Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Integracja farmakologii sieciowej w celu badania ochronnego działania cynamaldehydu przeciwko neurotoksyczności wywołanej oksalplatyną

503 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69013

⸱

28 listopada 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie bada ochronne działanie cynamaldehydu (CA) przeciwko uszkodzeniom wywołanym oksalplatyną (OXA) w komórkach zwojów grzbietowych szczurów (DRG). Mechanizm podstawowy polega na zahamowaniu szlaku sygnalizacyjnego JAK2/STAT3 oraz aktywacji szlaku SLC7A11-GSH-GPX4, co ujawniono dzięki farmakologii sieciowej i walidacji eksperymentalnej.

Streszczenie

Niniejsze badanie bada ochronne działanie cynamaldehydu (CA) przeciwko uszkodzeniom wywołanym oksalplatyną (OXA) w komórkach zwojów grzbietowych szczurów (DRG). Analizowano działania farmakologiczne CA, a jego potencjalne cele wraz z metabolitami zidentyfikowano za pomocą platformy Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), Integrative Pharmacology-based Network Computational Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP) oraz platform PharmMapper. Do określenia optymalnych stężeń leków stosuje się test CCK-8, natomiast testy malondialdehydu (MDA) stosuje się do oceny poziomu peroksydacji lipidów. Wewnątrzkomórkowe poziomy Fe2+ i reaktywnych form tlenu (ROS) zostały zmierzone za pomocą sond fluorescencjowych. Wpływ CA na poziomy ekspresji białek, w tym p-STAT3, XCT i GPX4, w komórkach DRG leczonych OXA został zbadany za pomocą immunoblottingu. Analiza farmakologii sieciowej zidentyfikowała 14 nakładających się celów wśród "bólu neuropatycznego (NP)-ferroptozy". Wyniki eksperymentalne wykazały, że 24-godzinne leczenie 4,0 μmol/L CA przyniosło optymalne efekty, znacząco obniżając poziomy MDA, Fe2+ i ROS w komórkach DRG (P < 0,05). Ponadto leczenie CA obniżyło ekspresję JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 oraz czynnika jądrowego-kappa B (NF-κB) (P < 0,05), jednocześnie zwiększając ekspresję XCT, GPX4 i FTH1 (P < 0,05). Wyniki te sugerują, że CA łagodzi uszkodzenia wywołane przez OXA w komórkach DRG poprzez hamowanie szlaku sygnalizacyjnego JAK2/STAT3 oraz aktywację osi SLC7A11-GSH-GPX4.

Wprowadzenie

W ostatnich latach ferroptoza, jako nieapoptotyczny tryb śmierci komórki, została wykazana jako zaangażowana w uszkodzenia tkanek wywołane przez różne leki chemioterapeutyczne. Podstawowym mechanizmem ferroptozy jest gromadzenie żelazo zależnych od żelaza produktów peroksydacji lipidów1. Badania nad mechanizmami neurotoksyczności cisplatyny pokazują, że lek ten indukuje ferroptozę neuronalną przez wiele szlaków, a proces ten jest bezpośrednio powiązany z rozwojem neurotoksyczności. Konkretnie, cisplatyna hamuje aktywność nadoksydazy glutationowej 4 (GPX4). Jako kluczowa "cząsteczka hamulcowa" w ferroptozie, inaktywacja GPX4 uniemożliwia usuwanie nadtlenków lipidów (L-OOH), powodując tym samym oksydacyjne uszkodzenia błon komórkowych neuronów2. Tymczasem oksalplatyna może sprzyjać uwalnianiu ferroptozy w komórkach nerwowych i nasilać powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS) poprzez reakcję Fentona, dodatkowo wzmacniając kaskadę ferroptozy3. Dowody te sugerują, że ukierunkowana regulacja neurodegeneracji może być potencjalną strategią łagodzenia neurotoksyczności oksaplatiny.

Oksalplatyna (OXA), szeroko stosowany chemioterapeutyczny trzeciej generacji na bazie platyny w leczeniu raka jelita grubego, świadczy silną skuteczność przeciwnowotworową, ale często wiąże się ze znaczną neurotoksycznością. Przewlekłe podawanie często prowadzi do bólu neuropatycznego wywołanego przez OXA (OINP), z częstością zachorowalności sięgającą 60%4, charakteryzującym się mechaniczną allodynią, hiperalgezją termiczną oraz nadwrażliwością na zimno5. Pomimo częstości występowania, obecne strategie leczenia OINP pozostają niewystarczające, co znacząco obniża jakość życia pacjentów. W związku z tym wyjaśnienie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw OINP oraz identyfikacja nowych celów terapeutycznych pozostają kluczowymi obszarami trwających badań6.

Cynamaldehyd (CA), główny aktywny składnik olejku cynamonowego, to żółty, lepki płyn 7,8 o różnorodnych właściwościach biologicznych, w tym insektycydów9, antybakteryjnych10, przeciwgrzybiczych11, antyoksydacyjnych12, przeciwcukrzycowych13,przeciwnowotworowych 14, przeciwzapalnych oraz neuro-naczyniowych ochronnych15,16. Pojawiające się dowody sugerują, że CA może hamować aktywację szlaku sygnalizacyjnego JAK/STAT17. Wzór chemiczny CA to C9H8O, a jego struktura chemiczna przedstawiona jest na Rysunku 1. Jako naturalny monomer tradycyjnej medycyny chińskiej, CA wykazuje szeroki zakres właściwości farmakologicznych. W zakresie neuroprotekcji wiele badań potwierdziło, że CA może przenikać do ośrodkowego układu nerwowego przez barierę krew-mózg, wspierać ekspresję enzymów antyoksydacyjnych (takich jak HO-1 i NQO1) poprzez aktywację szlaku sygnalizacyjnego Nrf2/ARE, zmniejszać nagromadzenie ROS w komórkach nerwowych, a tym samym łagodzić uszkodzenia neurooksydacyjne podczas udaru niedokrwiennego. Choroba Alzheimera i inne choroby18,19. Jednocześnie CA może hamować hiperaktywację mikrogleju, zmniejszać uwalnianie czynników zapalnych (takich jak TNF-α, IL-1β) oraz zmniejszać reakcję neurozapalną20. Jednak nie zgłoszono, czy CA może złagodzić neurotoksyczność wywołaną przez oksalplatynę poprzez regulację szlaku ferroptozy.

Szlak sygnalizacyjny JAK2/STAT3 jest ważnym mechanizmem wewnątrzkomórkowego transdukcji sygnałów, który przekazuje sygnały odebrane z błony komórkowej do jądra komórkowego i jest ściśle powiązany z kluczowymi procesami biologicznymi, takimi jak proliferacja komórek, różnicowanie, apoptoza, stres oksydacyjny oraz reakcje zapalne21. Jako szlak ściśle powiązany z odpowiedziami zapalnymi, szlak sygnalizacyjny JAK3/STAT3 może wywoływać reakcje zapalne w stanie aktywacji, prowadząc do uszkodzenia tkanek zapalnych. Badania wskazują, że hamowanie szlaku sygnalizacyjnego JAK3/STAT3 może zmniejszyć reakcję zapalną i uszkodzenia oksydacyjne u szczurów z demencją naczyniową, poprawiając tym samym funkcje poznawcze szczurów22. Ponadto hamowanie szlaku sygnalizacyjnego JAK3/STAT3 może również łagodzić reakcję zapalną u szczurów padaczkowych, zmniejszać tempo apoptozy neuronów oraz łagodzić uszkodzenia mózgu23. Chociaż kwas kofeinowy (CA) ma pewne działanie ochronne dla układu nerwowego, nie jest obecnie jednoznacznie ustalone, czy jego efekt poprawy jest związany z regulacją szlaku sygnalizacyjnego JAK3/STAT3.

