przy użyciu jednoczynnikowego projektu eksperymentalnego z następującym protokołem. Wybiera się trzy próbki surowicy LDL-C (wysokie, średnie i niskie stężenie) o odpowiednich objętościach barwienia wynoszących odpowiednio 5 μl, 10 μl, 15 μl i 20 μl. Czas barwienia ustawiono na 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 45 min i 60 min. Przeprowadzane są eksperymenty elektroforetyczne, a następnie analiza pasm elektroforetycznych w skali szarości w celu sprawdzenia skuteczności barwienia. Optymalne warunki określa się jako 10 μl objętości barwienia o czasie barwienia 30 min ± 5 min. Mniejsza objętość i czas trwania barwienia powodują słabo zabarwiony cholesterol lipoproteinowy. Podczas gdy optymalne warunki osiągnęły równowagę, większa objętość i czas barwienia nie są konieczne.
  3. Separacja jonoforyczna
    1. Włóż wstępnie wyważone kolumny do gumowego gniazda zbiornika do elektroforezy. Port próbki w kolumnie żelowej znajduje się w odległości około 2 cm od gumowego korka. Upewnij się, że jest szczelnie zamknięty i nie ma wycieków. Gdy liczba kolumn żelu do pobierania próbek nie jest pełna, wypełnij pustą przestrzeń gumową zatyczką bez otworów.
    2. Następnie wlej bufor do elektroforezy do górnego i dolnego zbiornika. Usuń pęcherzyki u wylotu prefabrykowanych kolumn. Dodać 25 μl barwionych próbek do portu próbki prefabrykowanych kolumn.
    3. Zakryj pokrywę, podłącz wyłącznik zasilania i ustaw parametry napięcia (U = 100 V), prądu (I = 3 mA/lampę), mocy (P = 120 W), czasu (T = 70 min) dla separacji elektroforetycznej.
      UWAGA: Voltage, moc i czas są stałymi parametrami. Prąd należy ustawić w zależności od liczby badanych próbek (np. 10 probówek, I = 3 mA x 10 probówek = 30 mA).
    4. Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie, zdejmij pokrywę i wylej bufor do elektroforezy na górną część urządzenia do elektroforezy. Wyjmij kolejno kolumny żelowe i umieść je na ramie mocującej, wylej nadmiar bufora elektroforetycznego na górną powierzchnię i przeanalizuj w systemie analizy skaningowej.
  4. Analiza skanowania
    UWAGA: Typ analizatora to DY-03, a oprogramowanie skanujące to KBL 3.3.9 GD.
    1. Włącz wyłącznik zasilania analizatora skanowania, kliknij dwukrotnie oprogramowanie systemu komputerowego i kliknij Kolekcja , aby przejść do interfejsu oprogramowania. Kliknij przycisk Eksportuj tacę na próbki w interfejsie oprogramowania, umieść kolumny żelu na stojaku na próbki, tak aby końcówka do pobierania próbek była skierowana w stronę wnętrza urządzenia. Upewnij się, że kolumny żelu są umieszczone w odpowiednich ponumerowanych pozycjach. Pozycje 25 i 26 są przeznaczone wyłącznie do badań w ramach kontroli jakości.
    2. Kliknij opcję Importuj tacę na próbki w interfejsie oprogramowania, aby zaimportować tacę na próbki do urządzenia. Kliknij przycisk Skanuj , aby uzyskać przykładowe obrazy skanowania. Urządzenie posiada wbudowany system autofokusa. Automatycznie dostosowuje ostrość między modułem skanującym a rurką żelową, aby zapewnić wyraźne obrazowanie. Oprogramowanie automatycznie identyfikuje pozycję początkową (VLDL) i pozycję zakończenia (HDL) elektroforogramu. Po wykryciu oczywistych pików w tych pozycjach, oprogramowanie blokuje się w wyznaczonym obszarze analizy w celu analizy spektralnej.
    3. Po wprowadzeniu informacji o pacjentach i zeskanowaniu kodu kreskowego, kliknij Analiza i przetwarzanie w interfejsie oprogramowania, system automatycznie przeanalizuje i wygeneruje raporty z testów. Kliknij przycisk Prześlij LIS , aby przesłać raporty z testów do systemu LIS.
    4. Po zeskanowaniu i analizie należy wyjąć prefabrykowane kolumny i utylizować je zgodnie ze specyfikacją odpadów medycznych.

