Artykuł metodologiczny

Prekondycjonowanie termiczne podczas perfuzji płuc ex vivo w celu rehabilitacji uszkodzonych przeszczepów płuc przed przeszczepem

697 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69084

⸱

31 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten prezentuje model perfuzji płuc ex vivo szczura, który uwzględnia przejściową ekspozycję na skalibrowane obciążenie termiczne, promując endogenne mechanizmy ochronne dla terapeutycznego odnowienia uszkodzonych przeszczepów płuc. Podejście to jest skalowalne i powtarzalne oraz wspiera rozwój terapii niefarmakologicznych, które poprawiają skuteczność przeszczepów płuc.

Streszczenie

Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) stała się przełomem w przeszczepach płuc, umożliwiając zarówno funkcjonalną ocenę płuc dawcy, jak i interwencje terapeutyczne w celu rehabilitacji przeszczepów marginalnych. Strategie rekondicjonowania obejmują podejścia farmakologiczne i niefarmakologiczne. Wśród tych ostatnich wykazaliśmy, że przejściowy, kontrolowany stres cieplny ("Termiczne Prekondycjonowanie", TP) jest skutecznym sposobem przywracania uszkodzonych płuc poprzez wywołanie endogennej ochronnej reakcji termicznej. Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół modelu EVLP szczurów, który wykorzystuje TP do rekondycjonowania płuc poddanych gorącej niedokrwieniu, symulując oddanie po śmierci krążeniowej (DCD). Protokół szczegółowo opisuje przygotowanie płuc, kanylację, perfuzję oraz indukcję reakcji na wstrząs cieplny. TP polega na 30-minutowym podwyższeniu temperatury perfuzacji do 41,5 °C na początku EVLP, po czym następuje szybki powrót do 37 °C na resztę perfuzji. W modelu EVLP o długości 6 godzin płuca leczone TP (n = 30) wykazały zwiększoną ekspresję białka 70 wywołanego szokiem cieplnym, poprawę statycznej podatności płuc, zmniejszenie obrzęku, niższe uwalnianie czynnika von Willebranda (biomarkera uszkodzenia śródbłonka) oraz osłabienie uszkodzeń histologicznych w porównaniu z grupą kontrolną (n = 30). Protokół umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym oporu naczyniowego, ciśnienia w drogach oddechowych, zgodności płuc oraz natlenienia, a także wspiera analizy molekularne i morfologiczne zarówno w perfuzacie, jak i tkankach. Ten powtarzalny, skalowalny protokół jest adaptowalny do większych systemów EVLP u zwierząt lub ludzi, zapewniając praktyczną platformę translacyjną do badania interwencji niefarmakologicznych mających na celu poprawę wyników przeszczepów.

Wprowadzenie

Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) stanowiła znaczący postęp w dziedzinie przeszczepów płuc. Jego najważniejszy wpływ polega na rozszerzeniu puli dostępnych przeszczepów płuc dawcy poprzez umożliwienie funkcjonalnej oceny płuc marginalnych, co pozwala na wykorzystanie narządów, które w innym przypadku zostałyby odrzucone do przeszczepu 1,2. Marginalne (lub rozszerzone kryteria) płuca dawcy odnoszą się do jednego lub więcej z następujących kryteriów: wiek dawcy powyżej 55 lat, PaO2/FiO2 poniżej 300, czas niedokrwienia dłuższy niż 6 godzin, dodatnia mikrobiologia plwociny, nieprawidłowa radiografia3. Oprócz oceny fizjologicznej, EVLP może służyć jako platforma do stosowania różnych interwencji terapeutycznych mających na celu poprawę jakości przeszczepu przed przeszczepem (koncepcja terapeutycznej rekondicjonalności)4. W związku z tym EVLP daje unikalną możliwość rehabilitacji uszkodzonych (marginalnych) płuc oraz zmniejszenia ryzyka pierwotnej dysfunkcji przeszczepu (PGD), poważnego powikłania utrudniącego zarówno wczesne, jak i długoterminowe wyniki po przeszczepie płuc 5,6. PGD to kliniczne wyrażenie procesu uszkodzenia niedokrwieniowo-reperfuzyjnego (IRI), którego patofizjologia opiera się na stresie oksydacyjnym, stanie zapalnym, aktywacji kaskad dopełnienia i krzepnięcia oraz indukcji procesów śmierci komórki 7,8,9. Ostatecznie te mechanizmy przyczyniają się do zakłócania prawidłowych funkcji śródbłonka i nabłonka płuc, prowadząc do niekardiogennego obrzęku płuc o zmniejszonej zdolności natleniania, co są dwoma kluczowymi cechami PGD 6,10,11,12.

Coraz więcej badań eksperymentalnych, zarówno przedklinicznych, jak i klinicznych, wykazało skuteczność różnych strategii terapeutycznych ex vivo w łagodzeniu IRI podczas przeszczepu płuc. Przykładami są leki farmakologiczne skierowane na utleniacze i wolne rodniki, szlaki śmierci komórkowej, mediatory zapalne, a także terapie komórkowe i genowe, by wymienić tylko kilka: 13,14,15,16,17,18,19,20. Poza takimi podejściami terapeutycznymi, EVLP może również służyć jako platforma do bezpośredniego zastosowania stresu fizjologicznego na przeszczep płuca, wywołując wewnętrzne mechanizmy ochronne zapewniające adaptacyjną tolerancję na kolejne patofizjologiczne uszkodzenia. Jedna z takich strategii polega na zastosowaniu przejściowego, nieśmiertelnego stresu cieplnego do przeszczepu płuc podczas EVLP. Rzeczywiście, od dawna wiadomo, że warunki stresu cieplnego sprzyjają adaptacyjnej reakcji szoku cieplnej, wynikającej z ekspresji serii białek szoku cieplnego (HSP) działających jako molekularne chaperony i zapewniających odporność na dalszą ekspozycję na różne bodźce stresujące21. Poza indukcją HSP, zidentyfikowano także dodatkowe adaptacje komórkowe po ekspozycji na ciepło, w tym (a) szlak antyoksydacyjny i cytoprotekcyjny powiązany z NF-E2 czynnikiem 2 (NRF2), którego aktywacja podczas stresu cieplnego znacząco zwiększa poziom cytoprotekcyjnego genu hemooxygenazy22,23; (b) odpowiedź białkowa niezłożona (UPR), która zajmuje się stresem proteotoksycznym w siatkówce endoplazmatycznej (stres ER), której aktywacja przez ciepło może mieć charakter ochronny lub szkodliwy, w zależności od intensywności stresu termicznego 24,25,26; (c) autofagia, proces cytoprotekcyjny sprzyjający lizosomalnej degradacji uszkodzonych organelli i makrocząsteczek, który może być aktywowany lub hamowany przez ciepło w sposób zależny od temperatury i czasu27,28.

Wykazaliśmy, że takie "termiczne prekondycjonowanie" przynosi znaczące korzyści w zakresie zmniejszenia stresu oksydacyjnego, stanu zapalnego, śmierci komórek oraz dysfunkcji śródbłonka, co prowadzi do znaczącej ochrony przed IRI płuc. Dlatego zaproponowaliśmy, że termiczne prekondycjonowanie może stanowić nową, niefarmakologiczną metodę rehabilitacji ex vivo uszkodzonych przeszczepów płuc przed przeszczepem 29,30,31. Prekondycjonowanie termiczne może oferować kilka zalet w porównaniu z istniejącymi strategiami farmakologicznymi i niefarmakologicznymi. Wywołując zintegrowaną endogenną odpowiedź komórkową, może jednocześnie chronić przed odrębnymi szlakami patofizjologicznymi dotyczącymi IRI, podczas gdy inne strategie zazwyczaj koncentrują się na jednej ścieżce. Ponadto unika ryzyka potencjalnych skutków ubocznych związanych ze stosowaniem związków farmakologicznych. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie szczegółowego, krok po kroku protokołu termicznego prekondycjonowania podczas perfuzji płuc ex vivo uszkodzonych płuc szczurów, który może być stosowany w różnych środowiskach, zwłaszcza w większych modelach zwierzęcych lub ludzkich płucach w celach badawczych.

Do EVLP wykorzystujemy izolowany system płuc z przekręconym płucem szczurów. Układ opisany jest na Rysunku 1 i obejmuje następujące elementy: Złoże perfuzjatu (Rysunek 1-1); dwie pompy rolkowe do cyrkulacji perfuzjatu (Rysunek 1-2A) i pobierania perfuzjatu (Rysunek 1-2B); termostatyczną kąpiel wodną (Rysunek 1-3) do utrzymania temperatury perfuzacji; membranowy wymiennik gazu (Rysunek 1-4) połączony ze zbiornikiem gazu (nie pokazany) zawierający mieszaninę 6%O2, 10%CO2 i 84%N2 do odtleniania i karboksylacji perfuzacji dopływu; dwa czujniki ciśnienia (Rysunek 1-5) do monitorowania ciśnienia w lewej przedsionku (LA) i tętnicy płucnej (PA) (czujnik ciśnienia PA, nie jest widoczny na rysunku); ogrzewaną i szczelną komorę (Rysunek 1-6) mieszczącą blok serco-płucny z dedykowanymi połączeniami dla kannyl PA, LA i tchawic; respirator (Rysunek 1-7) podłączony do kaniuli tchawicowej do wentylacji płuc oraz do pomiaru ciśnienia w drogach oddechowych i statycznej podatności płuc; termometr elektroniczny (Rysunek 1-8) do wyświetlania temperatury perfuzacji na poziomie dopływu PA. Platforma łącząca (Rysunek 1-9), której elementy są szczegółowo przedstawione na Rysunku 2: Połączenie dla PA (Rysunek 2-1), LA (Rysunek 2-2) i tchawicy (Rysunek 2-3); połączenie z modułem obciążeniowym (Rysunek 2-4) do ciągłego monitorowania masy bloku serc-płuco; Czujnik temperatury (Rysunek 2-5) do monitorowania temperatury perfuzjatu przy napływie PA. Szczegółowy schemat obwodu można znaleźć w innym miejscupod numerem 18.

Protokół

UWAGA: W badaniu wykorzystano dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (n = 60; wiek 8-11 tygodni; waga 300-450 g). Zwierzęta były trzymane (2 szczury/klatka) w naszym lokalnym ośrodku dla zwierząt, utrzymywanym w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin w ciemności, z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z "Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych" (publikacja NIH nr 96-23), a wszystkie eksperymenty przeprowadzano zgodnie z protokołem eksperymentalnym zatwierdzonym przez nasz lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (autoryzacje 3456a i 3456x1). Rozmiar i wagę zwierząt zostały wybrane na podstawie naszych wcześniejszych badań w modelu EVLP szczurów oraz dla wygody anatomicznej (rozmiar płuc i naczyń). Wybrano szczep Sprague-Dawley, ponieważ inne szczepy (zwłaszcza szczury Wistar) mogą wykazywać reakcje nadwrażliwości na roztwór dekstranu obecny w roztworze perfuzjatu 1,32.

1. Ogólny opis układu EVLP

UWAGA: Układ opisany jest na Rysunku 1, a elementy platformy połączeniowej (Rysunki 1-9) są szczegółowo przedstawione na Rysunku 2. Szczegółowy schemat układu został opisany wcześniej18.

  1. Do perfuzji ex-vivo stosuj bezkomórkowy buforowany roztwór zewnątrzkomórkowy. Upewnij się, że perfuzat przepływa ze zbiornika przez wymiennik gazowy, jest kierowany przez kaniulę PA do perfuzji płuc, a następnie wychodzi przez kaniulę LA z powrotem do zbiornika. Stale monitoruj ciśnienie wlotu (PA) i odpływu (LA).
  2. Podłącz wszystkie przetworniki (ciśnienie PA, ciśnienie LA, masa płuc, prędkość pompy) do skrzyni konwerterów analogowo-cyfrowych (Rysunek 3). Otwórz podstawowe oprogramowanie do akwizycji danych (BDAS). Kalibruj sygnały ciśnienia za pomocą kalibracji dwupunktowej (0; 10 cm H2O) za pomocą kolumny wodnej. Kalibruj moduł wagowy za pomocą kalibracji dwupunktowej (0 g i 1 g). Kalibruj prędkość pompy za pomocą 1 minuty pobierania perfuzatu przy 10 mL/min. Kontroluj jakość sygnałów poprzez stosowanie znanych ciśnień i prędkości pompy oraz ocenę adekwatności wyników (szczegółowy protokół i wideo do kalibracji sygnałów można znaleźć w materiałach uzupełniających).
    UWAGA: Szczegółowy protokół kalibracji sygnałów można znaleźć w materiałach uzupełniających (Pliki Uzupełniające 1 i 2).
  3. Rejestruj wszystkie kluczowe parametry (PA, ciśnienie LA, masa płuc i przepływ) w czasie rzeczywistym przez oprogramowanie systemowe i obserwuj ich wizualny wyświetlacz na komputerze osobistym.
    UWAGA: Sygnały fizjologiczne zapisane przez BDAS są eksportowane do pliku tekstowego za pomocą polecenia eksportu pliku w pasku menu. Dane wyodrębnione w wybranych momentach (co 60 minut) są przesyłane do arkusza kalkulacyjnego, a następnie kopiowane/wklejane do oprogramowania do analizy statystycznej.
  4. Oblicz oporność naczyń płucnych (PVR) za pomocą równania (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. Pobieranie próbek (1-2 mL) perfuzjatu w wyznaczonych punktach czasowych do pomiarów różnych markerów biologicznych.

2. Zastosowanie wstępnej kondycjonowania termicznego

  1. Podłącz termostatyczną kąpiel wodną (Rysunek 4-1), aby zapewnić stałą, precyzyjną i regulowaną temperaturę wody do ogrzewania perfuzatem. Użyj zintegrowanej pompy silnikowej wewnątrz kąpieli wodnej do cyrkulacji podgrzanej wody.
  2. Użyj podwójnie ściankowego szklanego pojemnika jako zbiornika (Rysunek 4-2), aby utrzymać temperaturę perfuzacji poprzez cyrkulację podgrzanej wody między ściankami pojemnika.
  3. Użyj grzałki grzewczej z rurką serpentynową wewnątrz podgrzewanego pojemnika z wodą (Rysunek 4-3), aby wyprowadzić perfuzjat, umożliwiając wymianę ciepła z wody do perfuzacji tuż przed jego wejściem do przygotowania płuc ex-vivo.
  4. Blok serco-płucny umieść w komorze narządowej (Rysunek 4-4), podwójnym zbiorniku wypełnionym wodą krążącą z termostatycznej kąpieli wodnej, aby utrzymać ciepłe środowisko.
  5. Dla czujnika temperatury i termometru (Rysunek 2-5 i Rysunek 4-5) należy bezpiecznie i mocno przyłożyć czujnik powietrza/powierzchni typu K do kaniuli dopływu, aby w celu ciągłego monitorowania rzeczywistej temperatury perfuzatu wchodzącej do tętnicy płucnej (PA). Temperatura jest wyświetlana na cyfrowym termometrze.
  6. Aby utrzymać temperaturę dopływu na poziomie 37 °C, ustaw kąpiel wodną na 38-38,5 °C.
    UWAGA: Aby zrekompensować straty ciepła z perfuzjatu wzdłuż jego przebiegu w rurze, ustaliliśmy, że w naszych warunkach temperatura kąpieli wodnej musi być ustawiona na 38-38,5 °C, aby utrzymać 37 °C przy dopływie. W zależności od strat ciepła z perfuzatu, te ustawienia mogą wymagać dostosowania, aby zapewnić pożądaną temperaturę przy dopływie.
  7. Rozpocznij protokół ogrzewania ex-vivo po 60 minutach EVLP, podnosząc temperaturę kąpieli wodnej do 43 °C, aby osiągnąć temperaturę przepływu 41,5 °C, która jest osiągana przez 5 minut i utrzymuje się przez 30 minut.
    UWAGA: W naszej poprzedniej pracy29 ustaliliśmy optymalną temperaturę do wstępnego przygotowania termicznego (TP), używając zakresu temperatur od 40 °C do 43,5 °C oraz protokołu EVLP 3 godzin, jak pokazano na Rysunku 5. Temperatura ciepła zapewniająca optymalną ochronę bez szkodliwych skutków (jak podsumowano na Rysunku 5B) wynosiła 41,5 °C. Temperatura ta była więc wykorzystywana we wszystkich naszych kolejnych eksperymentach, z czasem trwania EVLP do 6 h, 29, 30, 31.
  8. Po tym przejściowym nagrzewaniu dodaj lód do kąpieli wodnej, aby szybko (w ciągu 5 minut) zmniejszyć temperaturę kąpieli wodnej z powrotem do 38 °C, aby temperatura perfuzacji w kaniuli przywróciła się do 37 °C i utrzymać tę temperaturę do końca protokołu EVLP.
  9. Określ zmienne fizjologiczne (podatność płuc), powstawanie obrzęków oraz molekularne punkty końcowe (ekspresja białek termicznych, enzymów przeciwutleniaczych, cytokiny zapalnych oraz biomarkerów apoptozy, autofagii, stresu retikulum endoplazmatycznego i uszkodzenia komórek śródbłonka).

3. Szczegółowy protokół EVLP dla wstępnego przygotowania termicznego

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Przygotuj wymagane materiały, w tym kanniulę i narzędzia chirurgiczne (Rysunek 6A, B oraz Tabela materiałów).
    2. Zważ zwierzę, aby obliczyć odpowiednie dawki dla wszystkich podanych substancji, przepływ perfuzacji oraz parametry wentylacji.
    3. Przygotuj mieszankę znieczulającą: 80 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny w tej samej strzykawce.
      UWAGA: Środki znieczulające muszą być przechowywane w bezpiecznej szafce.
    4. Przygotuj heparynę, 1,7 U/g masy ciała w soli izotonicznej (1 mL strzykawki).
    5. Znieczulać zwierzę, używając 5% izofluranu (odparowanego w dedykowanej komorze indukcyjnej), a następnie podaj podanie dootrzewnkowego przygotowanej mieszaniny znieczulającej. Utrzymuj znieczulenie z 1-2% izofluranem za pomocą maseczki.
      UWAGA: Ważne jest, aby utrzymywać głęboką anestezję, aby nie łapać powietrza podczas wykrwawiania.
      Użyj systemu z systemem ekstrakcji izofluranu, aby chronić operatora.
      Wszystkie igły i strzykawki należy wyrzucić do odpowiednich pojemników na odpady niebezpieczne i ostre. Szczelne, ostre i biologiczne kontenery są następnie usuwane przez wyznaczone strumienie odpadów.
    6. Ogol zwierzę od gardła do okolic prącia i usuń resztki futra za pomocą wilgotnego, ciepłego papieru.
    7. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc tylną łapę; Zwiększ stężenie izofluranu, jeśli występują odruchy.
    8. Ułóż zwierzę na plecach i zabezpiecz wszystkie cztery kończyny taśmą klejącą.
  2. Usunięcie bloku serc-płuco w celu EVLP
    UWAGA: Procedura wymaga intensywnego szkolenia, aby wykonać różne etapy w sposób terminowy, beztraumatyczny i wysoce powtarzalny. Najdelikatniejszym krokiem jest kaniulacja tętnic płucnych, którą należy wykonać pod powiększeniem za pomocą mikroskopu operacyjnego zwierciadla, aby uzyskać najlepsze rezultaty. Cały zabieg może wykonać jeden dobrze wykwalifikowany badacz. Aby osiągnąć taką niezależność eksperymentalną, wymagane jest co najmniej 15 kompletnych procedur pod nadzorem doświadczonego badacza.
    1. Delikatnie unieś skórę w środku gardła i wykonaj 5 cm podłużne nacięcie wzdłuż osi ogon-głowiczki za pomocą małych nożyczek.
    2. Oddziel płaty gruczołów ślinowych i ostrożnie rozciąń powięzi na mięśniach mostkowych za pomocą wygiętych kleszczy, aż krtań i tchawica będą wyraźnie odsłonięte.
    3. Przełóż pod tchawicę jedwabny szew 4-0 i przygotuj zawiązany węzeł, pozostawiając kleszcze pod tchawicą.
    4. Oblicz objętość pływową (Vt) dla wentylacji in vivo i pozyskiwania płuc za pomocą wzoru Stahla33:
      figure-protocol-2 ×  figure-protocol-3
    5. Ustaw respirator przeznaczony do wentylacji in vivo i pozyskiwania płuc (patrz Tabela materiałów) na obliczoną objętość pływową z prędkością oddechową 70 oddechów na minutę, udziałem tlenu (FiO2) 0,5 oraz dodatnim ciśnieniem końcowo-wydechowym (PEEP) 3 cm H2O.
      UWAGA: Aby ustawić PEEP na 3 cm H2O, podłącz ramię wydechowe respiratora do silikonowej rurki utwardzonej platyną, umieszczonej 3 cm pod powierzchnią pojemnika wypełnionego wodą.
    6. Wykonaj poprzeczne nacięcie między dwoma pierścieniami chrzęstnymi, włóż kaniulę o średnicy zewnętrznej 2 mm (długość 14 mm, kaniula wentylacyjna EVLP, rysunek 6B) do wentylacji i zabezpiecz ją przez dokręcenie szwów.
    7. Podłącz kaniulę do respiratora i potwierdzi skuteczną wentylację poprzez obecność bąbelków w pojemniku wypełnionym wodą połączonym z ramieniem wydechowym respiratora.
    8. Za pomocą tępych nożyczek naciń skórę wzdłuż brzucha i wejdź do jamy otrzewnej, kontynuuj nacięcie mięśni ściany brzusznej aż do przepony.
    9. Delikatnie odsuwaj jelita za pomocą patyczków kosmotycznych, aby odsłonić dolną żyłę żylną.
    10. Wstrzyknij przygotowany roztwór heparyny do żyły i pozwól mu krążyć przez 5 minut. Następnie przecinam żyłę główną i aortę w celu wykrwawienia.
    11. Gdy zwierzę zostanie całkowicie wykrwawione i potwierdzone jako martwe, zatrzymaj wentylację i odłącz respirator od kaniuli tchawicowej, aby umożliwić płucom osuszenie wody, co oznacza początek gorącej niedokrwienia. Utrzymuj całkowity czas ciepła niedokrwiennego (WIT) do 1 godziny.
      UWAGA: Chociaż mediana WIT w klinicznym oddawaniu płuc DCD wynosi 33 min, nie odnotowano negatywnych skutków trwania WIT do 60 min na przeżycie 1 rok. Dlatego większość ośrodków obecnie zgadza się, że 60-90 minut jest akceptowalną górną granicą WIT34. Jak szczegółowo opisano wcześniej, użycie 1h WIT w naszym modelu szczura jest zatem istotne dla scenariuszaklinicznego 35.
    12. Piętnaście minut przed końcem całkowitego czasu ciepłej niedokrwienności wynoszącej 1 godzinę (czyli po 45 minutach ciepłej niedokrwienności) napełnij strzykawkę o pojemności 60 ml (zamocowaną na uchwytie) zimnym (4 °C, przechowywane w lodówce) roztworem konserwującym (patrz skład w Tabeli 1).
      UWAGA: Spód strzykawki jest ustawiony na wysokości 20 cm nad zwierzęciem. Podłącz strzykawkę do kaniuli z PA, używając silikonowej rurki zanurzonej w lodowatej wodzie (Rysunek 6C).
    13. Wykonaj sternotomię środkowej za pomocą nożyczek Lister z tępymi końcami, aby uniknąć uszkodzenia tkanki, i ostrożnie cofnij ścianę klatki piersiowej za pomocą tępych retraktorów przymocowanych do gumek oraz mikro-komarowego hemostatu przymocowanego do przepony, aby odsłonić płuca. Unikaj bezpośredniego kontaktu z parenchymą płuc.
      UWAGA: Od tego etapu, aby zapobiec wysychaniu tkanek, należy nałożyć niewielką ilość soli fizjologicznej na powierzchnię płuca, gdy jest to konieczne.
    14. Wykonaj nacięcie w kształcie litery "X" na wierzchołku lewej komory serca i przesuń nożyczki do środka serca aż do lewego przedsionka, aby ułatwić późniejsze włożenie kaniuli LA.
    15. Przełóż szew jedwabny 5-0 pod główną oczką i przygotuj wcześniej zawiązany podwójny węzeł, trzymając szew po jednej stronie za pomocą domowej roboty (rysunek 6D i rysunek 7A).
    16. Przygotuj dodatkowy szew wokół serca do późniejszego zabezpieczenia kaniuli LA (Rysunek 7B).
    17. Zrób małe nacięcie w głównym nagłośnieniu i włóż kaniulę PA, upewniając się, że nie pojawi się pęcherzyk powietrza.
    18. Natychmiast przepłucz płuca 25 mL roztworu konserwującego zimno przez kaniulę PA, rozpoczynając czas zimnej niedokrwi.
      UWAGA: Do tej perfuzji stosuj pasywne ciśnienie z wysokości strzykawki na opisanym wyżej uchwytie.
    19. Zabezpiecz kaniulę za pomocą szwów przygotowanych.
    20. Bezpośrednio po kaniulowaniu PA ponownie podłącz kaniulę tchawicową do respiratora i wznow wentylację z początkowymi ustawieniami, zmniejszając częstość oddechu do 25 oddechów na minutę.
    21. Włóż kaniulę LA przez nacięcie w lewej komorze do lewego przedsionka.
    22. Zabezpiecz kaniulę drugim wcześniej zawiązanym szwem (wokół serca), uważając, aby nie utrudnić przepływu z lewego przedsionka i pozwolić całej objętości 25 ml roztworu konserwującego zimno przejść (zajmuje to ~15 minut).
    23. Po zakończeniu przelewu roztworu konserwacyjnego zaciskaj kaniulę PA zaciskiem buldoga (rysunek 7C, niebieskie kółko) i odłącz ją od rury.
    24. Ostrożnie rozczłonkuj tchawicę i otaczające tkanki, aby pobudzić płuca.
    25. Zacisnąć tchawicę za pomocą klipsa do tętniaka (rysunek 7C, czerwone koło), gdy płuca są całkowicie napompowane (jedna objętość pływowa).
    26. Rozcinaj aortę zstępującą i inne naczynia wspierające, aby uwolnić blokadę sercowo-płucną, podnosząc ją, delikatnie chwytając tchawicę.
    27. Umieść blok serc-płuca w naczyniu zawierającym roztwór konserwujący w pozycji na brzuchu i przechowuj w temperaturze 4 °C, aby całkowity czas zimnej niedokrwi wynosił 1 godzinę.
      UWAGA: Po zakończeniu operacji umieszczaj biologiczne szczątki w workach do utylizacji odpadów do dalszej eliminacji przez dedykowaną służbę.
  3. Perfuzja płuc i wstępne przygotowanie termiczne ex vivo
    UWAGA: Zapoznaj się z diagramem blokowym przedstawiającym główne kroki prowadzące postęp przez różne etapy protokołu (rysunek 8).
    1. Włóż wiadro z lodem do termostatycznej kąpieli wodnej, aby obniżyć temperaturę perfuzacji do 15 °C.
    2. Napełnij zbiornik 100 mL perfuzatu i pozwól mu krążyć w systemie. Użyj roztworu perfuzji na bazie albuminy ludzkiej (patrz skład w Tabeli 1) jako bezkomórkowego, buforowanego roztworu zewnątrzkomórkowego do perfuzji ex-vivo .
    3. Zmierz pH perfuzjatu i utrzymuj je na poziomie fizjologicznym (7,35-7,45), odpowiednio dodaj bufor tris(hydroksymetylo)aminometanowy (THAM).
    4. Zważ blok serco-płucny i zamontuj go na systemie EVLP, zaczynając od kaniuly wentylacyjnej, jednocześnie trzymając klips tętniaka na miejscu na tchawicy.
    5. Podłącz kaniulę PA, ostrożnie unikając wpuszczania pęcherzyków powietrza do naczyń płucnych (upewnij się, że pułapka jest wypełniona).
    6. Pozwól kilku kroplom roztworu perfuzyjnego wydostać się i połączyć kaniulę LA.
    7. Ustaw ciśnienie lewego przedsionka na 3 mm Hg, regulując wysokość linii odpływowej podłączonej do obwodu drenażowego.
    8. Zeruj moduł wagowy i monitoruj zmianę masy bloku płuc serca podczas EVLP.
    9. Oblicz teoretyczną wydajność czynności serca (CO) według wzoru opracowanego przez Lindstedta i Schaeffera:
      figure-protocol-4
    10. Rozpocznij perfuzję (2% teoretycznego CO) i stopniowo zwiększ przepływ perfuzjatu (7,5% teoretycznego CO) oraz temperaturę zgodnie z określonymi parametrami, jak opisano w Tabeli 2.
      UWAGA: Podczas EVLP przepływ perfuzjatu jest ustawiony na poziomie od 2% do 7,5% obliczonego teoretycznego CO. Ten niski przepływ perfuzacji pozwala utrzymać ciśnienie tętnicze w płucach w normie oraz zmniejsza ryzyko wczesnego obrzęku płuc, zwłaszcza w płucach z uszkodzeniem ciepła, niedokrwiennego. Pozwala to użytkownikom utrzymywać przygotowanie przez dłuższy czas. Inni badacze używali porównywalnych przepływów dla EVLP dla szczurów, podczas gdy inni używali przepływów do 20% teoretycznego CO38.
    11. Dostosowuj temperaturę perfuzacji, stopniowo podnosząc temperaturę kąpieli wodnej.
      UWAGA: Uważaj, aby nie sięgać do sprzętu grzewczego w rękach, aby uniknąć możliwych urazów.
    12. Gdy temperatura perfuzacji osiągnie 35 °C, rozpocznij wentylację mechaniczną, wyjmując klips tętniaka z tchawicy i uruchamiając respirator przeznaczony do wentylacji ex-vivo (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Kalibracja ciśnienia wykonywana jest co 14 dni za pomocą kalibracji dwupunktowej (0 i 30 cm H2O). Kalibracja rurek jest przeprowadzana przy każdym użyciu zgodnie z zaprogramowanym protokołem, aby skorygować czynniki zewnętrzne związane z oporem rur i kaniuli.
      1. Do ustawień respiratora i pozyskiwania danych korzystaj z wymienionego oprogramowania, ponieważ zapewnia ono ciągłe rejestrowanie sygnałów oddechowych i zgodności płuc w wyznaczonych punktach czasowych (patrz diagram przepływowy, rysunek 8), zgodnie z zaprogramowanym protokołem stopniowego zwiększania objętości płuc z równoczesnym pomiarem ciśnienia w drogach oddechowych.
      2. Zgodność jest następnie automatycznie obliczana za pomocą równania dopasowanego do odgałęzienia pętli objętości ciśnienia (równanie Salazar-Knowles).
      3. Wyświetl wszystkie dane wentylacyjne, przechowuj je na dedykowanym komputerze osobistym i eksportuj do arkusza kalkulacyjnego. Wyodrębnij dane w wybranych momentach, przenieś je do innego arkusza kalkulacyjnego, a następnie skopiuj i wklej do oprogramowania do analizy statystycznej.
    13. Ustaw tempo oddechu i objętość pływu odpowiednio na 7 uderzeń/min i 3 mL/kg przez 10 minut, następnie zwiększ do 15 uderzeń/min i 6 mL/kg przez 10 minut, a na końcu 30 uderzeń/min i 6 mL/kg aż do końca EVLP. Ustaw dodatnie ciśnienie końcowe wydechowe (PEEP) na 3 cm H2O przez cały czas EVLP (Tabela 2).
    14. Stosuj manewr rekrutacyjny co 30 minut EVLP, aby zapobiec niedostateczności, ustawiając ciśnienie w drogach oddechowych na 15 cm H2Oprzez 6 sekund.
    15. W godzinach 1, 2 godziny, 3 godziny, 4,5 godziny i 6 godzin EVLP należy stopniowo zastosować napompowanie płuc do całkowitej objętości płuc 10 mL/kg masy ciała, aby określić podatność płuc i szczytowe ciśnienie wdechowe (Pmax).
      UWAGA: Pomiary zgodności przeprowadzane są po opisanym powyżej manewrze rekrutacyjnym.
    16. Zwiększ temperaturę perfuzjatu do 37 °C przy kaniuli PA wlotowej po 60 minutach EVLP.
    17. Rozpocznij protokół ogrzewania ex-vivo po 60 minutach EVLP.
    18. Zwiększ temperaturę kąpieli wodnej do 43 °C, aby osiągnąć 41,5 °C przy kaniuli PA (zajmuje to ~ 5 minut), jak pokazano na Rysunku 2, Rysunku 3 oraz Rysunku 4-5.
    19. Utrzymuj tę temperaturę od 60 do 90 minut EVLP (łącznie 30 minut).
      UWAGA: W naszych wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że 41,5 °C przez 30 minut nie sprzyja uszkodzeniom termicznym na poziomie całego płuca29. Nie przeprowadziliśmy specyficznych badań żywotności komórek in vitro w celu testowania uszkodzeń termicznych w takich warunkach.
    20. Po 30 minutach podgrzewania dodaj lód do kąpieli wodnej, aby szybko (5 minut) ustawić temperaturę na kaniuli dopływowej do 37 °C.
      UWAGA: W grupie kontrolnej temperatura perfuzatu utrzymuje się na poziomie 37 °C przez cały czas trwania EVLP, bez zastosowania termicznego prekondycjonowania (patrz Tabela 2). Nie uwzględniamy grupy "fikcyjnych ogrzewania" (np. regulacja ciepła przez kąpiel wodną bez wzrostu temperatury).
    21. Utrzymuj temperaturę perfuzacji na poziomie 37 °C przy kaniuli napływającej do końca EVLP.
    22. Pobieraj próbki roztworu perfuzjatu w godzinach 1, 2 godzin, 3 godziny, 4,5 godziny (1-2 mL w każdym punkcie czasowym) oraz 6 h (10 mL) EVLP z jednego z portów pobierania próbek podłączonych do obwodu (przed lub poniżej przygotowania płuca), jak pokazano na Rysunku 1-2B. Próbki należy natychmiast wykorzystać do analiz gazów (pomiar pH, PCO2 i PO2, za pomocą wkładu CG4+). Do dalszych pomiarów biochemicznych odwidź próbki (500 × g, 10 minut w 4 °C) i utrzymuj przezroczysty supernatant w temperaturze -80 °C aż do użycia.
    23. Po 6 godzinach EVLP ponownie przyłóż klips tętniaka do tchawicy (gdy płuco będzie w pełni napompowane) i zaciskaj kaniulę PA zaciskiem buldogowym.
    24. Zważ blok serco-płucny, aby uzyskać ostateczną wagę.
      UWAGA: wzrost masy ciała podczas EVLP można ocenić jako różnicę między ciężarem końcowym a początkowym lub być monitorowany nieprzerwanie podczas EVLP za pomocą opisanego powyżej modułu wagowego.
    25. Ostrożnie rozczłonkowaj płuca, rozdzielając poszczególne płaty.
    26. Zachowaj tkankę do dalszych zastosowań: natychmiast zamroz w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do analiz biochemicznych lub utrwal w paraformaldehydzie (PFA) do oceny histologicznej. Lewe płuco może być przechowywane i przygotowane do przeszczepu płuc.

4. Statystyki

  1. Przydziel zwierzęta do określonych grup leczenia (kontrola kontra termiczna prekondycjonowanie, n = 5/grupa dla każdego eksperymentalnego punktu końcowego).
    UWAGA: Nie przydzielamy zwierząt losowo do jednej lub drugiej grupy, lecz grupy są zmieniane każdego dnia. Protokół (ciepło kontra sterowanie) nie może być wykonywany w sposób zaślepiony, ze względu na konieczność ścisłego poznania temperatury perfuzatu podczas eksperymentów. Natomiast analizy biologiczne i histologiczne przeprowadzane są w sposób zaślepiony, bez identyfikacji przydzielonej grupy leczonej.
  2. Analizuj dane.
  3. Wyniki ekspresowe jako środki ± SEM.
  4. Zweryfikować rozkład normalny danych za pomocą testu Kolmogorowa-Smirnova.
  5. W eksperymentach z punktami czasowymi oceniaj efekty alokacji czasu i grup za pomocą dwukierunkowej metody ANOVA, następnie testu post-hoc Sidaka dla efektów grupowych oraz korekty Bonferroniego dla efektów czasowych, używając 1 godziny jako odniesienia. Za statystycznie istotną uznaj wartość p < 0,05. Rozważ transformację logarytmiczną danych w przypadku rozkładu nienormalnego przed zastosowaniem ANOVA.
  6. W analizach histologicznych określ (w sposób zaślepiony) ocenę urazu płuc każdej próbki, poprzez ilościowe określenie obrzęku okołonaczyniowego w 10 polach na przekroj.
    1. Użyj względnej liczby naczyń z obrzękiem okołonaczyniowym (A): 0: nieobecny; 1: łagodna (<25%); 2: umiarkowana (25-50%); 3: ciężki (>50%).
    2. Użyj grubości obrzęku okołonaczyniowego (B), obliczanej jako procent średnic naczyń wewnętrznych (0: brak obrzęku; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. Użyj sumy A + B z 10 badanych sekcji, aby obliczyć wynik31.
    4. Przeprowadz porównania statystyczne za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya (ze względu na nienormalny rozkład danych), z przypisaniem istotności p < 0,05.

Wyniki

Zmienne fizjologiczne płuc są nieustannie monitorowane przez cały zabieg, w tym ciśnienie w tętnicy płucnej (PAP), obliczony opór naczyniowy płuc oraz parametry wentylacyjne, w tym statyczna podatność płuc (SPC) i szczytowe ciśnienie w drogach oddechowych (Pmax). Dodatkowo, moduł obciążeniowy umożliwia ocenę powstawania obrzęku poprzez pośredni pomiar nagromadzenia płynów w płucach. Korzyści z termicznego prekondycjonowania (TP) w zakresie kontroli płuc (Ctrl) obejmują poprawę SPC (rysunek 9A, wyrażony jako stosunek SPC w każdym punkcie do początkowej wartości SPC, n = 5/grupa) oraz zmniejszenie przyrostu masy płuc (Rysunek 9B, n = 5/grupa) podczas EVLP. Dane są prezentowane jako środki ± SEM.

Płyn perfuzacyjny można badać pod kątem różnych biomarkerów. Na przykład termiczne prekondycjonowanie wiąże się ze znacząco zmniejszonym uwalnianiem von Willebranda (vWF), biomarkera komórek śródbłonka na końcu EVLP (Rysunek 9C, n = 5/grupa, oznacza ± SEM).

Analizy morfologiczne tkanki płucnej uzyskane na końcu EVLP obejmują histologię i immunohistochemię. Przykłady przekrojów barwionych hematoksyliną i eozyną (H & E) przedstawiono na Rysunku 9D, pokazując zmniejszone uszkodzenia histologiczne w płucach poddanych termicznemu prekondycjonowania, wyrażone jako wynik urazu płuc (Rysunek 9E, n = 5/grupa). Wynik został ustalony poprzez ilościowe określenie obrzęku okołonaczyniowego w 10 polach na przekroj (patrz kroki protokołu 4.6.1 i 4.6.2). Suma A + B w 10 badanych sekcjach została wykorzystana do obliczenia wyniku31.

Analizy molekularne tkanki płucnej po zakończeniu EVLP obejmują profilowanie ekspresji RNA lub białek. Na przykład poziomy ekspresji białek indukowalnego białka szoku cieplnego HSP70 można zmierzyć za pomocą ELISA, aby pokazać rozwój reakcji na szok cieplny w płucach poddanych prekondycjonowaniu termicznemu (rysunek 9F, pokazujący eksperyment czasowo-przebiegowy z różnymi czasami trwania EVLP, n = 5/grupa w każdym punkcie czasowym). Ekspresja HSP70 w grupie TP osiągnęła szczyt po 3h EVLP, czyli 90 minut po zakończeniu TP, i pozostawała stabilna aż do końca EVLP. Dane są prezentowane jako środki ± SEM.

