Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

CD8+CD103+ Tregi łagodzą chorobę suchego oka poprzez tłumienie zapalenia pośredniczonego przez limfocyty CD4+ oraz ochronę integralności powierzchni oczu u myszy

316 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69110

⸱

21 listopada 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół demonstrujący adopcyjny transfer regulatornych komórek T CD8+CD103+ jako interwencję immunoterapeutyczną mającą na celu łagodzenie wysuszającej choroby suchego oka wywołanej stresem poprzez kompleksową modulację patogennych odpowiedzi komórek T CD4+.

Streszczenie

CD8+CD103+ regulatorowe komórki T reprezentują wyspecjalizowaną populację immunosupresyjną z wykazanym potencjałem terapeutycznym w chorobach autoimmunologicznych; jednak ich rola w zapaleniu powierzchni oczu pozostaje nieznana. Protokół ten opisuje systematyczne podejście do izolowania komórek T CD8+CD103+ od myszy narażonych na stres wysuszający oraz oceny ich skuteczności terapeutycznej poprzez transfer adopcyjny w eksperymentalnej chorobie suchego oka. Metodologia obejmuje sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie dla oczyszczania limfocytów T CD8+CD103+, standaryzowane indukcje stresu wysychającego oraz kompleksowe oceny funkcjonalne, w tym pomiar produkcji łez, testy przepuszczalności bariery rogówki oraz analizę molekularną mediatorów zapalnych. Reprezentatywne wyniki pokazują, że terapia komórkami T CD8+CD103+ znacząco przywróciła produkcję łez, zachowała populacje komórek pucharowych spojówek oraz utrzymała integralność bariery nabłonkowej rogówki. Leczenie pozwoliło na znaczne zahamowanie ekspresji metaloproteinazy macierzowej, zmniejszenie śmierci komórek apoptotycznej oraz modulację profili cytokinowych z wzorców prozapalnych na tkankowo ochronne. Protokół skutecznie zmniejszył infiltrację komórek T CD4+ w tkankach oka, jednocześnie hamując produkcję patogennych IL-17A i IFN-γ oraz zwiększając poziom ochronnego IL-13. Podejście to zapewnia solidne ramy eksperymentalne do badania immunomodulacji komórek T-CD8+CD103+ w zaburzeniach powierzchni oka oraz ustanawia podstawową metodologię opracowywania nowych terapii komórkowych w leczeniu chorób suchego oka.

Wprowadzenie

Suchość oka (DED) stanowi powszechne i wyniszczające zaburzenie powierzchni oka, które stało się istotnym globalnym problemem zdrowotnym, dotykającym 10-30% światowej populacji i znacząco obniżającym jakość życia, produktywność pracy oraz dobrostan psychiczny pacjentów 1,2,3. Patofizjologia DED obejmuje złożoną interakcję między niestabilnością błony łzowej, zapaleniem powierzchni oczu oraz nieprawidłowościami neurosensorycznymi, które wspólnie utrwalają błędne koło uszkodzenia tkanek i upośledzenia funkcji4. Na poziomie molekularnym hiperosmolarność łzowa pełni rolę centralnego mechanizmu patogennego, wywołując kaskadowe zdarzenia zapalne, które aktywują szlaki reakcji stresowej, indukują uwalnianie mediatorów prozapalnych i ostatecznie zaburzają delikatną równowagę homeostatyczną mikrośrodowiska powierzchni oka 5,6,7.

Krajobraz immunologiczny DED jest zdominowany przez adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne, przy czym odporność pośredniczona przez komórki T-CD4+ odgrywa kluczową rolę w koordynacji pogorszenia powierzchni oczu i utrwalaniu przewlekłego stanu zapalnego8. Limfocyty T CD8+ stanowią niezbędny składnik normalnej populacji homeostatycznych komórek odpornościowych w tkankach oka, utrzymując nadzór nad odpornością i integralność tkanek w warunkach fizjologicznych9. Przełomowe badania wykazały, że stres wysuszający (DS) aktywuje komórki prezentujące antygen, a następnie przygotowuje komórki CD4+ T do patogennych fenotypów, które mogą autonomicznie indukować autoimmunologiczne łzowe zapalenie keratoconjunctivita sicca (KCS) po adopcyjnym przeniesieniu na nagie myszy z niedoborem limfocytów T, powtarzając tym samym kluczowe cechy ludzkiego DED10,11.