Celem tego badania jest potwierdzenie, czy inhibicja in vitro sygnalizacji JAK2/STAT3 oraz aktywacja osi LC7A11-GSH-GPX4 mogą złagodzić uszkodzenia wywołane przez OXA w komórkach DRG szczurów. Ponadto bada potencjalne działanie antyferroptotyczne CA oraz analizuje rolę kluczowych celów zidentyfikowanych w farmakologii sieciowej w modulacji stanu zapalnego w komórkach DRG.

Obecne podejścia terapeutyczne w neurotoksyczności wywołanej szczaplaryną koncentrują się głównie na chelatacji wolnych jonów platyny w celu łagodzenia uszkodzeń nerwów, na przykład stosując kompleksy wapniowo-magnezowe, z głównym celem łagodzenia ostrych neuropatii obwodowych (np. drętwienia i mrowienia w dłoniach i stopach)24. Jednak dokładne mechanizmy pozostają niejasne. Te terapie nie mają zdolności do odwrócenia przewlekłych schorzeń, takich jak zwyrodnienie aksonów czy pogorszenie się włókien nerwowych spowodowane szczawiawiną, a skuteczność w zapobieganiu kumulatywnej neurotoksyczności wykazują ograniczoną skuteczność. W tym eksperymencie badano neuroprotekcyjne działanie leczenia OXA 4 μM CA pod dawką 5 μM, łącząc mechanizmy przeciwzapalne i przeciwferroptozy. Wyniki potwierdzają, że aktywacja tego mechanizmu stanowi kluczowy etap inicjacyjny w OINP. Odkrycie specyficznych inhibitorów mogłoby zastąpić istniejące podejścia niespecyficzne, zwiększając tym samym precyzję i skuteczność interwencji terapeutycznych.

Model in vitro użyty w tym eksperymencie wykorzystuje izolowane neurony zwojowe grzbietowe (DRG) szczura do badania OINP. Jednak ten model znacznie różni się od ludzkich komórek pierwotnych pod względem tła genetycznego, cech metabolicznych i wrażliwości na toksyczność, co może utrudniać bezpośrednie kliniczne zastosowanie wniosków badawczych. Ponadto funkcjonalne utrzymanie tkanek nerwowych in vivo zależy od precyzyjnej regulacji koordynacji wielokomórkowej i dynamicznych mikrośrodowisk – złożonych czynników, których trudno w pełni odtworzyć modele in vitro .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Linia komórkowa pochodzi z linii komórkowych szczurów.

1. Analiza farmakologii sieci

UWAGA: Linki można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. Znajdowanie możliwych celów CA
    1. Pobierz informacje strukturalne z bazy danych PubChem i zbadaj potencjalne biologiczne mechanizmy CA. Następnie przeprowadź analizę predykcji celu, korzystając z SwissTargetPrediction, wykorzystując jego zaawansowane możliwości obliczeniowe.
    2. Aby zwiększyć dokładność i kompleksowość analizy, porównaj przewidywane cele z bazami danych specyficznymi dla tradycyjnej medycyny chińskiej, w tym TCMSP i TCMIP.
    3. Przejrzyj odpowiednią literaturę, aby zidentyfikować dodatkowe potencjalne cele. Zdublowanie skonsolidowanej listy celów w celu stworzenia kompleksowego zbioru danych, który będzie kluczowym źródłem do dalszych badań aktywności biologicznej i rozwoju leków związanych z CA.
  2. Identyfikacja potencjalnych celów bólu neuropatycznego (NP)
    1. Korzystając z bazy danych GeneCards i TTD, przeprowadź szeroko zakrojone wyszukiwanie za pomocą słów kluczowych "ból neuropatyczny" i "ferroptoza". Priorytetyzuj cele genów z bazy GeneCards z "Wskaźnikiem Relevancie" przekraczającym medianę, ponieważ te geny wykazują większą adekwatność dla tematu badań.
    2. Integruj wcześniej wybrane cele genowe z danymi pobranymi z TTD (Therapeutic Target Database). Zapewnij kompleksową identyfikację potencjalnych celów podczas procesu integracji, porównując wszystkie wybrane cele genów z wpisami w bazie danych TTD. Systematycznie usuwaj zduplikowane wpisy z zintegrowanego zbioru danych o celach genów. Sprawdź, czy powstały zbiór danych zawiera unikalną listę potencjalnych celów.
  3. Identyfikacja celów przecięcia "CA-NP-Ferroptosis"
    1. Określ przecięcie celów dla CA, NP i ferroptozy, korzystając z diagramu Venna wygenerowanego online.
    2. Cele te zostały wyznaczone jako potencjalni kandydaci dla "szlaku NP-ferroptozy regulowanej przez Kalifornię".
  4. Budowanie sieci interakcji białko-białko (PPI)
    1. Aby to zgłębić, należy przesłać wspólne cele dla "CA-NP-ferroptozy", "CA-NP" i "CA-ferroptozy" do bazy STRING.
    2. Ustaw próg oceny interakcji na "najwyższa pewność > 0,4" i ogranicz maksymalną liczbę interaktorów do 10 zarówno dla pierwszej, jak i drugiej warstwy interakcji. Zastosuj domyślne ustawienia dla wszystkich pozostałych parametrów i skonstruuj sieć 4,5 PPI dla "CA-NP-ferroptozy".
  5. Analizy wzbogacania GO i KEGG
    1. Prześlij cele przecięcia dla "CA-NP-ferroptozy" na platformę DAVID z następującymi parametrami: "wybierz identyfikator: oficjalny symbol genu", "typ listy: genelist" oraz "gatunek: Homo sapiens." Analiza wzbogacenia ontologii genów (GO) została przeprowadzona w trzech kategoriach: Proces biologiczny (BP), komponent komórkowy (CC) oraz funkcja molekularna (MF).
    2. Wykonaj analizę wzbogacenia ścieżki KEGG i zwizualizuj uzyskane dane za pomocą wykresów słupkowych utworzonych na platformie Hiplot.

2. Dokowanie molekularne

  1. Aby wyjaśnić interakcje między związkami aktywnymi a ich celami związanymi z chorobą, uzyskaj informacje strukturalne o substancjach aktywnych z bazy danych PubChem jako małych cząsteczek, a następnie pobierz trójwymiarowe struktury białek docelowych z Protein Data Bank (PDB) jako modele białek.
  2. Wykorzystaj PyMOL do wstępnego przetwarzania struktur receptorów białkowych poprzez usuwanie cząsteczek wody i ligandów nieistotnych. Następnie przygotować docelowe białka i substancje aktywne do dokowania za pomocą AutoDock Tools 1.5.7 oraz wykonać półelastyczne dokowanie molekularne za pomocą AutoDock Vina.
  3. Przeanalizuj energie wiązania i miejsca wiązania substancji aktywnych na białkach receptorowych. Dla białka JAK2 jego struktura (PDB ID: 3e64) została wybrana z bazy danych PDB na podstawie danych z krystalografii rentgenowskiej i optymalnej rozdzielczości.
  4. Użyj oprogramowania PyMOL do przygotowania struktury JAK2 poprzez eliminację ligandów, usunięcie cząsteczek wody i dodanie wodorów. Struktury małocząsteczkowe związków aktywnych pochodzą z PubChem.
  5. Załaduj zarówno struktury białek, jak i związków do AutoDock Tools 1.5.7, zdefiniuj skrzynki dokujące i wykonaj dokowanie molekularne za pomocą AutoDock Vina.