figure-results-1
Rysunek 1: Opis platformy EVLP. (1) Podwójnie ściankowy zbiornik na perfuzjat. (2A) Pompa rolkowa do cyrkulacji perfuzacji. (2B) Pompa rolkowa do pobierania próbek perfuzatu (pomiary biochemiczne i analizy gazów). (3) Termostatyczna kąpiel wodna. (4) Wymiennik gazu membranowy połączony ze zbiornikiem gazu (nie pokazano). (5) Czujnik ciśnienia w lewej części przedsionkowej. (6) Podgrzewana i szczelna komora. (7) Respirator EVLP. (8) Sonda temperatury i termometr. (9) Platforma łącząca blok serce-płuco, której elementy opisano na Rysunku 2. (Uwaga: czujnik ciśnienia w systemie PA nie jest widoczny). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Platforma łącząca blok serce-płuca. (1) Dopływ kaniulki do tętnicy płucnej. (2) Kanyula wypływowa z lewego przedsionka. (3) Połączenie z kaniulą tchawicową. (4) Moduł obciążeniowy. (5) Sonda temperaturowa zaprojektowana przez firmę, mocno przymocowana do kaniuli dopływającej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Przetworniki/wzmacniacze sygnału oraz analogowo-cyfrowa skrzynka konwerterowa. (A). Wzmacniacz/wzmacniacz ciśnienia tętnicy płucnej. (B). Regulator przepływu prędkości pompy. (C). Lewy przetwornik/wzmacniacz ciśnienia przedsionkowego. (D). Moduł maściowy płuc. (E). Przetwornik analogowo-cyfrowy. (F). Komputer osobisty do wyświetlania i nagrywania danych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Utrzymywanie temperatury perfuzacji podczas EVLP. (1) Kąpiel wodna termostatyczna. (2) Zbiornik perfuzatu z podwójnie ściankowym szklanym pojemnikiem, w którym krąży woda z termostatycznej kąpieli wodnej. (3) Rurka grzewcza wewnątrz podgrzewanego pojemnika na wodę podłączonego do termostatycznej kąpieli wodnej. (4) Komora organowa z podwójnie ściankowym szklanym pojemnikiem umożliwiającym cyrkulację ciepłej wody z łaźni. (5) Elektroniczny termometr i wbudowany czujnik temperatury mocno przymocowany do kaniuli dopływu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Identyfikacja optymalnej temperatury do wstępnego przygotowania termicznego. (A) Protokół EVLP do oceny różnych temperatur ogrzewania. Z 60 do 90 minut EVLP temperatura perfuzacji została zwiększona do wskazanych temperatur. Po 90 minutach EVLP temperatura została przywrócona do 37 °C przez 90 minut aż do końca EVLP, podczas którego wykonano różne pomiary fizjologiczne i molekularne. (B) Podsumowanie wyników wpływu różnych temperatur ogrzewania na parametry fizjologiczne i molekularne (zielony oznacza korzystne efekty; czerwony oznacza niekorzystne skutki; a pomarańczowy to efekty mieszane). Największą ochronę zapewniała temperatura ciepła wynosząca 41,5 °C. Skróty: EVLP = perfuzja płuc ex-vivo ; TP = wstępne termiczne przygotowanie do kondycjonowania. Ta wartość została zmodyfikowana na podstawie Ojanguren i in.21. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Materiały chirurgiczne. (A) Narzędzia do usuwania blokady serc-płuca: uchwyt na klips na tętniaka i mikroklips tętniaka (system Yasargil), zacisk bulldog, nożyczki, mikronożyce, retraktory przymocowane do gumek. (B) Kanniula EVLP dla tętnicy płucnej (PA), lewego przedsionka (LA) oraz tchawicy. (C) Domowej roboty systemy perfuzji do zimnego przepłukiwania płuc perfuzją. Odległość między poziomem PA w zwierzęciu a dnem strzykawki wynosi 20 cm. (C) Domowego uchwycenia. (Nie pokazano: mikroskop chirurgiczny, respirator i zestaw znieczulający). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Reprezentatywne zdjęcia przygotowania chirurgicznego (A) Węzeł wcześniej związany wokół tętnicy płucnej. (B) Węzeł zawiązany wcześniej wokół czubka serca. (C) Zacisk bulldog (niebieskie koło) na kaniuli PA oraz klips tętniaka (czerwony kółko) na tchawicy. Skrót: PA = tętnica płucna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-8
Rysunek 8: Schemat blokowy. Główne kroki prowadzące postęp przez różne etapy protokołu. Okres między 1 a 1,5 godzinami EVLP jest powiększany, aby wskazać protokół leczenia zgodnie z przydziałem grupy (kontrola kontra wstępne przygotowanie termiczne). Skróty: CI = zimno-niedokrwienie; EVLP = perfuzja płuc ex-vivo ; PA = tętnica płucna; SPC = statyczna podatność płuc; TP = wstępne przygotowanie termiczne; WI = gorąca niedokrwienność. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-9
Rysunek 9: Reprezentatywne wyniki efektów termicznego prekondycjonowania w uszkodzonych płucach szczurów. Płuca uszkodzone przez 1 godzinę ciepłej niedokrwienia były perfuzowane w systemie EVLP przez 6 godzin. Od 60 do 90 minut EVLP grupa płuc była poddawana wstępnej kondycjonowaniu termicznemu w temperaturze 41,5 °C (grupa TP). Grupa kontrolna płuc była utrzymywana w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania EVLP. (A) Statyczna zgodność płuc (SPC), wyrażona jako stosunek wartości początkowej w kontrolnych (Ctrl, n = 5) i TP płuc (n = 5). SPC było lepiej zachowane w płucach TP. (B) Przyrost masy płuc podczas EVLP w kontrolach (n = 5) oraz TP płuc (n = 5). W grupie TP nastąpiło znaczące zmniejszenie powstawania obrzęków. (C) Uwalnianie biomarkera komórek śródbłonkowych von Willebranda w perfuzjacie było tłumione w grupie TP (n = 5) w porównaniu z grupą kontrolną (n = 5). (D) Makroskopowy i mikroskopowy wygląd płuc (barwienie hematoksylinowo-eozynowe) na końcu EVLP u płuc kontrolnych (n = 5) i TP (n = 5). (E) Wynik urazu płuc (dla ilościowego określenia uszkodzeń histologicznych) był niższy w grupie TP (n = 5) w porównaniu do grupy kontrolnej (n = 5). (F) Poziomy białka indukowalnego białka szoku cieplnego HSP70 w ekstraktach tkanek płucnych mierzone po 1, 2, 3, 4,5 i 6 godzinach EVLP w grupach kontrolnych i TP (n = 5/grupa w każdym punkcie czasowym), wykazujące wyraźną odpowiedź na szok cieplny w grupie TP. Ekspresja HSP70 w grupie TP osiągnęła szczyt po 3 godzinach EVLP (90 minut po zakończeniu TP) i pozostawała stabilna aż do końca EVLP.
Wszystkie wykresy pokazują średnie ± SEM. W eksperymentach z przebiegiem czasu (A-C, F) przeprowadzono porównania statystyczne za pomocą dwukierunkowej ANOVA, następnie test Sidaka dla efektu grupowego oraz korekty Bonferroniego dla efektu czasu (z czasem 1 h jako odniesieniem). Dla wyniku urazu płuc (E) porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Mann-Whitney. * p < 0,05 (różnice między grupami), † p < 0,05 vs 1 h EVLP. Skróty: Ctrl = control; EVLP = perfuzja płuc ex-vivo ; HSP70 = białko szoku cieplnego 70; SPC = statyczna podatność płuc; TP = wstępne termiczne przygotowanie do kondycjonowania. Zmodyfikowane na podstawie Parapanova i in.23. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Skład rozwiązań stosowanych w protokole. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Ustawienia EVLP dla przepływu perfuzji, temperatury przepływu (na poziomie kaniuli tętnicy płucnej) oraz wentylacji w czasie. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Rozwiązywanie problemów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Protokół szczegółowo opisujący główne kroki kalibracji sygnału w systemie perfuzji płuc ex vivo, w tym kalibrację ciśnienia, masy i sygnałów przepływu w tętnicy płucnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Demonstracja procedury kalibracji sygnału dla ciśnienia, masy i przepływu tętnic płucnych podczas perfuzji płuc ex vivo. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opracowanie powtarzalnego i fizjologicznie istotnego modelu EVLP dla szczurów stanowi istotny krok naprzód w badaniach nad transplantacją płuc. Pomimo istotnych różnic gatunkowych między płucami szczura a człowieka (niedawno omówionych w1), zwłaszcza większej podatności płuc szczura, model EVLP szczurów oferuje interwencje farmakologiczne i niefarmakologiczne o wysokiej powtarzalności i niskich kosztach. EVLP oferuje unikalną platformę do oceny funkcji płuc dawcy, symulowania scenariuszy klinicznych urazów, takich jak uraz niedokrwieniowo-reperfuzji, oraz wdrażania interwencji terapeutycznych przed przeszczepem 2,39,40. W tym kontekście model EVLP szczurów umożliwia wysokoprzepustowe badania mechanistyczne w ściśle kontrolowanych warunkach33. W ostatnich latach kilka grup przyczyniło się do udoskonalenia technik EVLP u szczurów. Nelson i in. udzielili podstawowych wskazówek proceduralnych39. Wang i in. zaproponowali modułowy zestaw EVLP dostosowany do symulacji dawczości po śmierci krążenia (DCD)41. Gouchoe i in. badali nowe formuły perfuzatu z wykorzystaniem sztucznych nośników tlenu42, a Oliveira i in. skupili się na stanie zapalnym po długim zachowaniu niedokrwienia zimna38. Bazując na tej wiedzy, nasz obecny protokół wprowadza nową, niefarmakologiczną strategię, mianowicie termiczne prekondycjonowanie, mającą na celu aktywację endogennych mechanizmów ochronnych dla regeneracji przeszczepów płuc szczurów uszkodzonych przez ciepłą niedokrwistość. Nasz uszkodzony model płuc, symulujący schorzenia DCD, został wykonany na samcach szczurów Sprague-Dawley33.

Ustanowienie tego protokołu wymagało szczególnej uwagi wobec kilku technicznie wymagających kroków, które mają istotny wpływ na żywotność i powtarzalność płuc. Pobranie płuc musi być wykonywane z minimalną manipulacją, aby uniknąć urazu mięczacza. Głębokość znieczulenia jest kluczowa, aby zapobiec zatkaniu płuc wywołanemu przez dyszenie oraz słabemu wykrwawianiu. Konieczne jest rygorystyczne unikanie pęcherzyków powietrza podczas kaniulacji i przygotowywania obwodów, ponieważ nawet małe zatorowce mogą wywołać obrzęk43. Szczegółowe porady dotyczące rozwiązywania problemów z typowymi protokołami są przedstawione w Tabeli 3. Chociaż warunki wentylacji i perfuzji można regulować w bezpiecznych granicach, należy utrzymywać strategie ochrony płuc, aby zapobiec barotraumie lub volutraumie44. Przepływ perfuzjatu może być zwiększony do 20% szacowanej ilości pracy serca u szczurów, w porównaniu do 40% w większych modelach, takich jak świnie i ludzie, ale musi być starannie dozowanydo 45 stopni. W naszym protokole stosujemy niższy przepływ perfuzacji (7,5% teoretycznego przepływu tętnicowego), aby zapobiec wzrostom ciśnienia w tętnicy płucnej oraz rozwojowi wczesnego obrzęku płuc w ciepłych, niedokrwiennie uszkodzonych płucach, co pozwala na długotrwałe przygotowanie. Chociaż niektóre laboratoria podają kortykosteroidy podczas perfuzji w celu zmniejszenia stanu zapalnego46,47, ich znane działanie przeciwzapalne może zakłócić niektóre wyniki eksperymentalne, dlatego nie stosujemy ich w naszym modelu, aby zachować możliwość badania urazów płuc i procesów zapalnych.

Wstępne przygotowanie termiczne wymaga precyzyjnej kontroli temperatury. Ponieważ ciepło jest tracone wzdłuż rurki od zbiornika do płuc, temperatura perfuzatu musi być monitorowana przy kaniuli dopływu, a ustawienie kąpieli wodnej utrzymywane nieco powyżej pożądanej temperatury dopływu, aby osiągnąć cel w przygotowaniu. Czujniki są kalibrowane corocznie za pomocą wielokanałowego termometru cyfrowego PCE-T 1200, aby zapewnić dokładność.

Nasze wyniki dotyczą również kluczowych ograniczeń konwencjonalnej terapii cieplnej. Systemowe stosowanie ciepła jest ograniczone przez niedokładną regulację temperatury, ogólnoustrojowe skutki uboczne oraz brak specyficzności narządowej. EVLP omija te bariery, zapewniając kontrolowane, lokalne środowisko, umożliwiające precyzyjne dostarczanie stresu termicznego bezpośrednio do tkanki płucnej29. Metoda ta umożliwia rygorystyczną modulację zarówno wielkości, jak i czasu trwania naprężenia termicznego, dwóch kluczowych parametrów dla optymalizacji ochronnej odpowiedzi komórkowej bez wywoływania urazów termicznych. Ponadto nasza platforma EVLP umożliwia wiele analiz w dalszej fazie, w tym analizy molekularne, histologiczne i funkcjonalne. Co ważne, płuca poddane EVLP mogą być również przeszczepiane, co pozwala na bezpośrednią ocenę funkcji przeszczepu po EVLP in vivo29. Model ten wspiera ocenę zarówno na poziomie izolowanych narządów, jak i po przeszczepie. W tym kontekście integracja termicznego prekondycjonowania, czyli przejściowej ekspozycji na 41,5 °C podczas EVLP, okazuje się obiecującą interwencją. Poprzez stymulację reakcji na szok cieplny i innych szlaków adaptacyjnych do stresu, metoda ta zwiększa odporność przeszczepu bez farmakologicznych zakłóceń. Nasze wyniki pokazują, że termiczne prekondycjonowanie poprawia fizjologię przeszczepu płuc, zmniejsza powstawanie obrzęków oraz uwalnianie mediatorów zapalnych i biomarkerów uszkodzeń komórkowych (czego przykładem jest obniżony poziom czynnika von Willebrand w perfuzacji EVLP płuc objętych obróbką cieplną). Analizy morfologiczne dodatkowo potwierdzają działanie ochronne tej interwencji, z redukcją uszkodzeń strukturalnych i zachowaniem integralności tkanek. Większość eksperymentalnych danych EVLP szczurów została wygenerowana u samców, co ogranicza wgląd w specyficzne dla płci; Dwa badania wykazały rozbieżne wyniki u kobiet – zmniejszony uraz reperfuzji u jednego oraz zwiększony stan zapalny u drugiego48,49. Chociaż nasze badanie wykorzystywało samców, wcześniej obserwowaliśmy korzyści TP w modelu EVLP dla świń z udziałem kobietw wieku 29 lat, co sugeruje istotność między płciami.

Należy podkreślić ważne ograniczenia i wady naszej metody. Po pierwsze, aby zapewnić przepustkę płuc z faktycznie pożądaną temperaturą, należy ją monitorować przy kaniuli dopływowej poprzez mocne zastosowanie czujnika temperatury. Po drugie, konieczne jest, aby zmiany temperatury były osiągane w bardzo krótkim czasie, co wymaga zastosowania szybkorefleksyjnej kąpieli wodnej do ogrzewania oraz dodania lodu do kąpieli wodnej dla szybkiego chłodzenia. Po trzecie, fizjologiczna odpowiedź na stres cieplny może się różnić w zależności od użytego gatunku i jest silnie zależna od poziomu oraz czasu trwania stresu. Dlatego obowiązkowe jest przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych z użyciem różnych temperatur ciepła przez różne okresy czasu, jeśli protokół ten zostanie stosowany do różnych gatunków zwierząt lub ludzkich płuc, oraz ocena konkretnych punktów końcowych dotyczących zarówno ochrony, jak i potencjalnych negatywnych skutków przyłożonego stresu cieplnego. Po czwarte, dzięki kinetycznej ekspresji genów reagujących na ciepło, efekty termicznego prekondycjonowania zależą od czasu regeneracji po zastosowaniu stresu cieplnego. Do oceny takich efektów zależnych od czasu działania ciepła, co pokazano w naszej niedawnej publikacji na ten temat30, konieczne są eksperymenty z różnymi czasami trwania stresu po upale (czyli z różnymi czasami trwania EVLP).

Ogólnie rzecz biorąc, nasze obecne badanie ustanawia szczegółowy, powtarzalny protokół EVLP dla szczurów, który wykorzystuje termiczne prekondycjonowanie jako realną strategię poprawy jakości płuc dawcy marginalnego. Protokół jest skalowalny i adaptowalny do większych systemów EVLP dla zwierząt lub ludzi, co wzmacnia jego znaczenie translacyjne. Dzięki zapewnieniu zarówno rzetelności metodologicznej, jak i fizjologicznej wierności, model ten otwiera nowe możliwości badania niefarmakologicznych interwencji mających na celu zmniejszenie urazów niedokrwieniowo-reperfuzyjne oraz poprawę wyników przeszczepów płuc po przeszczepie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Wspierane przez grant od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (nr 310030_212252) dla TK i LL).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyposażenie ogólne
Klip do tętniaka B. BraunFE762K
Czujnik termiczny z kulką powietrzną/powierzchniowąTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Tępe retraktoryNarzędzia Nauki Ścisłej18200-09
Bulldog SerafinesNarzędzie Nauki Ścisłej18051-50
Kompresje spojrzenie Promedyczny25404
Zestaw łączący do znieczuleniaHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3076
Patyki watoweZłożone SA6001109
Nożyczki do rozcinaniaB. Braun BC165R
Maseczka na twarz dla szczuraTem SegaPFM0006
Heparyna 5000 U/mLB. Braun3522430
Komora indukcyjna do znieczuleniaHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard50-0116
Irysowe kleszcze do rozcinania w pełni zakrzywioneAesculap  OC022R
IsofluranProvet AG2222
Para izofluranu 19.3Rothacher MedicalCV30-310 O2/Air
Wkład iSTAT4Laboratorium Axon AG03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr E. Graeub AGQN01AX03
Nożyczki Lister B. BraunBC876R
Mikronożyczki, zakrzywione tępe/tępeAesculap FM011R
Kleszcze Micro-AdsonNarzędzie Nauki Ścisłej11018-12
Mikro-komary-hemostatyNarzędzie Nauki Ścisłej13011-12
Mikroskop OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 % B. Braun534534
Igła 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Igła 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (roztwór konserwujący)Xvivo perfusion AB19811
Strzykawka perfuzyjna 60 ml luer lockBD plastik300865
RasorAesculap GT-421
SkalaMettler toledoPB602-L
Szew jedwabny 4-0B. BraunF1134035
Szyw jedwabny 5-0B. BraunF1134027
Steen (roztwór perfuzji)Xvivo perfusion AB19004
Rękawice chirurgiczneAnsell93-843
Strzykawka 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
TaśmaLeukofix02136-00
TermometrTES Electrical Electronic Corp1303
Rurki zawierające formol Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Respirator (EVLP) (Ustaw objętość pływową zgodnie z protokołem EVLP)FlexiventFX3
Respirator (pozyskiwanie płuc)   (Ustaw objętość pływów jako: 7,69*(masa ciała (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard683
Retraktor WEITLANERB. BraunBV073R
Ksylasol (1 mg/mL)Dr E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil applierB. BraunFE502T
IPL-2 system EVLP
Adapter do dodatniego ciśnieniaHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3635
AME 14- SC0062 rurka pompy (tygon) z kołnierzem 3-stopowym, pakiet 12Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0126
AME 24- SC0072 rura pompowa (tygon) z kołnierzem 3-stopowym, pakiet 12Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0155
Podstawowa jednostka dla izolowanego przekroczonego płuca rozmiaru 2 (IPL-2) typ 829/2Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-2266
Zestaw do połączenia tlenowodowego D150Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3765
Moduł Równowagi Obrzęku EBM (EBM) z czujnikiemHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-4626
Fibrowodownik typu D150, pakiet 5 sztukHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3762
Uchwyt do zaciskania kaniuli aorty lub tchawicy dla stołów operacyjnych rozmiar 5Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3855
Uchwyt na oxygenatoryHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3061
System pomiaru masy HSEHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-4604
Podstawowe oprogramowanie HSE-BDAS do akwizycji danych dla Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-1712
Sprzęt do akwizycji danych HSE-USB, samodzielne urządzenie USB dla Windows 10 lub 11Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3330
ISM 827/230 V pompa rolkowa reglo analogowa, 4 kanały, 0,003-35 ml/min (2 razy)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0114
Lewa kniula przedsionkowa (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0712
Mini elektroda tlenowa przepływowa z mocowaniem 1/16" (opcjonalnie)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-4189
Zestaw montażowy do tlenowodowego tlenu typu D150 na uchwytachHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3759
Jednokierunkowy zaworek zaworowy typu 9500 (jeden dla PA, jeden dla LA)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0097
Moduł ciśnienia parcjalnego tlenu OPPM typu 697  (Opcjonalnie)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0210
Podstawowy typ obudowy systemu Plugsys 603Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0045
pO2 zero roztworu 20 opakowań po 20 ml  (Opcjonalnie)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3812
Przetwornik ciśnienia P75 typ 379/HSE, zakres od -75 do +75 mm Hg (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0020
Kanyula tętnicy płucnej (średnica średnicy 2,0 mm, średnica głowy 2,5 mm)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0711
Zbiornik (otoczony) do roztworu buforowegoHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3496
SCP plugsys serwokontroler dla perfuzji typu 704Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-2806
Obudowa osłonowa dla jednego czujnika pO2 lub pCO2 mini sensor  (Opcjonalnie)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-4196
Mała płytka montażowa dla pojedynczego czujnika O2 lub CO2 sensora  (Opcjonalnie)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3000
Moduł wzmacniacza przetwornika TAM-A plugsys typu 705/1 (jeden dla PA, jeden dla LA)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0065
Termostatyczny cyrkulator E 103 (3 L)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0125
Trójdrożny zaworek typu 9560 R (jeden dla PA, jeden dla LA)Hugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-0096
Zestaw rur do podniesionego zbiornika buforowego z zaworami odcinającymi linię płynuHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3456
Kanyula wentylna (tchawica) średnica średnicy 2,0 mm, długość 14 mmHugo Sachs Elektronik - aparat Harvard73-3384
Oprogramowanie komputerowe
Podstawowe oprogramowanie HSE-BDAS do akwizycji danych dla Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik - aparat HarvardV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareScireq8
GraphPad PrismGraphPad Software Inc.10.0.1
Szczury Sprague-Dawley Charles River Laboratories (Saint-Germain-Nuelles, Francja)  