Biorąc pod uwagę centralną rolę zaburzonych odpowiedzi komórek T CD4+ w patogenezie DED, strategie terapeutyczne ukierunkowane na modulację patogennej odporności limfocytów T wyłoniły się jako obiecujące metody leczenia tej choroby. W tym kontekście komórki regulacyjne T CD8+ (Treg), szczególnie podzbiór CD8+CD103+, zyskały znaczną uwagę ze względu na swoje silne zdolności immunosupresyjne oraz funkcje ochronne tkankowo w różnych chorobach autoimmunologicznych i zapalnych. Te wyspecjalizowane populacje regulacyjne modulują odpowiedzi immunologiczne za pomocą wielu mechanizmów, w tym supresji wywołanej cytokinami, bezpośredniego hamowania kontaktu międzykomórkowego oraz regulacji metabolicznej funkcji limfocytów efektorowych 12,13,14. Integrin αEβ7 (CD103) pełni rolę kluczowego receptora lokalizacyjnego, który ułatwia pozycjonowanie limfocytów wewnątrznabłonkowych w tkankach śluzowych, umożliwiając CD8+CD103+ Tregom wywieranie lokalnych efektów immunoregulacyjnych w miejscach zapalenia15.

Coraz więcej dowodów wskazuje, że CD8+CD103+ Tregi mają istotny potencjał terapeutyczny w łagodzeniu szkodliwych reakcji immunologicznych w różnych autoimmunologicznych schorzeniach śluzowych 16,17,18. Komórki te wykazują unikalne wzorce transportu, które pozwalają na ich preferencyjne gromadzenie się w miejscach śluzowych, gdzie skutecznie przeciwdziałają odpowiedzialnym odpowiedziom immunologicznym niszczącym tkanki, jednocześnie wspierając gojenie i homeostazę. Najnowsze badania zaczęły wyjaśniać rolę komórek T CD8+CD103+ w odporności powierzchni oka, wykazując ich rozbudowę liczbową w węzłach chłonnych szyjki szyjnej po ekspozycji na DS oraz zdolność migracji do tkanek spojówek 19,20,21,22. Jednak pomimo tych intrygujących obserwacji, specyficzny wkład funkcjonalny komórek T CD8+CD103+ do patogenezy suchego oka oraz ich potencjał terapeutyczny w modulowaniu uszkodzeń powierzchni oka wywołanych komórkami T CD4+ pozostają niedo do końca poznane.

Adoptowany transfer CD8+CD103+ Tregów stanowi wyraźny postęp w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami terapeutycznymi DED, w tym sztucznymi łzami, środkami przeciwzapalnymi i lekami immunosupresyjnymi, poprzez celowanie w podstawowe patogenne mechanizmy immunologiczne, a nie jedynie na objawyobjawowe 23. W przeciwieństwie do ogólnoustrojowych terapii immunosupresyjnych, które szeroko hamują funkcjonowanie układu odpornościowego, interwencja oparta na CD8+CD103+ Treg oferuje ukierunkowaną modulację patogennych odpowiedzi komórek T CD4+ przy jednoczesnym zachowaniu odporności ochronnej24. To podejście uzupełnia istniejące terapie komórkowe, takie jak zastosowania komórek macierzystych mezenchymalnych oraz transfer treg CD4+CD25+, zapewniając zwiększoną specyficzność tkanki śluzowej dzięki mechanizmom homemingu podleganym CD10325.

Krytyczna luka w wiedzy dotycząca mechanizmów regulacyjnych, dzięki którym limfocyty T CD8+CD103+ mogą wpływać na patogenezę suchego oka, stanowi istotną barierę w opracowaniu ukierunkowanych interwencji immunoterapeutycznych w tym wyniszczającym schorzeniu. Ponadto złożona współpraca między populacjami komórek T regulacyjnych i efektorowych w stanie zapalnym powierzchni oka wymaga systematycznych badań, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne i zoptymalizować strategie leczenia. Celem tego badania jest kompleksowa charakterystyka regulacji CD8+CD103+ T komórkowej regulacji procesów patogennych napędzanych przez komórki CD4+ T, w dobrze ugruntowanym modelu choroby suchego oka na myszy. Podstawową innowacją metodologiczną jest sekwencyjna izolacja komórek regulacyjnych CD8+CD103+, po której następuje transfer adopcyjny oraz kompleksowa ocena odczytów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu ustalenia skuteczności terapeutycznej i wyjaśnienia mechanizmów leżących. Ostatecznym celem było pogłębienie wiedzy o odpowiedziach immunologicznych na powierzchni oka oraz odkrycie potencjalnych strategii leczenia DED u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt były przeprowadzane ściśle zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Eksperymentalnych Drugiego Szpitala Ludowego Jinan. Podjęto wszelkie wysiłki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt zgodnie z zasadą 3R (Zastępstwo, Redukcja i Udoskonalenie).

1. Przygotowanie zwierząt i projektowanie eksperymentalne

  1. Pobierz samice myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni z zatwierdzonego ośrodka dla zwierząt laboratoryjnych (kod szczepu: 027) o określonym statusie zdrowia wolnym od patogenów.
  2. Zwierzęta domowe w kontrolowanym środowisku, utrzymując 12-godzinne cykle światła i ciemności (światła włączone 06:00-18:00), temperaturę 22 ± 2 °C oraz wilgotność względną 50-60% przy użyciu systemów monitoringu środowiskowego.
  3. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się przez tydzień przed procedurami eksperymentalnymi, zapewniając standardowe jedzenie laboratoryjne i wodę ad libitum.
  4. Losowo przydziel 32 myszy do czterech grup eksperymentalnych (n = 8 na grupę) za pomocą komputerowej randomizacji: kontrolne grupy bez stresu (NS), wyłącznie stres wysuszający (DS), stres wysuszający kontrolą pojazdu (DS + VC) oraz stres wysuszający przy leczeniu limfocytami T CD8+CD103+ (DS + CD8+CD103+).
    UWAGA: Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem oznak stresu, takich jak zmniejszona aktywność fizyczna lub utrata masy ciała przekraczająca 10%.

2. Wysuszanie indukcji stresu

  1. Przygotuj roztwór skopolaminy hydrobromowej poprzez rozpuszczenie 0,5 mg w 0,2 mL sterylnej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) tuż przed użyciem, uzyskując końcowe stężenie 2,5 mg/mL.
  2. Podawaj skopolaminę podskórnie w dawce 0,5 mg/kg masy ciała (około 0,04 mL na 20 g myszy) cztery razy dziennie o 8:00, 12:00, 15:00 i 18:00 przez pięć kolejnych dni z użyciem igieł 27-G.
  3. Ustawij wentylatory o zmiennej prędkości, aby generować ciągły ciąg powietrza o ustandaryzowanej prędkości 15 m/s, mierzonej na poziomie klatki za pomocą kalibracji cyfrowego anemometru.
  4. Utrzymuj wilgotność otoczenia poniżej 40% za pomocą komór osuszających zawierających aktywowany krzemionek (stopień 40, siatka 6-12), jednocześnie monitorując warunki środowiskowe za pomocą cyfrowych higrometrów (dokładność ±2% RH).
  5. Utrzymuj temperaturę na poziomie 22 ± 1 °C przez cały okres ekspozycji, stosując precyzyjne systemy kontroli środowiska z ciągłym monitorowaniem.
  6. Monitoruj zwierzęta dwa razy dziennie pod kątem oznak odwodnienia, utraty masy ciała (>15% uzasadnia wyłączenie) lub zachowań stresowych, w tym nadmiernego pielęgnacji lub ograniczonej aktywności.