3. Hodowla komórkowa

UWAGA: Poniższe kroki będą wielokrotnie stosowane w eksperymencie walidacyjnym. Przestrzegaj rygorystycznych technik aseptycznych. W tej części eksperymentu używano niskoobrotowej poziomej wirówki wirnikowej.

  1. Dezynfekuj zewnętrzne opakowania i butelki hodowlane komórek sterylnych zakupionych z 75% alkoholem, a następnie przenieś je do polewek hodowlowych na super czystym stole roboczym do subhodowli do rozłożenia komórek na pięciu szalkach Petriego o średnicy 10 cm, aby zapewnić odpowiednią ilość komórek.
  2. Kriokonserwować komórki w temperaturze -80 °C do kolejnych eksperymentów.
    1. Przygotuj DMEM, DMSO do hodowli komórkowej, surowicę płodową (FBS), 15 mL probówki do wirówki, pipety, krioviale oraz kąpiel lodowaną. Zmieszaj 1 mL DMSO, 1 mL FBS i 8 mL DMEM, aby uzyskać łączną objętość 10 mL. Schłodź DMSO na lodzie przez 15 minut. Najpierw przelej podstawę do rurki wirówki, a następnie powoli dodaj schłodzone DMSO podczas obracania. Dokładnie wymieszaj pipetą, potem delikatnie dodaj FBS i mieszaj ponownie. Przechowuj mieszankę w kąpieli lodowej na później.
      UWAGA: Stężenie 20%-50% DMSO spowodowało znaczący wzrost uwalniania LDH, co wskazuje, że wysokie stężenia DMSO są cytotoksyczne, podczas gdy 10% DMSO jest stosunkowo bezpieczne. To nie wpłynęło na nasz eksperyment25.
    2. Weź komórki rosnące logarytmicznie, przemyj je 3 razy PBS, a następnie dodaj 0,25% trypsyny w misku o objętości 400 μL/10 cm.
      UWAGA: Po wystąpieniu cofania cytoplazmatycznego połączenia stają się luźne lub jeśli pojawiają się oznaki dużego unoszenia się, proces trawienia zostaje natychmiast przerwany.
    3. Przygotowanie przed trawienie: Podgrzej kluczowe odczynniki (0,25% roztwór trypsyny-EDTA oraz podłoże DRG kompletne) do 37 °C. Wyjmij kolbę z hodowli komórek z inkubatora i wyrzuć stare podłoże za pomocą sterylnej pipety, aby zapobiec wpływowi resztkowego medium na efektywność trawienia. Delikatnie przepłucz komórki jednowarstwowe hodowlane dwukrotnie sterylnym PBS o 5 mL, aby usunąć surowicę i uniknąć elucii komórek.
    4. Dodaj 2 mL rozgrzanego roztworu 0,25% trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego, zapewniając całkowite pokrycie warstwy pojedynczej komórki. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1-3 minuty. W tym okresie obserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym co 30 sekund. Natychmiast zatrzymaj trawienie, gdy większość komórek zaczyna się kurczyć, zaokrąglać i wykazywać wyraźne przestrzenie międzykomórkowe (aby zapobiec nadmiernemu trawieniu i uszkodzeniom komórek).
    5. Szybko dodaj 4 mL w pełni podgrzanego medium do naczynia do hodowli. Delikatnie pipetować mieszaninę 5 razy sterylną pipetą, aby rozproszyć skupisko komórek w zawiesinę jednokomórkową. Przenieś całą zawiesinę jednokomórkową do sterylnych rurek wirówek o pojemności 15 mL i zebrać granulki ogniwa przez wirowanie w temperaturze 300 x g 5 min, używając niskoobrotowej poziomej wirówki wirującej w 25 °C.
    6. Usuń supernatant i dodaj 5 ml przygotowanego podłoża kriopkonserwacyjnego. Delikatnie pipetą, aby równomiernie wymieszać komórki. Rozłóż je równomiernie do 5 fiolek.
    7. Oznacz kriovial nazwą komórki, datą zamrażania i operatorem; Włóż go do pojemnika do zamrażarki i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C, a następnie przelej do ciekłego azotu po nocnym przechowywaniu.
  3. Reanimacja komórek
    1. Załóż rękawiczki, wyjmij fiolkę z pojemnika z ciekłym azotem i natychmiast zanurz ją w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C, potrząśnijając ją okazjonalnie, aby zapewnić szybkie rozmrażenie (w ciągu 1 minuty).
    2. Wyjmij fiolkę z kąpieli wodnej 37 °C, otwórz korek, aspiruj zawiesinę komórkową pipetą, przelej ją do rurki wirówki, dodaj 10 razy większą objętość medium hodowlanego, dobrze wymieszaj i wiruj w 300 x g przez 5 minut (25 °C).
    3. Usuń supernatant, dodaj 5 mL pożywki hodowlowej wzbogaconej o 10% surowicę płodową bydła (kompletne podłoże dla tego stanu hodowli komórkowej), zaszczep naczynie hodowlacyjne i inkubuj statycznie w inkubatorze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 .
    4. Następnego dnia wymień podłoże hodowlane (aby usunąć pozostałości DMSO i martwe komórki) i kontynuuj obserwację hodowli pod kątem warunków wzrostu. Jeśli gęstość komórek jest wysoka, należy niezwłocznie przeprowadzić subkulturę do kolejnych eksperymentów.
  4. Liczenie komórek
    UWAGA: W tej części eksperymentu użyto niskoobrotowej poziomej wirnicy wirnikowej.
    1. Przygotuj wcześniej 75% alkoholu, aby wyczyścić komorę liczącą i pokrywę, a następnie wysusz je do późniejszego użytku.
    2. Ponownie zawiesić strawione i odcentrifugowane ogniwa w 1 mL medium oraz rozcieńczyć 50 μL zawiesiny ogniwa 150 μL medium w rurce EP o pojemności 1,5 mL, aby uzyskać czterokrotne rozcieńczenie.
    3. Oscyluj równomiernie, weź 10 μL i wstrzykuj między pokrywę a komorę liczącą, aby całkowicie wypełnić komorę, unikając przy tym powstawania pęcherzyków. Umieść pod mikroskopem do obserwacji i liczenia. Zasady liczenia: Nie pomijaj ani nie powtarzaj; Licz komórki dotykające górnej i lewej krawędzi, ale wyklucz te stykające się z dolną i prawą granicą.
    4. Zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi oblicz objętość komórek na podstawie pożądanej liczby komórek do nasiewania lub nasiewania na talerzu oraz wyników liczenia, a następnie uzupełnij całkowitą objętość medium kompletnym podłożem.

4. Protokół testu żywotności komórek

UWAGA: Duloksetyna została wybrana jako środek kontrolujący medycynę zachodnią, ponieważ jest szeroko stosowanym i klinicznie potwierdzonym lekiem w leczeniu bólu neuropatycznego obwodowego. Jej ustalona skuteczność w tym wskazaniu (wspierana przez wytyczne kliniczne i randomizowane badania kontrolowane) zapewnia, że grupa kontrolna może stanowić wiarygodne źródło odniesienia do oceny względnej skuteczności interwencji testowej.

  1. Najpierw usuń stare medium hodowlane z naczynia hodowlanego i przepłucz powierzchnię komórki 5 mL PBS, aby usunąć surowicę pozostałą. Następnie dodaj 2 mL roztworu trypsyny-EDTA o stężeniu 0,25% i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1-3 minuty. Gdy mikroskopowa obserwacja ujawni kurczenie się komórek, zaokrąglenie i odwarstwienie, natychmiast należy dodać 4 mL DRG Complete Medium, aby zakończyć trawienie i ponownie zawiesować komórki przez pipetowanie.
  2. Przenieś zawiesinę do rurki wirówki i zbierz granulkę ogniwa, wirując w 300 x g przez 5 minut w niskoobrotowej poziomej wirówce wirnikowej w 25 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w rurce wirówki o pojemności 15 mL, następnie dokładnie zawiesij i wymieszaj zawiesinę.
  3. Weź probówkę EP o pojemności 1,5 mL i najpierw dodaj 150 μL pożywki hodowlanej, a następnie 50 μL zawiesiny komórkowej. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać czterokrotne rozcieńczenie.
  4. Następnie użyj alkoholu 75% do czyszczenia komory liczącej i przykrycia szkła, wysusz je i równomiernie potrząsaj rurką EP.
  5. Wyjmij 10 μL zawiesiny ogniwowej i wstrzykni je między szkło pokrywowe a komorę liczącą, zapewniając, że ciecz wypełni komorę liczącą bez powstawania pęcherzyków.
  6. Obserwuj pod mikroskopem i licz liczbę komórek zgodnie z zasadą liczenia, unikając pominięć lub duplikacji.
    UWAGA: Jeśli liczba zliczonych komórek wynosi n, to stężenie komórek w rurce wirówki wynosi n/mL.
  7. Zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi, należy zasiać komórki w 96-dołkowej płycie o gęstości 2 000 komórek na odwiert, jeśli jest to potrzebne.
  8. Najpierw wstrzyknąć 200 μL PBS do każdego dołku obwodowego okręgu płyty 96-dołkowej, a następnie dodać pożywkę zawierającą komórki zgodnie z grupą.
  9. Po wysybaniu w inkubatorze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 przez 24 godziny, zasysaj stary podłoże i przemyj dwukrotnie 200 μL PBS. Zgodnie z układem eksperymentalnym rozcieńczaj CA stopniowo (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) i dodaj 200 μL do płyty z 96 dołkami.
  10. Należy je wcześniej obejmować OXA (5 μM) przez 24 godziny, a następnie odpowiednio przez 24 godziny traktować komórki DRG o różnych stężeniach CA (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM).
    UWAGA: Ta część eksperymentu ma na celu określenie optymalnego stężenia leku dla CA.
  11. Przemyj płytę 96-dołową trzykrotnie buforem PBS, a następnie dodaj 200 μL świeżo przygotowanego roztworu roboczego CCK-8 do każdego dołu. Ten etap wykonywany jest w ciemności, a czas eksperymentu jest kontrolowany tak, aby zakończył się w ciągu 10 minut. Inkubuj roztwór przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 . Na koniec zmierz wartości absorpcji za pomocą czytnika mikropłyt. Powtórz wszystkie eksperymenty co najmniej trzy razy w identycznych warunkach.

5. MDA

  1. Nasiać 10 ×10 6 komórek DRG w naczyniu o średnicy 15 cm i hodować przez noc w inkubatorze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 . Usuń podłoże hodowlane, dodaj leki i inkubuj przez 24 godziny w inkubatorze 37 °C, wilgotności 95% i stężeniuCO2 .
  2. Usuń podłoże i raz przemyj 5 mL PBS. Po trawieniu należy zebrać komórki do stożkowej rurki za pomocą medium DMEM.
  3. Dodaj odpowiednio poddane poddane komórki DRG do mikrorurek o pojemności 5 mL. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w niskoobrotowej poziomej wirówce wirnikowej i usuń supernatant. Następnie dodaj 1 mL PBS, wymieszaj pipetowanie i przelej do nowej mikrorurki 1,5 mL. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w niskoobrotowej poziomej wirówce wirnikowej i usuń supernatant.
  4. Dodaj 100 μL roztworu PBS przeciwutleniacza, wymieszaj pipetą i przygotuj zawiesinę komórkową. Przygotuj rozwiązanie standardowe MDA.
    UWAGA: Zobacz przygotowanie standardowego roztworu MDA metodą fluorescencji; szczegółowe procedury znajdują się w sekcji "Komponenty zestawu".
  5. Dodaj odpowiednio 100 μL buforu lizy do probówki i standardowej probówki i dokładnie wymieszaj za pomocą oscylatora wirowego. Zostaw go w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Dodaj 250 μL przygotowanego roztworu roboczego do każdej probówki i dokładnie wymieszaj za pomocą mieszacza wirowego. Podgrzej kąpiel wodną do 95 °C w naturalnym świetle przez 15 minut, a następnie włóż ją do kąpieli lodowej na 5 minut, aby ostygła. Wirówka wirowata o dużej prędkości o napięciu 10 000 x g przez 10 minut (4 °C).
  7. Weź 100 μL supernatantu i dodaj go do czarnej płyty z 96 dołkami. Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłyt fluorescencyjnych (np. 540 nm, Em: 590 nm). Oblicz stężenie MDA w próbie na podstawie krzywej standardowej.

6. Zawartość Fe2+ w komórkach mierzona za pomocą zestawudo wykrywania Fe2+

  1. Wcześniej podgrzej kąpiel wodną i podnieś temperaturę do 37 °C. Załóż rękawice, wyjmij ogniwa DRG z ciekłego azotu, owiń je warstwą plastikowej torby, a następnie zanurz w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C, delikatnie potrząśnij, aby zapewnić całkowite rozmrażenie w ciągu 1 minuty.
  2. Po rozmrożeniu wyjmij fiolkę z kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, otwórz nakrętkę, zasysaj zawiesinę komórkową, przelej ją do rurki wirówki o pojemności 15 mL i dodaj 10 ml medium hodowlanego krople, dokładnie mieszając. Niskoobrotowa pozioma wirówka wirnikowa o wydajności 300 x g przez 5 minut (25 °C).
  3. Po wirowaniu odrzuć supernatant, dodać 10 ml świeżego medium hodowlanego, podłączyć pipetą do dokładnego wymieszania i ponownie wirować. Powtórz ten zabieg 3 razy przed zaszczepieniem nowych pomieszczeń do hodowli.
  4. Komórki hodować statycznie w inkubatorze 37 °C, wilgotności 95% i stężeniuCO2 . Następnego dnia wymień podłoże, aby usunąć pozostałości DMSO i martwe komórki, a następnie kontynuuj uprawę. Jeśli gęstość komórek jest wysoka, subkultura jest odpowiednia na czas. Następnie zbiera komórki w fazie wzrostu logarytmicznego, trawi je, wiruje i ponownie zawiesza. Nasiaj ponownie zawiesowane komórki na płytki z 12 dołkami o gęstości 70%-80%, a następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 , aby kontynuować uprawę.
  5. Następnego dnia obserwuj stan komórek, stosuje odpowiednie zabiegi zgodnie z eksperymentalnym układem, a następnie umieszcza je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 , aby kontynuować uprawę.
  6. Po 24 godzinach podania leku należy wyrzucić oryginalne medium hodowlane i raz przemyć komórki PBS. Dodaj 300 μL/dołek sondy FerroOrange (1 μM) rozcieńczonej w HBSS i inkubuj w temperaturze 37 °C, wilgotności 95%, stężeniu dwutlenku węgla 5% przez 30 minut.
  7. Następnie dodaj do płytki żywej roztwór barwienia komórek Hoechst 33342 (100x) w stosunku 1:100, inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut, aby zabarwić jądra komórkowe.
  8. Obserwuj efekt barwienia pod mikroskopem fluorescencyjnym i rób zdjęcia do dokumentacji. Następnie użyj ImageJ do obliczenia średniej intensywności fluorescencji, a eksperyment powtarza się trzy razy do analizy statystycznej.

7. Zestaw detekcji ROS

  1. Weź komórki w fazie logarytmicznego wzrostu, traw, wiruj i ponownie zawiesaj, a następnie zasiewaj komórki na 12-dołowej płycie o gęstości (70%-80%). Po dokładnym wymieszaniu komórek umieść je w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 , aby kontynuować uprawę.
    UWAGA: W przypadku etapów trawienia, wirowania i ponownej zawiesiny należy odnieść się do kroku 4.1.
  2. Następnego dnia obserwuj stan komórek, podaj odpowiednie zabiegi zgodnie z eksperymentalnym układem, a następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 , aby kontynuować hodowlę. Po 24 godzinach podawania leku należy odrzucić oryginalne medium hodowlane i dwukrotnie przemyć komórki HBSS.
  3. Dodaj 200 μL bardzo czułego roztworu roboczego barwnika DCFH-DA, a następnie inkubuj w 37 °C, 95% wilgotności, 5%CO2 inkubatora przez 30 minut.
  4. Usuń supernatant, przepłucz dwukrotnie HBSS i barw 2 μL roztworu do barwienia żywych komórek Hoechst 33342 (100x) przez 5 minut, a następnie zbadaj pod mikroskopem fluorescencyjnym. Powtórz eksperyment trzy razy z analizą statystyczną.

8. Morfologia mitochondrialna komórek obserwowanych za pomocą TEM

  1. Usuń pożywkę hodowlową z dobrze wyhodowanych komórek, dodaj 1 mL roztworu utrwalacza glutaraldehydu w temperaturze pokojowej o temperaturze pokojowej i utrwal komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez około 5 minut. Delikatnie zeskrobaj komórki w jednym kierunku za pomocą skrobaka do komórek.
  2. Przenieś zawiesinę ogniwa do rury wirówki i wirować w temperaturze 25 °C, 600 x g przez 3 minuty, używając niskoobrotowej poziomej wirówki wirnikowej.
  3. Po odrzuceniu nadmiaru roztworu utrwalającego dodaj świeży utrwalacz mikroskopii elektronowej (użyj 1 ml na dołek dla płytki 12-dołkowej) i utrwal w temperaturze pokojowej, z dala od światła przez 30 minut, a następnie przenieś do 4 °C w celu przechowywania.
  4. Infiltracja odwodnienia: Wkładaj próbkę do płytki osadzającej i umieść ją na noc w piekarniku o temperaturze 37 °C.
  5. Polimeryzuj medium osadzające w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 48 sekund. Wycinaj ultracienkie przekroje o długości 60-80 nm za pomocą ultramikrotomu.
  6. Barw fragmenty roztworem nasyconego alkoholu z 2% octanem uranylu przez 15 minut, a następnie cytrynian ołowiu przez kolejne 15 minut. Susz zabarwione fragmenty przez noc w temperaturze pokojowej. Obserwuj i fotografuj te przekroje pod mikroskopem transmisyjnym elektronowym.

9. Western blotting

  1. Wyodrębnić całkowite białko komórek
    1. Traktuj i zaszczepiaj komórki w szalce Petriego o średnicy 6 cm, aż osiągną 70% gęstości.
      UWAGA: Instrukcje dotyczące odnowienia i szczepienia komórek znajdują się w kroku 3.3.
    2. Do naczynia do hodowli dodaj 3 mL OA (5 μM), a po 4 godzinach CA (4 μM).
    3. Przygotuj wcześniej pudełko lodu, wstępnie schłodzić PBS, skrobaczki do komórek, przygotowany bufor lizowy oraz kilka oznaczonych tubek EP.
    4. Po leczeniu lekowym usuń podłoże hodowlane z komórek i przemyj je dwukrotnie schłodzonym PBS. Wykonuj ten proces na lodzie i aspiruje wszelkie pozostałości PBS za pomocą wirówki próżniowej.
    5. Oznacz każdą szalkę Petriego, następnie dodaj 300 μL buforu lizyzowego i pozostaw na lodzie przez 5 minut z ciągłym mieszaniem, aby zapobiec niepełnej lizie i zamrożeniu.
    6. Następnie użyj wcześniej schłodzonej skrobki do ogniw, aby odłączyć przylegające komórki, zbierając 300 μL do rurki EP po każdym zeskrobaniu. Używaj nowego skrobaka do komórek przy każdym skrobaniu i nie używaj go ponownie.
    7. Trzymaj górę rurki EP i dokładnie wymieszaj na mikserze wirowym, a następnie przez 25 minut wstawiaj ją do lodu. W tym momencie włącz wcześniej wirówkę o wysokiej prędkości 4 °C z kątowym wirnikiem, ponieważ wstępne schładzenie wirówki wymaga określonego czasu.
    8. Po zakończeniu timera ponownie wiruj, a następnie wysokoobrotowa wirówka kątowa o pojemności 4500 x g przez 15 minut w wirówce 4 °C.
    9. Teraz włącz podgrzewacz w suchej kąpieli i ustaw temperaturę na 100 °C.
    10. Wyjmij zestaw do ilościowania białka BCA, dodaj próbki i odczynniki do płytki z 96 dołkami, dobrze wymieszaj i reaguj w inkubatorze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2 przez 30 minut. Zmierz zawartość wyekstrahowanego białka za pomocą wielofunkcyjnego czytnika mikropłyt, a następnie dostosuj pozostały bufor lizowy na podstawie wyników, aby zapewnić spójność stężenia każdej próbki.
    11. Na koniec, w zależności od zawartości każdego supernatantu, dodaj 1/5 objętości buforu obciążenia 6×, aby przygotować system obciążenia białkiem. Ostrożnie wciągnij 150 μL supernatantu do nowej rurki EP. Dodaj 30 μL bufora ładowania 6× do supernatantu i dokładnie wymieszaj (zazwyczaj w stosunku 1:5). Przechowuj mieszankę na lodzie.
    12. Następnie podgrzej 100 °C na grzejniku przez 6 minut, uważając, by przytrzymać korek rurki EP, aby nie wyskoczyła. Po podgrzaniu schłodzić ją w kąpieli lodowej.
  2. Przygotuj żel białkowy o stężeniu 10%.
    1. Płucz płytkę żelową czystą wodą, susz ją na powietrzu, wytrzyj nadmiar wilgoci i unikaj plam i kurzu tak bardzo, jak to możliwe.
    2. Wyjmij stojak do odlewania żelu, z krótkimi płytkami z dwóch szklanych płyt z przodu i długimi z tyłu, wyrównując dno tak, aby szczelina między szklanymi płytkami ściśle pasowała do taśmy uszczelniającej na dole podstawki, aby zapobiec przeciekowaniu, a następnie mocno zaciskaj płytki, przygotowując się do odlewania żelowego.
    3. Przygotuj dolny żel z 6 mL czystej wody, 3,75 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL 10% SDS, 5 mL 30% Acry/bis, 75 μL 10% APS oraz 7,5 μL TEMED.
    4. Delikatnie mieszaj, aby uniknąć pienienia, a następnie szybko i równomiernie dodaj między dwie szklane płytki, zostawiając miejsce na górny żel. Następnie spłaszcz powierzchnię cieczy 1 mL izopropanolu i pozostawij na około 30 minut.
    5. Opłucz grzebień czystą wodą do przygotowania żelu, susz na powietrzu i odłóż na bok. Gdy dolny żel całkowicie zastygnie, wylej izopropanol, ostrożnie opłucz 2-3 razy czystą wodą, wchłonij płyn i odwróć płytę żelową, aby spuścić resztki płynu.
    6. Przygotuj żel do układania górnej warstwy z 6 mL czystej wody, 2,5 mL 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 mL 10% SDS, 1,34 mL 30% Acry/bis, 50 μL 10% APS oraz 10 μL TEMED.
    7. Wypełnij górną warstwę i ostrożnie włóż grzebień o grubości 15 dołków i grubości 1,5 mm. Po 1-2 minutach uzupełnij szczeliny, uważając na minimalizację powstawania bąbelków podczas tego procesu. Użyj w pełni zpolimeryzowanego żelu.
  3. Elektroforeza żelowa białkowa
    1. Wstępnie skonfigurować bufor działający i bufor transferowy, a bufor transferowy jest wstępnie schładzony w lodówce o temperaturze 4°C.
    2. Przepłucz żel białkowy wodą ultraczystą, wyjmij czysty zbiornik elektroforezy, zaciskaj dwie krótkie płytki żelu białkowego do środka i naprzeciwko siebie, wlej do środka bufora i sprawdź, czy nie ma wycieków.
    3. Ostrożnie wyjmij grzebień, załaduj 10 μL na dołek z łącznie 4 grupami próbek. Załaduj 3 grupy próbek na żel, rozdzielone przez 4 μL markery białkowe między każdą grupą, co daje łącznie 15 dołków.
    4. Po załadowaniu próbek wlej cały pozostały bufor do zbiornika elektroforezy, przykryj go pokrywką, ustaw napięcie na 140 V i wykonaj elektroforezę o stałym napięciu przez 20 minut.
    5. Gdy pasma białkowe wchodzą do żelu separacyjnego po stężeniu, dostosuj napięcie do 120 V dla elektroforezy przy stałym napięciu. Podczas tego procesu zanurz membranę NC w buforze transferowym. Zatrzymaj elektroforezę, gdy błękit bromofenolu wskazuje, że próbka dotarła do dolnej krawędzi żelu, i przygotuj się do transferu błonowego.
    6. Napełnij piankowe pudełko lodem do połowy, wyjmij zacisk transferowy, schłodzony bufor transferowy i namoczoną membranę NC. Wlej połowę bufora transferowego do płaskiego pojemnika kwadratowego.
    7. Wyjmij żel proteinowy, dokładnie go przepłucz ultraczystą wodą, połóż czarną stronę skierowaną do dołu, a przezroczystą do góry. Na środku ułóż jedną warstwę gąbki, jedną warstwę papieru filtracyjnego, żel białkowy, membranę NC, a następnie kolejną warstwę papieru filtrującego i gąbki.
    8. Po naciśnięciu pęcherzyków powietrza zacisnij kasetę transferową i umieść ją w zbiorniku transferowym. Gdy oba żele białkowe są w pełni włożone, wlej cały bufor transferowy do zbiornika transferowego, następnie dodaj dwa okłady chłodzące i przykryj pokrywką.
    9. Otocz kasetę transferową lodem i przesyłaj przy stałym napięciu 120 V przez 90 minut. Proces transferu generuje znaczne ciepło, dlatego do chłodzenia potrzebna jest kąpiel lodowa.
    10. Wyjmij membranę NC, zanurz i barw w 20 mL roztworu barwienia Ponceau S, zaznacz rozmiar markera ołówkiem i przetnij błonę ołówkiem zgodnie z rozmiarem docelowego białka, które ma być wykrywane.
    11. Odzyskaj roztwór barwiący Ponceau S. Zmyj roztwór barwiący PBS i inkubuj membranę NC z 20 mL buforu blokującego, następnie blokuj w temperaturze pokojowej na shakerze z niską prędkością przez 1-2 godziny.
    12. Usuń roztwór blokujący, szybko dwukrotnie opłukaj błonę PBS na shakerze odbarwiającej, aby dokładnie usunąć roztwór blokujący, następnie dodaj odpowiadające im przeciwciała zgodnie z proporcjami zużycia każdego przeciwciała w pudełku inkubacyjnym Western Blot i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
    13. Oddzielnie odzyskaj przeciwciała pierwotne i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Błony były szybko myte 4 razy za pomocą TBST na shakerze odbarwiającej, po 5 minut za każdym razem, aby dokładnie usunąć pierwotne przeciwciała. Następnie dodaj 4 mL buforu blokującego z przeciwciałami wtórnymi i inkubuj błony w temperaturze pokojowej na powolnym shakerze przez 1 godzinę.
    14. Przemyj przeciwciało wtórne cztery razy buforem TBST przez 5 minut każdy, a następnie zamień go buforem PBS, aby całkowicie zwilżyć błonę NC.
    15. Zgodnie z instrukcją do odczynników chemiluminescencyjnych ECL, przygotuj roztwór luminescencyjny i wlej go na powierzchnię błony, a następnie inkubuj przez 1-2 minuty przed wywołaniem za pomocą systemu obrazowania żelowego.
    16. Przetworz surowe dane w systemie obrazowania Image J, a następnie przenieś je do oprogramowania Photoshop do tworzenia postaci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Farmakologia sieciowa i dokowanie molekularne
Identyfikacja potencjalnych celów CA: W kompleksowym badaniu aktywności farmakologicznej CA skrupulatnie wyselekcjonowano 60 potencjalnych celów na podstawie obszernego przeglądu odpowiedniej literatury. Aby jeszcze bardziej rozszerzyć zakres analizy, za pomocą bazy TCMSP zidentyfikowano kolejne 12 potencjalnych celów związanych z CA. Dla zwiększenia dokładności i dokładności zastosowano zaawansowane możliwości predykcyjne platformy SwissTargetPrediction...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ferroptoza, niedawno zidentyfikowany tryb śmierci komórkowej, charakteryzuje się nadmiernym nagromadzeniem żelaza wewnątrzkomórkowego i peroksydacją lipidów. Morfologicznie ferroptoza objawia się kurczeniem mitochondriów, utratą lub redukcją struktur kryszt oraz wzrostem gęstości błony, podczas gdy błona komórkowa i morfologia jądrowa pozostają nienaruszone26. Mechanistycznie ferroptoza jest napędzana przez wyczerpanie glutationu (GSH) oraz zaburzoną aktywność GPX4, co zapobiega metabolizmowi nadt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów finansowych do ujawnienia