Bibliografia

  1. Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: A review of translational interspecies models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (6), L932-L940 (2020).
  2. Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. J Thorac Dis. 13 (11), 6602-6617 (2021).
  3. Kukreja, J., Chen, J., Brzezinski, M. Redefining marginality: Donor lung criteria. Curr Opin Organ Transplant. 25 (3), 280-284 (2020).
  4. Lyengar, A., Schiazza, A., Cantu, E. 3rd Ex-vivo lung perfusion therapies: Do they add value to organ donation. Curr Opin Organ Transplant. 27 (3), 204-210 (2022).
  5. Porteous, M. K., Diamond, J. M., Christie, J. D. Primary graft dysfunction: Lessons learned about the first 72 h after lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (5), 506-514 (2015).
  6. Shah, R. J., Diamond, J. M. Primary graft dysfunction (pgd) following lung transplantation. Semin Respir Crit Care Med. 39 (2), 148-154 (2018).
  7. Shepherd, H. M., et al. Innate immunity in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (7), 562-568 (2021).
  8. Talaie, T., et al. Ischemia-reperfusion injury in the transplanted lung: A literature review. Transplant Direct. 7 (2), e652(2021).
  9. Capuzzimati, M., Hough, O., Liu, M. Cell death and ischemia-reperfusion injury in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 41 (8), 1003-1013 (2022).
  10. Cantu, E., et al. Gene set enrichment analysis identifies key innate immune pathways in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Transplant. 13 (7), 1898-1904 (2013).
  11. Geraci, T. C., Chan, J. C. Y., Niroomand, A., Chang, S. H. Post lung transplant primary graft dysfunction. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 37 (2), 192-198.e1 (2025).
  12. Ta, H. Q., Kuppusamy, M., Sonkusare, S. K., Roeser, M. E., Laubach, V. E. The endothelium: Gatekeeper to lung ischemia-reperfusion injury. Respir Res. 25 (1), 172(2024).
  13. Machuca, T. N., et al. Safety and efficacy of ex vivo donor lung adenoviral il-10 gene therapy in a large animal lung transplant survival model. Hum Gene Ther. 28 (9), 757-765 (2017).
  14. Nykanen, A. I., et al. Engineered mesenchymal stromal cell therapy during human lung ex vivo lung perfusion is compromised by acidic lung microenvironment. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 184-197 (2021).
  15. Yeung, J. C., et al. Ex vivo delivery of recombinant il-10 to human donor lungs. JHLT Open. 7, 100192(2025).
  16. Francioli, C., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate administered during ex-vivo lung perfusion promotes rehabilitation of injured donor rat lungs obtained after prolonged warm ischemia. PLoS One. 12 (3), e0173916(2017).
  17. Wang, X., et al. Treatment with 3-aminobenzamide during ex vivo lung perfusion of damaged rat lungs reduces graft injury and dysfunction after transplantation. Am J Transplant. 20 (4), 967-976 (2020).
  18. Wang, X., et al. Pharmacological reconditioning of marginal donor rat lungs using inhibitors of peroxynitrite and poly (adp-ribose) polymerase during ex vivo lung perfusion. Transplantation. 100 (7), 1465-1473 (2016).
  19. Stone, M. L., et al. Ex vivo perfusion with adenosine a2a receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death. Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).
  20. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).
  21. Singh, M. K., et al. Heat shock response and heat shock proteins: Current understanding and future opportunities in human diseases. Int J Mol Sci. 25 (8), (2024).
  22. Ahmed, K., Zaidi, S. F., Mati Ur, R., Rehman, R., Kondo, T. Hyperthermia and protein homeostasis: Cytoprotection and cell death. J Therm Biol. 91, 102615(2020).
  23. Inouye, S., et al. Nrf2 and hsf1 coordinately regulate heme oxygenase-1 expression. Biochem Biophys Res Commun. 506 (1), 7-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Modulation of protein synthesis by eif2alpha phosphorylation protects cell from heat stress-mediated apoptosis. Cells. 7 (12), 254(2018).
  25. Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to upr pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
  26. Yang, Y., et al. Ursolic acid alleviates heat stress-induced lung injury by regulating endoplasmic reticulum stress signaling in mice. J Nutr Biochem. 89, 108557(2021).
  27. Mccormick, J. J., Dokladny, K., Moseley, P. L., Kenny, G. P. Autophagy and heat: A potential role for heat therapy to improve autophagic function in health and disease. J Appl Physiol (1985). 130 (1), 1-9 (2021).
  28. Mccormick, J. J., et al. Regulation of autophagy following ex vivo heating in peripheral blood mononuclear cells from young adults. J Therm Biol. 91, 102643(2020).
  29. Ojanguren, A., et al. Therapeutic reconditioning of damaged lungs by transient heat stress during ex vivo lung perfusion. Am J Transplant. 23 (8), 1130-1144 (2023).
  30. Parapanov, R., et al. Optimal duration of ex vivo lung perfusion for heat stress-mediated therapeutic reconditioning of damaged rat donor lungs. Eur J Cardiothorac Surg. 67 (2), ezaf027(2025).
  31. Parapanov, R., et al. Transient heat stress protects from severe endothelial damage and dysfunction during prolonged experimental ex-vivo lung perfusion. Front Immunol. 15, 1390026(2024).
  32. De Brito, F. B., Hanahoe, T. H., Shah, P., West, G. B. Delayed hypersensitivity reactions in rats and their response to clinical dextran. Int Arch Allergy Appl Immunol. 69 (2), 109-112 (1982).
  33. Stahl, W. R. Scaling of respiratory variables in mammals. J Appl Physiol. 22 (3), 453-460 (1967).
  34. Levvey, B., et al. Influence of lung donor agonal and warm ischemic times on early mortality: Analyses from the ishlt dcd lung transplant registry. J Heart Lung Transplant. 38 (1), 26-34 (2019).
  35. Parapanov, R., et al. Experimental models of ischemic lung damage for the study of therapeutic reconditioning during ex vivo lung perfusion. Transplant Direct. 8 (7), e1337(2022).
  36. Lindstedt, S. L., Schaeffer, P. J. Use of allometry in predicting anatomical and physiological parameters of mammals. Lab Anim. 36 (1), 1-19 (2002).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: Lessons learned from developing a rat evlp program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  38. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  39. Nakata, K., Alderete, I. S., Hughes, B. A., Hartwig, M. G. Ex vivo lung perfusion: Recent advancements and future directions. Front Immunol. 16, 1513546(2025).
  40. Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool: Donation after circulatory death, ex-vivo lung perfusion and hepatitis c donors. Clin Chest Med. 44 (1), 77-83 (2023).
  41. Wang, Z., et al. Establishment of a novel ex vivo lung perfusion system for rat lungs after circulatory death. J Vis Exp. (212), e67168(2024).
  42. Gouchoe, D. A., et al. Exploring alternative perfusion solutions using next-generation polymerized hemoglobin-based oxygen carriers in a model of rat ex vivo lung perfusion. J Vis Exp. (208), e66702(2024).
  43. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: Detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).
  44. Braithwaite, S. A., Van Hooijdonk, E., Van Der Kaaij, N. P. Ventilation during ex vivo lung perfusion, a review. Transplant Rev (Orlando). 37 (2), 100762(2023).
  45. Iskender, I. Technical advances targeting multiday preservation of isolated ex vivo lung perfusion. Transplantation. 108 (6), 1319-1332 (2024).
  46. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. Eur J Cardiothorac Surg. 45 (3), e54-e60 (2014).
  47. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (1), L61-L70 (2020).
  48. Mrazkova, H., Lischke, R., Herget, J. Influence of gender on ischemia-reperfusion injury in lungs in an animal model. Physiol Res. 65 (6), 953-958 (2016).
  49. Ricardo-Da-Silva, F. Y., et al. Male versus female inflammatory response after brain death model followed by ex vivo lung perfusion. Biol Sex Differ. 15 (1), 11(2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

transplantacja p ucodpowied na szok termicznyrehabilitacja przeszczepu p ucaciep a niedokrwiennopodatno p ucbia ko szoku termicznego 70op r naczyniowyuszkodzenie r db onka
Prekondycjonowanie termiczne podczas perfuzji płuc ex vivo w celu rehabilitacji uszkodzonych przeszczepów płuc przed przeszczepem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.