3. Izolacja i oczyszczanie komórek T CD8+CD103+

  1. Myszy ofiarne dawczyńców wcześniej wystawione na wysuszanie za pomocą duszenia CO₂, a następnie zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami eutanazji.
  2. Pobieranie śledziony i powierzchownych węzłów chłonnych szyjki szyjnej w warunkach sterylnych przy użyciu sterylnych narzędzi w szafie bezpieczeństwa biologicznego, umieszczając tkanki w lodowatym medium RPMI-1640 z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła.
  3. Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek poprzez mechaniczne rozbijanie tkanek przez sito 70 μm komórek za pomocą sterylnych tłoków strzykawkowych, dwukrotnie mycie komórek PBS zawierającym 2% FBS i 1 mM etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA).
  4. Izoluj komórki T CD8+ za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek za pomocą mikrokulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami CD8, zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Oceń żywotność komórek za pomocą testu wykluczenia trypanowego niebieskiego (roztwór 0,4%), licząc żywotne i nieżywotne komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, kontynuując wyłącznie przy preparatach przekraczających 95% żywotności.
  6. Wzbogacaj ekspresję CD103+ poprzez sekwencyjną inkubację przeciwciałem anty-CD103-APC w rozcieńczeniu 1:100 przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  7. Wykonaj wtórne rozdzielenie magnetyczne z użyciem mikrokulek anty-alofikocyaniny (anty-APC) z kolumnami LS, aby uzyskać komórki CD8+CD103+ podwójnie dodatnie, zgodnie z protokołami producenta.
  8. Zweryfikować czystość komórek za pomocą cytometrii przepływowej poprzez barwienie alikwotów przeciwciałami anty-CD8-FITC i anty-CD103-APC, zapewniając populację komórek CD8>+CD103+ przed dalszą pracą.

4. Protokół transferu adopcyjnego

  1. Przygotuj zawiesiny komórek T CD8+CD103+ w stężeniu 5 × 106 komórek /mL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym poprzez wirowanie komórek w dawce 300 × g przez 5 minut i ponowne zawieszanie w odpowiedniej objętości.
  2. Wstrzyknąć 1 × 106 komórek w 200 μL bezotrzewnowkowego bezpłodnego w dniach -2, 0 i +2 w porównaniu do inicjacji stresu wysuszającego, zapewniając delikatne mieszanie przed każdym zastrzykiem.
  3. Podawanie równoważnych ilości sterylnego PBS grupom kontrolnym pojazdu, stosując identyczny harmonogram i technikę wtrysków, aby utrzymać spójność eksperymentalną.
  4. Utrzymuj przygotowania komórkowe na lodzie i przenosi się w ciągu 2 godzin od izolacji, aby zachować optymalną żywotność i funkcjonowanie.
  5. Rotuj miejsca wstrzyku między lewą a prawą dolną częścią brzucha, aby zminimalizować lokalne zapalenie i monitoruj zwierzęta przez 24 godziny po wstrzyknięciu pod kątem reakcji niepożądanych.

5. Procedura oceny funkcjonalnej

  1. Pomiar produkcji łez
    1. Regularnie wykonuj pomiary o 20:00, aby uwzględnić zmienności okołodobowe w produkcji łz.
    2. Delikatnie unieruchom mysz odpowiednimi urządzeniami bez znieczulenia, aby uniknąć zakłóceń naturalnych mechanizmów produkcji łz.
    3. Włóż nić bawełnianą nasączoną czerwienią fenolem w dolną część spojówki na dokładnie 15 sekund, używając cienko zakończonych kleszczy.
    4. Zmierz długość zwilżonego gwintu natychmiast za pomocą precyzyjnych zacisków cyfrowych (dokładność ± 0,01 mm) w warunkach standaryzowanego oświetlenia jarzeniowego.
  2. Ocena funkcji bariery rogówki26
    1. Krótko znieczulaj mysz inhalacją 2% izofluranem podczas aplikacji tracera, aby zapewnić precyzyjną instulację.
    2. Wprowadzić 0,5 μL roztworu Oregon green-dextran o stężeniu 50 mg/mL na centralnej powierzchni rogówki za pomocą precyzyjnej mikropipety z dodatnimi końcówkami przemieszczającymi.
    3. Dokładnie płucz rogówki sterylną solą fizjologiczną pięć razy po 1 minucie inkubacji, aby usunąć nadmiar znacznika i zapewnić całkowite usunięcie fluorescencji powierzchniowej.
    4. Natychmiast sfotografuj rogówki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z zestawem filtrów izotiocjanianu fluoresceiny (FITC) (wzbudzenie 490 nm, emisja 525 nm) oraz standaryzowane parametry naświetlania.
    5. Ilościowo określ intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania ImageJ z konsekwentnym protokołem wyboru obszaru zainteresowania i odejmowania tła.
      1. Przekonwertowanie obrazów na 8-bitową skalę szarości, zdefiniowanie ustandaryzowanego okrągłego obszaru zainteresowania (ROI) obejmującego centralną średnicę rogówki o średnicy 3 mm.
      2. Zmierz średnią wartość szarości, odejmij fluorescencję tła mierzoną z sąsiedniego obszaru nie-rogówkowego i wyraź wyniki jako skorygowaną całkowitą fluorescencję (CTF) obliczoną jako: CTF = Zintegrowana gęstość - (Obszar ROI × Średnia fluorescencja tła)22.