Podziękowania

Wyrażamy głęboką wdzięczność za doskonałe warunki zapewniane przez szpital i jego oddziały, które umożliwiły nam osiągnięcie tych rezultatów. Jednocześnie składamy serdeczne podziękowania wielu członkom laboratorium za ich niestrudzoną pracę i cenny wkład przez lata. Ciężka praca każdego uczestnika jest nieodłączną częścią naszego sukcesu i w przyszłości będziemy nadal współpracować, aby rozwijać się w dziedzinie medycyny. Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (82104838), Program Spark Fundacji Promocji Chin (XH-D001), Prowincjonalny Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Liaoning (2024JH2/102500062) oraz Prowincjonalna Fundacja Nauk Przyrodniczych Liaoning (2025-MSLH-490).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  GlycineBiofroxx1275KG001
  Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0,5  M  Bufor Tris-HCl (pH  6,8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7,5)BeyotimeST775
1,5  M  Bufor Tris-HCl (pH  8,8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Podstawowy zasilacz elektroforezyBIO-RAD PowerPac Basic
Zestaw do ilościowania białek BCABeyotimeP0012
Przeciwciało rekombinowane przeciwko beta-aktynieHuabio81115-1-RR
Inkubator dwutlenku węglaThermo150L
Zestaw testowy CCK-8ApexbioK1018
Zestaw do testowania aktywności komórkowej i cytotoksycznościBeyotimeC2015M
Cynamaldehyd (CA)MacklinC805134Czystość 98%
Shaker dekoloryzującyKylin-BellTS-100
DMEM (Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Zwoj korzenia grzbietowego (DRG)Fuheng BioFH165Numer seryjny: 20211227-1
DRG pełne mediumFuheng BioFH-DRG
Roztwór luminescencyjny ECLThermo34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fetal  Bovine  SerumMacklinFO193
Sonda detekcji jonów żelaznych - FerroOrangeDojindoF374
FTH1Technologia sygnalizacji komórkowej4393S1:1000
System obrazowania żelowegoBIO-RAD ChemiDoc Touch
Zrównoważony Roztwór Soli Hanksa (HBSS)SolarbioH1025
Wysokoobrotowa chłodnicza wirówkaEppendorf5804R
Hoechst 33342 Roztwór do barwienia komórek żywychBeyotimeC1028
Zestaw immunohistochemicznyBiosharpBS-24-PB
System mikroskopu fluorescencyjnego odwróconegoLeicaLeica Dmi 8
JAK2 Rekombinowane Przeciwciało Monoklonalne dla królika [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Laboratoryjny mikroskop kontrastowy z odwróconą faząLeicaLeica Dmi 1
Wirówka o niskich prędkościachEppendorf5804
Zestaw do wykrywania treści MDASangonD799762
Czytnik mikropłytSUNRISE  TECAN
Wielofunkcyjny czytnik mikropłytBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-κ Przeciwciało poliklonalne B p65Proteintech10745-1-AP1:1000
ParaformaldehydMacklinP804536
Roztwór barwienia PonceauBeyotimeP0022
Marker białkaThermo26617
P-STAT3 (Ser727)Technologia sygnalizacji komórkowej9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Technologia sygnalizacji komórkowej9145S1:2000
Rekombinowane przeciwciało przeciw nadoksydazie antyglutationowej 4[EPNCIR144]abcamab1250661:1000
Rekombinowane przeciwciało anty-XCT[EPR27115-64]abcamab3076011:1000
Zestaw do testowania ROSDojindoR252
SDS-PAGE Bufor Ładowania Białek (6X)BeyotimeP0289
Odtłuszczone mleko w proszkuBiosharpBS102-500g
SDS siarczan dodecylosiarczanu soduBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSC-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000,5 & mikro; g/mL
Tween80SelleckS6702
Ultraczysty stół warsztatowyHDLDL-CJ-2NDI
Mikroskop pionowyOlympusCX 31
Pionowa elektroforezaBIO-RAD Mini Protean Tetra
Zbiornik transferowy na mokroBIO-RAD Mini Trans Blot
&alfa;-Tubulin&alfa;-TubulinER130905
GraphPad PrismAnaliza statystyczna
Oprogramowanie ImageJUzyskaj wartość szarości białkowej plamy