5. Kontrola jakości

  1. Wykonaj test kontroli jakości na dwóch poziomach przed codziennym testowaniem próbki. Etapy działania testu kontroli jakości są takie same, jak w przypadku testu próbki. Odniesieniem typu A jest średnia średnica cząstek większa niż 268 A. Odniesieniem typu B jest średnia średnica cząstek mniejsza niż 265 A.
    UWAGA: Analiza wyników: TYP A, średnia wielkość cząstek LDL wynosi > 268 A, LDL1 i LDL2 odpowiadają za więcej, co wskazuje na niskie ryzyko CVD. TYP POŚREDNI (TYP INT), średnia wielkość cząstek LDL wynosi od 265 do 268 A, co wskazuje, że stosunek LDL3 do LDL7 jest powyżej wartości krytycznej. TYP B, średnia wielkość cząstek LDL wynosi < 265 A, LDL3 do LDL7 odpowiada za więcej, co wskazuje na wysokie ryzyko CVD.

6. Ulepszenia techniczne

  1. Aby zapewnić dokładne wyniki diagnostyki, należy wdrożyć następujące ulepszenia techniczne.
    1. Badanie wstępne: Upewnij się, że pacjenci są na czczo przed pobraniem krwi. Należy stosować surowicę lub osocze przeciwzakrzepowe EDTA zamiast osocza przeciwzakrzepowego heparyny. Upewnij się, że pipeta jest dokładna w pobieraniu. Unikaj ciężkich próbek lub hemolitycznych.
    2. Podczas badania: Ustaw parametry elektroforezy napięcia (U = 100 V), prądu (I = 3 mA/lampę), mocy (P = 120 W), czasu (T = 70 min) zgodnie ze standardowymi protokołami. Nosić sterylne rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu szklanych probówek, które może mieć wpływ na możliwość robienia zdjęć i skanowania.
    3. Po badaniu: Podczas wystawiania raportów należy przejrzeć nieprawidłowe chromatogramy pod kątem potencjalnych zakłóceń i przeprowadzić ponowną analizę, aby uniknąć podania nieprawidłowych wniosków diagnostycznych.
      1. Chromatogram normalny: W początkowym położeniu VLDL i w położeniu końcowym HDL oba mają wyraźny pik (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki).
      2. Chromatogram anomali: W początkowym położeniu VLDL lub w położeniu końcowym HDL nie ma ani jednego piku, albo ma więcej niż jeden pik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ma na celu wynalezienie metody wykorzystującej PAGE do wykrywania podfrakcji lipoprotein w surowicy uczestników. Celem jest ustalenie, czy podfrakcje LDL-C są przede wszystkim dużymi cząstkami (LDL1 i LDL2), czy małymi cząstkami (LDL3 do LDL7). Po zabarwieniu czernią Sudan Black, próbki są rozdzielane za pomocą urządzenia do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Lipoproteiny są następnie rozdzielane na odrębne pasma w probówkach żelowych, a analiza subfrakcji jest przeprowadzana przy użyciu systemu analizy s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż rola sdLDL jako czynnika ryzyka sercowo-naczyniowego w rozwoju miażdżycy została potwierdzona badaniami, obecnie nie ma ustalonej metody identyfikacji podfrakcji LDL. W ciągu ostatnich kilku dekad poczyniono znaczne postępy w opracowywaniu metod wykrywania podfrakcji LDL. UC jest uważany za złoty standard. Może rozdzielać podfrakcje LDL na podstawie różnic ich gęstości, rozróżniając sdLDL i lbLDL z wysoką rozdzielczością. Jednak ta metoda wymaga drogich ultrawirówek i długiego czasu wirowania, co może uszkodzić n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to jest wspierane przez granty z Funduszu Badań nad Naukami i Technologią Medyczną Prowincji Guangdong (A2024108).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor elektroforetyczny w proszkuFirma technologiczna Guangxi Kangbolai25030401Do przygotowania roztworów buforowych i zapewnienia warunków do elektroforezy
Produkty do kontroli jakości o wysokiej wartościFirma technologiczna Guangxi Kangbolai25030301Dla dokładności i precyzji monitorowania
Roztwór do separacji gęstości próbki lipoprotein (gradientowa elektroforeza żelowa)Firma technologiczna Guangxi KangbolaiLSS60-SB1-A1  25030301Do oddzielania składników podtypu lipoprotein od próbek surowicy
Produkty do kontroli jakości o niskiej wartościFirma technologiczna Guangxi Kangbolai25030301Dla dokładności i precyzji monitorowania
Sudan roztwór barwiącyFirma technologiczna Guangxi KangbolaiLSS60-SB1-A1  25030301Do barwienia próbek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  2. Li, J. J., et al. 2023 Chinese guideline for lipid management. Front Pharmacol. 14, 1190934(2023).
  3. Kong, P., et al. Inflammation and atherosclerosis: signaling pathways and therapeutic intervention. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 131(2022).