6. Przetwarzanie i analiza histologiczna

  1. Usuń oczy i otaczające struktury bezpośrednio po eutanazji, następnie utrwal 4% paradehydu na 24 godziny lub umieść w związku o optimalnej temperaturze cięcia (OCT) dla zamrożenia przekrojów, zapewniając właściwą orientację podczas cięcia strzałkowego.
  2. Przygotuj kolejne cięcia strzałkowe (6 μm dla zamrożonych, 5 μm dla parafiny) z wykorzystaniem standaryzowanych punktów anatomicznych (nerw wzrokowy jako punkt odniesienia) dla spójnych płaszczyzn przekroju na wszystkich próbkach.
  3. Wykonaj okresowe barwienie kwasowo-Schiffowe (PAS) w celu kwantyfikacji komórek pucharowych, stosując standardowe protokoły z odpowiednimi kontrolami dodatnimi i ujemnymi.
  4. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne za pomocą przeciwciał pierwotnych: anty-MMP-3 (1:200), anty-MMP-9 (1:100), kaspaza antyaktywowana-3 (1:300), kaspaza antyaktywowana-8 (1:200) oraz anty-CD4 (1:100) z inkubacją nocną w temperaturze 4 °C.
  5. Ilościowo określ komórki pucharowe na milimetr długości spojówki za pomocą systematycznych metod pobierania próbek, licząc komórki w pięciu nienakładających się polach o wysokiej mocy na przekrój oraz uśredniając wyniki.

7. Analiza molekularna

  1. Ekstrakcja całkowitego RNA z połączonych tkanek spojówek i rogówki za pomocą zwalidowanych protokołów ekstrakcji27.
  2. synteza cDNA i ilościowe PCR28 w czasie rzeczywistym
    1. Przygotuj mieszaniny reakcji transkrypcji odwrotnej zawierające 1 μg całkowitego RNA, primery oligo-dT (50 μM), przypadkowe primery heksamerów (100 μM), enzym transkryptozy odwrócnej, bufor reakcji oraz wodę wolną od nukleazy w końcowej objętości 20 μL.
    2. Inkubuj mieszaniny reakcji w cyklerze termicznym w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić syntezę cDNA pierwszej nici.
    3. Inaktywuj enzym transkryptoazy odwrotnej, podgrzewając w 85 °C przez 5 sekund, następnie schłodzić do 4 °C i przechowywać cDNA w -20 °C do czasu użycia.
    4. Rozcieńczony syntetyzował cDNA 1:10 z wodą wolną od nukleazy do wykorzystania jako szablon w kolejnych reakcjach PCR.
    5. Przygotuj mieszaniny reakcji PCR w czasie rzeczywistym (20 μL objętości końcowej) zawierające 1 μL rozcieńczonego matryca cDNA, sprężarki do przodu i do tyłu (stężenie końcowe 0,2 μM każda), mieszankę SYBR Green master mix oraz wodę wolną od nukleazy.
    6. Próbki ładują się w trzech wyliczkach do 96-dołowych płyt refleksyjnych, w tym sterowania bez szablonu dla każdej pary starterów.
    7. Zaprogramuj cykler termiczny według następujących warunków: początkowa denaturacja w 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli denaturacji (95 °C przez 15 s), wyżarzanie (60 °C przez 30 s) oraz wyżarzanie (72 °C przez 30 s).
    8. Bezpośrednio po amplifikacji należy włączyć etap krzywej dysocjacji: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 minutę, następnie stopniowe podnoszenie temperatury do 95 °C z prędkością 0,3 °C/s, aby zweryfikować amplifikację pojedynczego produktu.
    9. Analizuj krzywe amplifikacji i wartości progu cyklu (Ct) za pomocą oprogramowania instrumentów, zapewniając efektywność amplifikacji w zakresie 90-110% dla wszystkich par starterów.
    10. Normalizuj ekspresję genów docelowych (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 i MMP-9) do genu housekeeping GAPDH metodą 2-ΔΔCt .
    11. Używaj sekwencji primerów określonych w Tabeli 1 dla wszystkich genów docelowych i referencyjnych.
  3. Ilościowo określ poziomy białek cytokin w ekstraktach tkankowych za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów ELISA z odpowiednimi standardowymi krzywymi i kontrolą jakości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślna implementacja tego protokołu pozwala na kompleksowe poprawę patologii powierzchni oka wywołanej wysuszaniem wywołanej stresem dzięki immunomodulacji pośredniczonej przez komórki T-komórkowe CD8+CD103+. Pozytywne wyniki wykazują istotną przywracanie produkcji łz, zazwyczaj osiągając 60-80% powrotu w porównaniu z kontrolami bez stresu, podczas gdy zwierzęta leczone pojazdem wykazują utrzymujące się deficyty łzu (Rysunek 1A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie potwierdza, że regulatorowe komórki T CD8+CD103+ są silnymi środkami terapeutycznymi, wysuszającymi suchość oka wywołaną stresem poprzez kompleksową modulację patogennych odpowiedzi patogennych pośredniczonych przez komórki T. Wyniki pokazują, że adopcyjny transfer komórek T CD8+CD103+ zapewnia wieloaspektową ochronę integralności powierzchni oka, obejmującą funkcjonalną przywrócenie produkcji łz, zachowanie architektury śluzówki, utrzymanie funkcji bariery nabłonkowej oraz tłumienie usterek tkanek zapa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących interesów, finansowych ani innych, które mogłyby niewłaściwie wpłynąć na dzieło opisane w tym rękopisie.

Podziękowania

Doceniamy wsparcie techniczne personelu laboratoryjnego w Jinan 2nd People's Hospital oraz personel placówki opieki nad zwierzętami, którzy utrzymywali optymalne warunki mieszkaniowe przez cały okres eksperymentalny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało przeciw CD103-APCBiolegendaKlon 2E7Cytometria przepływowa i sortowanie komórek
Mikrokulki magnetyczne przeciw CD8Miltenyi Biotec-Separacja ogniw magnetycznych
Rogówkowy Oregon green-dekstranInvitrogenD7172Masa cząsteczkowa 70 000
ELISA zestaw IFN-γeBioscienceBMS606Ilościowa ilościowość cytokina
ELISA kit IL-13eBioscienceBMS6015Ilościowa ilościowość cytokina
ELISA kit IL-17AeBioscienceBMS6001Ilościowa ilościowość cytokina
ImageJNarodowe Instytuty ZdrowiaWersja 1.53k
Nici bawełniane w kolorze fenolowym czerwonymZone-Quick, Yokota-Pomiar produkcji łez
Skopolaminowy hydrobromekMelonepharmaMB5860Muskaryński antagonista

Bibliografia

  1. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  2. Harrell, C. R., Feulner, L., Djonov, V., Pavlovic, D., Volarevic, V. The molecular mechanisms responsible for tear hyperosmolarity-induced pathological changes in the eyes of dry eye disease patients. Cells. 12 (23), 2755(2023).
  3. Britten-Jones, A. C., et al. Epidemiology and risk factors of dry eye disease: considerations for clinical management. Medicina (Kaunas). 60 (9), 1458(2024).
  4. Bhujbal, S., Rupenthal, I. D., Steven, P., Agarwal, P. Inflammation in dry eye disease-pathogenesis, preclinical animal models, and treatments. J Ocul Pharmacol Ther. 40 (10), 638-658 (2024).
  5. Nieto-Aristizabal, I., Mera, J. J., Giraldo, J. D., Lopez-Arevalo, H., Tobon, G. J. From ocular immune privilege to primary autoimmune diseases of the eye. Autoimmun Rev. 21 (8), 103122(2022).
  6. Sheppard, J., Shen Lee, B., Periman, L. M. Dry eye disease: identification and therapeutic strategies for primary care clinicians and clinical specialists. Ann Med. 55 (1), 241-252 (2023).
  7. Rolando, M., Merayo-Lloves, J. Management strategies for evaporative dry eye disease and future perspective. Curr Eye Res. 47 (6), 813-823 (2022).
  8. Vereertbrugghen, A., et al. CD4+ T cells drive corneal nerve damage but not epitheliopathy in an acute aqueous-deficient dry eye model. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (48), e2407648121(2024).
  9. Yaman, E., et al. Mouse corneal immune cell heterogeneity revealed by single-cell RNA sequencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (12), 29(2024).
  10. Niederkorn, J. Y., et al. Desiccating stress induces T cell-mediated Sjogren's syndrome-like lacrimal keratoconjunctivitis. J Immunol. 176 (7), 3950-3957 (2006).
  11. Ogawa, Y., Takeuchi, T., Tsubota, K. Autoimmune epithelitis and chronic inflammation in Sjogren's syndrome-related dry eye disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11820(2021).
  12. Flippe, L., Bezie, S., Anegon, I., Guillonneau, C. Future prospects for CD8+ regulatory T cells in immune tolerance. Immunol Rev. 292 (1), 209-224 (2019).
  13. Olson, K. E., Mosley, R. L., Gendelman, H. E. The potential for Treg-enhancing therapies in nervous system pathologies. Clin Exp Immunol. 211 (2), 108-121 (2023).
  14. Boonpiyathad, T., Sozener, Z. C., Akdis, M., Akdis, C. A. The role of Treg cell subsets in allergic disease. Asian Pac J Allergy Immunol. 38 (3), 139-149 (2020).
  15. Xu, W., Bergsbaken, T., Edelblum, K. L. The multifunctional nature of CD103 (αEβ7 integrin) signaling in tissue-resident lymphocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C1161-C1167 (2022).
  16. Zhang, X., et al. CD8+CD103+ iTregs inhibit chronic graft-versus-host disease with lupus nephritis by the increased expression of CD39. Mol Ther. 27 (11), 1963-1973 (2019).
  17. Liu, Y., et al. Phenotypic and functional characteristic of a newly identified CD8+ Foxp3- CD103+ regulatory T cells. J Mol Cell Biol. 6 (1), 81-92 (2014).
  18. Chen, Q., et al. CD8+ CD103+ iTregs protect against ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury by inhibiting pyroptosis. Apoptosis. 29 (9-10), 1709-1722 (2024).
  19. Kaneko, N., et al. Cytotoxic CD8+ T cells may be drivers of tissue destruction in Sjogren's syndrome. Sci Rep. 12 (1), 15427(2022).
  20. Kudryavtsev, I., et al. Circulating CD8+ T cell subsets in primary Sjogren's syndrome. Biomedicines. 11 (10), 2778(2023).
  21. Heidari, M., Noorizadeh, F., Wu, K., Inomata, T., Mashaghi, A. Dry eye disease: emerging approaches to disease analysis and therapy. J Clin Med. 8 (9), 1439(2019).
  22. Ibiayo, A. G., Varinthra, P., Nagarajan, M., Liu, I. Y. Coniferaldehyde reverses 3-nitropropionic acid-induced Huntington's disease pathologies via PKM2 restoration and JAK2/STAT3 inhibition. Mol Med. 31 (1), 271(2025).
  23. Loi, J. K., et al. Corneal tissue-resident memory T cells form a unique immune compartment at the ocular surface. Cell Rep. 39 (8), 110852(2022).
  24. Kennedy-Batalla, R., et al. Treg in inborn errors of immunity: gaps, knowns and future perspectives. Front Immunol. 14, 1278759(2023).
  25. Suffia, I., Reckling, S. K., Salay, G., Belkaid, Y. A role for CD103 in the retention of CD4+CD25+ Treg and control of Leishmania major infection. J Immunol. 174 (9), 5444-5455 (2005).
  26. De Paiva, C. S., et al. IL-17 disrupts corneal barrier following desiccating stress. Mucosal Immunol. 2 (3), 243-253 (2009).
  27. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  28. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  29. Zareh, H., et al. Doxycycline versus curcumin for inhibition of matrix metalloproteinase expression and activity following chemically induced inflammation in corneal cells. J Ophthalmic Vis Res. 19 (3), 273-283 (2024).
  30. Yang, X., et al. IFN-gamma facilitates corneal epithelial cell pyroptosis through the JAK2/STAT1 pathway in dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (3), 34(2023).
  31. Lollett, I. V., Galor, A. Dry eye syndrome: developments and lifitegrast in perspective. Clin Ophthalmol. 2018, 125-139 (2018).
  32. Zhang, X., et al. CD8+ cells regulate the T helper-17 response in an experimental murine model of Sjogren syndrome. Mucosal Immunol. 7 (2), 417-427 (2014).
  33. Zhou, H., Yang, J., Tian, J., Wang, S. CD8+ T lymphocytes: crucial players in Sjogren's syndrome. Front Immunol. 11, 602823(2020).
  34. Lu, Z., et al. Rapid and quantitative detection of tear MMP-9 for dry eye patients using a novel silicon nanowire-based biosensor. Biosens Bioelectron. 214, 114498(2022).
  35. Burgalassi, S., et al. Functionalized hyaluronic acid for "in situ" matrix metalloproteinase inhibition: a bioactive material to treat the dry eye syndrome. ACS Macro Lett. 11 (10), 1190-1194 (2022).
  36. Chen, X., et al. Tc17/IL-17A up-regulated the expression of MMP-9 via NF-kappaB pathway in nasal epithelial cells of patients with chronic rhinosinusitis. Front Immunol. 9, 2121(2018).
  37. Alam, J., et al. IL-17 producing lymphocytes cause dry eye and corneal disease with aging in RXRalpha mutant mouse. Front Med (Lausanne). 9, 849990(2022).
  38. Flores-Pliego, A., et al. Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) is an endogenous activator of the MMP-9 secreted by placental leukocytes: implication in human labor. PLoS One. 10 (12), e0145366(2015).
  39. You, Y., et al. Investigation of conjunctival goblet cell and tear MUC5AC protein in patients with Graves' ophthalmopathy. Transl Vis Sci Technol. 12 (10), 19(2023).
  40. Tukler Henriksson, J., Coursey, T. G., Corry, D. B., De Paiva, C. S., Pflugfelder, S. C. IL-13 stimulates proliferation and expression of mucin and immunomodulatory genes in cultured conjunctival goblet cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4186-4197 (2015).
  41. Fang, Z., et al. Clinical ocular surface characteristics and expression of MUC5AC in diabetics: a population-based study. Eye (Lond). 38 (16), 3145-3152 (2024).
  42. Garcia-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-gamma with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunol. 9 (1), 206-217 (2016).
  43. Volpe, E. A., et al. Interferon-gamma deficiency protects against aging-related goblet cell loss. Oncotarget. 7 (40), 64605-64614 (2016).
  44. Gustafsson, J. K., Hansson, G. C. Immune regulation of goblet cell and mucus functions in health and disease. Annu Rev Immunol. 43 (1), 169-189 (2025).
  45. Lin, N., et al. Ectoine enhances mucin production via restoring IL-13/IFN-gamma balance in a murine dry eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (6), 39(2024).
  46. Ogawa, Y., Shimizu, E., Tsubota, K. Interferons and dry eye in Sjogren's syndrome. Int J Mol Sci. 19 (11), 3548(2018).
  47. Zhang, X., et al. Interferon-gamma exacerbates dry eye-induced apoptosis in conjunctiva through dual apoptotic pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6279-6285 (2011).
  48. Hassan, M., Elzallat, M., Mohammed, D. M., Balata, M., El-Maadawy, W. H. Exploiting regulatory T cells (Tregs): cutting-edge therapy for autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 155, 114624(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stan zapalny powierzchni okalimfocyty T regulatorowetransfer adopcyjnymagnetyczna separacja kom rekprodukcja ezintegralno bariery rog wkowejlimfocyty T CD4modulacja cytokin
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.