Bibliografia

  1. Dolma, S., Lessnick, S. L., Hahn, W. C., Stockwell, B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 3 (3), 285-296 (2003).
  2. Ye, L. F., et al. Radiation-induced lipid peroxidation triggers ferroptosis and synergizes with ferroptosis inducers. ACS Chem Biol. 15 (2), 469-484 (2020).
  3. Huang, L., Bian, M., Zhang, J., Jiang, L. Iron metabolism and ferroptosis in peripheral nerve injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 5918218(2022).
  4. Hao, D., et al. Supercritical fluid extract of Angelica sinensis promotes the anti-colorectal cancer effect of oxaliplatin. Front Pharmacol. 13, 1007623(2022).
  5. Binder, A., et al. Pain in oxaliplatin-induced neuropathy: sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur J Cancer. 43 (18), 2658-2663 (2007).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Dorri, M., Hashemitabar, S., Hosseinzadeh, H. Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) as an antidote or a protective agent against natural or chemical toxicities: a review. Drug Chem Toxicol. 41 (3), 338-351 (2018).
  8. Hajimonfarednejad, M., et al. Cinnamon: a systematic review of adverse events. Clin Nutr. 38 (2), 594-602 (2019).
  9. Zaio, Y. P., et al. Cinnamaldehyde and related phenylpropanoids, natural repellents, and insecticides against Sitophilus zeamais (Motsch.): a chemical structure-bioactivity relationship. J Sci Food Agric. 98 (15), 5822-5831 (2018).
  10. Thirapanmethee, K., et al. Cinnamaldehyde: a plant-derived antimicrobial for overcoming multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection. Eur J Integr Med. 48, 101376(2021).
  11. Bi, Z., et al. Improvement of mould resistance of wood with cinnamaldehyde chitosan emulsion. Wood Sci Technol. 56 (1), 187-204 (2022).
  12. Qureshi, K. A., et al. Cinnamaldehyde-based self-nanoemulsion (CA-SNEDDS) accelerates wound healing and exerts antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory effects in rats' skin burn model. Molecules. 27 (16), 5225(2022).
  13. Safaei, F., Tamaddonfard, E., Nafisi, S., Imani, M. Effects of intraperitoneal and intracerebroventricular injection of cinnamaldehyde and yohimbine on blood glucose and serum insulin concentrations in ketamine-xylazine-induced acute hyperglycemia. Vet Res Forum. 12 (2), 149-156 (2021).
  14. Al Tbakhi, B., et al. Cinnamaldehyde-cucurbituril complex: investigation of loading efficiency and its role in enhancing cinnamaldehyde in vitro anti-tumor activity. RSC Adv. 12 (12), 7540-7549 (2022).
  15. Zhu, R., et al. Cinnamaldehyde in diabetes: a review of pharmacology, pharmacokinetics and safety. Pharmacol Res. 122, 78-89 (2017).
  16. Yang, D., et al. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of cinnamaldehyde on protecting high glucose-induced damage in cultured dorsal root ganglion neurons of rats. Chin J Integr Med. 22 (1), 19-27 (2016).
  17. Malemud, C. J. Negative regulators of JAK/STAT signaling in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 18 (3), 484(2017).
  18. Zhang, Q., et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 34, 43-63 (2021).
  19. Bagheri-Mohammadi, S., Askari, S., Alani, B., Moosavi, M., Ghasemi, R. Cinnamaldehyde regulates insulin and caspase-3 signaling pathways in the sporadic Alzheimer's disease model: involvement of hippocampal function via IRS-1, Akt, and GSK-3β phosphorylation. J Mol Neurosci. 72 (11), 2273-2291 (2022).
  20. Fu, Y., et al. Trans-cinnamaldehyde inhibits microglial activation and improves neuronal survival against neuroinflammation in BV2 microglial cells with lipopolysaccharide stimulation. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4730878(2017).
  21. Guo, B., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway with natural plants and phytochemical ingredients: a novel therapeutic method for combatting cardiovascular diseases. Biomed Pharmacother. 172, 116313(2024).
  22. Gao, Y., et al. Modified Erchen decoction ameliorates cognitive dysfunction in vascular dementia rats via inhibiting JAK2/STAT3 and JNK/BAX signaling pathways. Phytomedicine. 114, 154797(2023).
  23. Hu, Q. P., et al. Genistein protects epilepsy-induced brain injury through regulating the JAK2/STAT3 and KEAP1/NRF2 signaling pathways in developing rats. Eur J Pharmacol. 912. 912, 174620(2021).
  24. Kang, L., Tian, Y., Xu, S., Chen, H. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment. J Neurol. 268 (9), 3269-3282 (2021).
  25. Brayton, C. F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. 76 (1), 61-90 (1986).
  26. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (3), 234-245 (2008).
  27. Xiao, Z., La Fontaine, S., Bush, A. I., Wedd, A. G. Molecular mechanisms of glutaredoxin enzymes: versatile hubs for thiol-disulfide exchange between protein thiols and glutathione. J Mol Biol. 431 (2), 158-177 (2019).
  28. Georgiadis, M. M., et al. Small-molecule activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 reduces DNA damage induced by cisplatin in cultured sensory neurons. DNA Repair (Amst). 41, 32-41 (2016).
  29. Wei, G., et al. Platinum accumulation in oxaliplatin-induced peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 26 (1), 35-42 (2021).
  30. Maung, K., Chu, E., Rothenberg, M. Oxaliplatin combinations as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2 (2), 78-80 (2002).
  31. Egashira, N., et al. Mexiletine reverses oxaliplatin-induced neuropathic pain in rats. J Pharmacol Sci. 112 (4), 473-476 (2010).
  32. Lainez, S., Tsantoulas, C., Biel, M., McNaughton, P. A. HCN3 ion channels: roles in sensory neuronal excitability and pain. J Physiol. 597 (17), 4661-4675 (2019).
  33. Siau, C., Bennett, G. J. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in chemotherapy-evoked painful peripheral neuropathy. Anesth Analg. 102 (5), 1485-1490 (2006).
  34. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci Lett. 458 (2), 93-95 (2009).
  35. Carozzi, V. A., Canta, A., Chiorazzi, A. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: what do we know about mechanisms. Neurosci Lett. 596, 90-107 (2015).
  36. Di Cesare Mannelli, L., et al. Glial role in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Exp Neurol. 261, 22-33 (2014).
  37. Ta, L. E., Espeset, L., Podratz, J., Windebank, A. J. Neurotoxicity of oxaliplatin and cisplatin for dorsal root ganglion neurons correlates with platinum-DNA binding. Neurotoxicology. 27 (6), 992-1002 (2006).
  38. Bobylev, I., Joshi, A. R., Barham, M., Neiss, W. F., Lehmann, H. C. Depletion of mitofusin-2 causes mitochondrial damage in cisplatin-induced neuropathy. Mol Neurobiol. 55 (2), 1227-1235 (2018).
  39. Nassini, R., et al. Oxaliplatin elicits mechanical and cold allodynia in rodents via TRPA1 receptor stimulation. Pain. 152 (7), 1621-1631 (2011).
  40. Lee, J. H., Kim, W. The role of satellite glial cells, astrocytes, and microglia in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Biomedicines. 8 (9), 324(2020).
  41. Makker, P. G., et al. Characterisation of immune and neuroinflammatory changes associated with chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 12 (1), e0170814(2017).
  42. Holmes, J., et al. Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, cisplatin, and ormaplatin in a Wistar rat model. Toxicol Sci. 46 (2), 342-351 (1998).
  43. Podratz, J. L., et al. Cisplatin-induced mitochondrial DNA damage in dorsal root ganglion neurons. Neurobiol Dis. 41 (3), 661-668 (2011).
  44. Trecarichi, A., et al. Preclinical evidence for mitochondrial DNA as a potential blood biomarker for chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 17 (1), e0262544(2022).
  45. Mao, Y. F., et al. Edaravone, a free radical scavenger, is effective on neuropathic pain in rats. Brain Res. 1248, 68-75 (2009).
  46. Kim, H. K., Zhang, Y. P., Gwak, Y. S., Abdi, S. Phenyl N-tert-butylnitrone, a free radical scavenger, reduces mechanical allodynia in chemotherapy-induced neuropathic pain in rats. Anesthesiology. 112 (2), 432-439 (2010).
  47. Han, R., Li, X., Gao, X., Lv, G. C. Cinnamaldehyde: pharmacokinetics, anticancer properties and therapeutic potential. Mol Med Rep. 30 (3), 163(2024).
  48. Liao, J. C., et al. Anti-inflammatory activities of Cinnamomum cassia constituents in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012, 429320(2012).
  49. Liu, P., et al. Cinnamaldehyde suppresses NLRP3-derived IL-1β via activating succinate/HIF-1 in rheumatoid arthritis rats. Int Immunopharmacol. 84, 106570(2020).
  50. Li, X., Wang, Y. Cinnamaldehyde attenuates the progression of rheumatoid arthritis through down-regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Inflammation. 43 (5), 1729-1741 (2020).
  51. Dai, X. Y., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway for chronic pain. Aging Dis. 15 (1), 186-200 (2024).
  52. Reddy, A. M., et al. Cinnamaldehyde and 2-methoxycinnamaldehyde as NF-κB inhibitors from Cinnamomum cassia. Planta Med. 70 (9), 823-827 (2004).
  53. Youn, H. S., et al. Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligomerization. Biochem Pharmacol. 75 (2), 494-502 (2008).
  54. Chen, X., Kang, R., Kroemer, G., Tang, D. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 218 (6), e20210518(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Neuroprotekcja cynamaldehydemneurotoksyczność oksaliplatynyzwoje korzeni grzbietowychszlak ferroptozysygnalizacja JAK2 STAT3ekspresja GPX4test peroksydacji lipidówreaktywne formy tlenuanaliza ekspresji białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.