  4. Xiang, Q., et al. New insight into dyslipidemia-induced cellular senescence in atherosclerosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 97 (5), 1844-1867 (2022).
  5. Chen, L., et al. Low-density lipoprotein cholesterol, cardiovascular disease risk, and mortality in China. JAMA Netw Open. 7 (7), e2422558(2024).
  6. Mansoor, T., et al. Inclisiran as a siRNA inhibitor of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9): past, present, and future. Am J Cardiovasc Drugs. 25 (3), 293-306 (2025).
  7. Alam, M. R., et al. Lipid profile of coronary heart disease patients: a prospective observational study. World J Cardiovasc Surg. 11 (11), 114-124 (2021).
  8. Thongtang, N., et al. Metabolism and proteomics of large and small dense LDL in combined hyperlipidemia: effects of rosuvastatin. J Lipid Res. 58 (7), 1315-1324 (2017).
  9. Wang, J., et al. Discordance of small dense LDL cholesterol beyond LDL cholesterol or non-HDL cholesterol and carotid plaque. JACC Asia. 5 (8), 1012-1028 (2025).
  10. Ivanova, E. A., et al. Small dense low-density lipoprotein as biomarker for atherosclerotic diseases. Oxid Med Cell Longev. 2017, 1273042(2017).
  11. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  12. Li, J., et al. The EGR3 gene modulates CRP and VCAM-1 expression to promote the development of atherosclerosis. Gene. 963, 149630(2025).
  13. Rodríguez-Fernández, M. A., et al. Virtual screening and molecular dynamics of cytokine-drug complexes for atherosclerosis therapy. Int J Mol Sci. 26 (7), 2931(2025).
  14. Ikezaki, H., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol is the most atherogenic lipoprotein parameter in the prospective Framingham offspring study. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019140(2021).
  15. Higashioka, M., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol and the risk of coronary heart disease in a Japanese community. J Atheroscler Thromb. 27 (7), 669-682 (2020).
  16. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  17. Kanonidou, C. Small dense low-density lipoprotein: analytical review. Clin Chim Acta. 520, 172-178 (2021).
  18. Joint Committee on the Chinese Guidelines for Lipid Management. Chinese guidelines for lipid management (2023). Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 51 (3), 221-255 (2023).
  19. Jha, M., et al. Lipoprotein(a) - from biomarker to therapy: a review for the clinician. Am J Cardiol. 245, 42-53 (2025).
  20. Hirano, T. Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol measurement in type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 16 (3), 370-383 (2025).
  21. Rief, M., et al. Comparison of two nuclear magnetic resonance spectroscopy methods for the measurement of lipoprotein particle concentrations. Biomedicines. 10 (7), 1766(2022).
  22. Kroner, G. M., et al. Retrospective comparison of results for simultaneous orders for LDL particle count, apolipoprotein B, and LDL-C. Clin Chim Acta. 518, 38-42 (2021).
  23. Chary, A., et al. Association of LDL-cholesterol subfractions with cardiovascular disorders: a systematic review. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 533(2023).
  24. Duan, R., et al. Estimation of the LDL subclasses in ischemic stroke as a risk factor in a Chinese population. BMC Neurol. 20 (1), 414(2020).
  25. Kotani, K., et al. Similarity and differences in small dense low-density lipoprotein assessment: two methods compared. Arch Med Sci Atheroscler Dis. 6, e166-e168 (2021).
  26. Simachew, Y. M., et al. Lipoproteins and cholesterol homeostasis in paediatric nephrotic syndrome patients. Biochem Med (Zagreb). 32 (2), 020706(2022).
  27. Hirano, T. Hypertriglyceridemia contributes significantly to high prevalence of small dense LDL-cholesterol in patients with type 2 diabetes, even when LDL-C targets are achieved. Diabetol Int. 14 (3), 288-293 (2023).
  28. Zhang, C., et al. Lipid and lipoprotein particle profiles in patients with type 2 diabetes mellitus: a comparative study between highlanders and lowlanders. Lipids. 60 (5), 293-302 (2025).
  29. Waldmann, E., et al. Effect of PCSK9 inhibition with evolocumab on lipoprotein subfractions in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipidemia). PLoS One. 17 (3), e0265838(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ma e g ste LDLwielko cz steczek LDLelektroforeza w elu gradientowymtypowanie lipoproteinbarwienie czerni sudanowstratyfikacja ryzyka sercowo naczyniowegoheterogeniczno LDL

Powiązane artykuły