Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przedstawiamy tutaj protokół demonstrujący adopcyjny transfer regulatornych komórek T CD8+CD103+ jako interwencję immunoterapeutyczną mającą na celu łagodzenie wysuszającej choroby suchego oka wywołanej stresem poprzez kompleksową modulację patogennych odpowiedzi komórek T CD4+.
CD8+CD103+ regulatorowe komórki T reprezentują wyspecjalizowaną populację immunosupresyjną z wykazanym potencjałem terapeutycznym w chorobach autoimmunologicznych; jednak ich rola w zapaleniu powierzchni oczu pozostaje nieznana. Protokół ten opisuje systematyczne podejście do izolowania komórek T CD8+CD103+ od myszy narażonych na stres wysuszający oraz oceny ich skuteczności terapeutycznej poprzez transfer adopcyjny w eksperymentalnej chorobie suchego oka. Metodologia obejmuje sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie dla oczyszczania limfocytów T CD8+CD103+, standaryzowane indukcje stresu wysychającego oraz kompleksowe oceny funkcjonalne, w tym pomiar produkcji łez, testy przepuszczalności bariery rogówki oraz analizę molekularną mediatorów zapalnych. Reprezentatywne wyniki pokazują, że terapia komórkami T CD8+CD103+ znacząco przywróciła produkcję łez, zachowała populacje komórek pucharowych spojówek oraz utrzymała integralność bariery nabłonkowej rogówki. Leczenie pozwoliło na znaczne zahamowanie ekspresji metaloproteinazy macierzowej, zmniejszenie śmierci komórek apoptotycznej oraz modulację profili cytokinowych z wzorców prozapalnych na tkankowo ochronne. Protokół skutecznie zmniejszył infiltrację komórek T CD4+ w tkankach oka, jednocześnie hamując produkcję patogennych IL-17A i IFN-γ oraz zwiększając poziom ochronnego IL-13. Podejście to zapewnia solidne ramy eksperymentalne do badania immunomodulacji komórek T-CD8+CD103+ w zaburzeniach powierzchni oka oraz ustanawia podstawową metodologię opracowywania nowych terapii komórkowych w leczeniu chorób suchego oka.
Suchość oka (DED) stanowi powszechne i wyniszczające zaburzenie powierzchni oka, które stało się istotnym globalnym problemem zdrowotnym, dotykającym 10-30% światowej populacji i znacząco obniżającym jakość życia, produktywność pracy oraz dobrostan psychiczny pacjentów 1,2,3. Patofizjologia DED obejmuje złożoną interakcję między niestabilnością błony łzowej, zapaleniem powierzchni oczu oraz nieprawidłowościami neurosensorycznymi, które wspólnie utrwalają błędne koło uszkodzenia tkanek i upośledzenia funkcji4. Na poziomie molekularnym hiperosmolarność ł....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt były przeprowadzane ściśle zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Eksperymentalnych Drugiego Szpitala Ludowego Jinan. Podjęto wszelkie wysiłki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt zgodnie z zasadą 3R (Zastępstwo, Redukcja i Udoskonalenie).
1. Przygotowanie zwierząt i projektowanie eksperymentalne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Pomyślna implementacja tego protokołu pozwala na kompleksowe poprawę patologii powierzchni oka wywołanej wysuszaniem wywołanej stresem dzięki immunomodulacji pośredniczonej przez komórki T-komórkowe CD8+CD103+. Pozytywne wyniki wykazują istotną przywracanie produkcji łz, zazwyczaj osiągając 60-80% powrotu w porównaniu z kontrolami bez stresu, podczas gdy zwierzęta leczone pojazdem wykazują utrzymujące się deficyty łzu (Rysunek 1A).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Niniejsze badanie potwierdza, że regulatorowe komórki T CD8+CD103+ są silnymi środkami terapeutycznymi, wysuszającymi suchość oka wywołaną stresem poprzez kompleksową modulację patogennych odpowiedzi patogennych pośredniczonych przez komórki T. Wyniki pokazują, że adopcyjny transfer komórek T CD8+CD103+ zapewnia wieloaspektową ochronę integralności powierzchni oka, obejmującą funkcjonalną przywrócenie produkcji łz, zachowanie architektury śluzówki, utrzymanie funkcji bariery nabłonkowej oraz tłumienie usterek tkanek zapa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących interesów, finansowych ani innych, które mogłyby niewłaściwie wpłynąć na dzieło opisane w tym rękopisie.
Doceniamy wsparcie techniczne personelu laboratoryjnego w Jinan 2nd People's Hospital oraz personel placówki opieki nad zwierzętami, którzy utrzymywali optymalne warunki mieszkaniowe przez cały okres eksperymentalny.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało przeciw CD103-APC | Biolegenda | Klon 2E7 | Cytometria przepływowa i sortowanie komórek |
| Mikrokulki magnetyczne przeciw CD8 | Miltenyi Biotec | - | Separacja ogniw magnetycznych |
| Rogówkowy Oregon green-dekstran | Invitrogen | D7172 | Masa cząsteczkowa 70 000 |
| ELISA zestaw IFN-γ | eBioscience | BMS606 | Ilościowa ilościowość cytokina |
| ELISA kit IL-13 | eBioscience | BMS6015 | Ilościowa ilościowość cytokina |
| ELISA kit IL-17A | eBioscience | BMS6001 | Ilościowa ilościowość cytokina |
| ImageJ | Narodowe Instytuty Zdrowia | Wersja 1.53k | |
| Nici bawełniane w kolorze fenolowym czerwonym | Zone-Quick, Yokota | - | Pomiar produkcji łez |
| Skopolaminowy hydrobromek | Melonepharma | MB5860 | Muskaryński antagonista |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny