Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy model organoidu guza pochodzący od pacjenta do przesiewowego przesiewowego receptorów antygenu T-in in vitro

DOI:

10.3791/69113

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ustanawia model kokultury in vitro wykorzystujący organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów oraz chimeryczne komórki receptora antygenu T (CAR-T) do oceny specyficznej aktywności cytotoksycznej komórek CAR-T wobec komórek nowotworów litych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkami receptorów antygenowych Chimeric T (CAR-T) osiągnęła ekscytującą skuteczność kliniczną w nowotworach hematologicznych, jednak terapia komórkami CAR-T dla guzów litych wymaga dalszego rozwoju. Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów to modele in vitro , które zachowują heterogeniczność pacjentów i były wykorzystywane do testowania skuteczności oraz bezpieczeństwa chemioterapii oraz leków celowanych. Metoda ta opisuje model testów skuteczności in vitro , polegający na współhodowli organoidów nowotworowych z komórkami CAR-T. Próbki raka jelita grubego od pacjentów są budowane w organoidy nowotworowe o trójwymiarowej (3D) strukturze w matrycy błony podstawnej. Organoidy nowotworowe mogą rosnąć stabilnie i być nieprzerwanie przepuszczane. Dojrzałe organoidy nowotworowe są oddzielane od matrycy przez płukanie i wirowanie, a komórki CAR-T są dodawane w różnych stosunkach efektor-cel (E:T), tworząc układ współhodowli immunoorganoidalnej. Po 6-24 godzinach morfologia i struktury międzykomórkowe organoidów są obserwowane za pomocą obrazowania w jasnym polu. Eksperyment ten przeprowadza także barwienie martwych komórek w systemie współhodowli, co może odzwierciedlać żywotność organoidów oraz oceniać cytotoksyczny wpływ komórek CAR-T na organoidy nowotworowe. Eksperyment ten pozwala skutecznie obserwować interakcje między komórkami CAR-T a trójwymiarowymi organoidami nowotworowymi, a wyniki mogą posłużyć do oceny aktywności komórek CAR-T niszczącej guzy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkami receptorów antygenowych Chimeric T (CAR-T) wykazała niezwykłe sukcesy kliniczne w leczeniu nowotworów hematologicznych1. Jednak jego zastosowanie w guzach litych pozostaje ograniczone z powodu kilku poważnych przeszkód, w tym heterogeniczności guzów i utraty antygenów, barier fizycznych i chemicznych w masie guza oraz immunosupresyjnego mikrośrodowiska guza 2,3. Te wyzwania przyczyniają się do ograniczonej skuteczności terapii komórkową CAR-T w środowiskach z guzem litym.

Ocena in vitro skuteczności komórek CAR-T jest kluczowym etapem rozwoju przedklinicznego. Najczęściej stosowanymi modelami są linie komórek nowotworowych, które mogą albo wyrażać specyficzne antygeny związane z nowotworem, albo być zaprojektowane tak, aby przenosić geny reporterowe, takie jak lucyferaza 4,5. W konsekwencji wyniki konwencjonalnych testów opartych na liniach komórkowych często nie przewidują wyników klinicznych. Modele nowotworów pochodzące od pacjentów stanowią obiecującą alternatywę do dokładniejszej oceny funkcji CAR-T w kontekście guzów litych.

Chociaż kilka badań zaczęło wykorzystywać PDTO do oceny komórek CAR-T, pozostają wyzwania w ustanowieniu ustandaryzowanych, solidnych i dostępnych protokołów kokultury, które skutecznie zrównoważą zachowanie architektury 3D nowotworów z efektywną interakcją komórek immunologicznych z komórkami nowotworowymi. Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDTO) to trójwymiarowe (3D) modele chorób ex vivo generowane z tkanek lub komórek nowotworowych pacjentów. PDTO zostały z powodzeniem opracowane dla szerokiego zakresu typów nowotworów, w tym raka jelita grubego, piersiowego, trzustki i płuc. Struktury te zachowują strukturę histologiczną, profile molekularne oraz funkcjonalną heterogeniczność oryginalnego guza6. Obok pierwotnych komórek nowotworowych i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX), PDTO stanowią cenną platformę do modelowania cech chorób specyficznych dla pacjenta7. W porównaniu z konwencjonalnymi liniami komórkowymi nowotworowymi lub hodowlami pierwotnymi, PDTO dokładniej oddają środowisko in vivo nowotworowe, wykazując złożony skład komórkowy i strukturę8. Utrzymują także stabilność genomową i zachowują wzorce ekspresji genów na dłuższych trasach, co pozwala na dokładniejszą ocenę odpowiedzi terapeutycznych 9,10. PDTO były z powodzeniem wykorzystywane w badaniach biologii nowotworów, przesiewowych leków oraz medycyny precyzyjnej, a także są coraz częściej doceniane za zastosowanie w testach immunoterapii, w tym identyfikacji nowych celów CAR, optymalizacji projektowania CAR oraz ocenie cytotoksyczności 6,11,12,13 . Częstym ograniczeniem hodowli organoidów jest jej zależność od składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takich jak Matrigel (dalej nazywany matrycą błony podstawnej [BMM]), do utrzymania struktury 3D, co może utrudniać infiltrację komórek odpornościowych w testach kohodowlacyjnych. Aby zapewnić spójność i optymalną interakcję komórek w współhodowli, zazwyczaj wybiera się organoidy w określonym zakresie wielkości (np. 100-200 μm średnicy).

Protokół ten opisuje platformę kokulturową do oceny cytotoksyczności komórek CAR-T z wykorzystaniem PDTO pochodzących z raka jelita grubego. Próbki nowotworów pacjentów są enzymatycznie dysocjowane i hodowane w BMM, aby uzyskać 3D organoidy. Po dojrzewaniu i rozszerzeniu organoidy o jednolitym rozmiarze są izolowane i znakowane fluorescencjona. Są one zasiewane na płytach wielodołkowych i współhodowane z komórkami CAR-T przy różnych stosunkach efektor-cel (E:T). Kluczową cechą tego podejścia jest celowe usunięcie PDTO z BMM przed współhodowlą, co umożliwia bezpośredni i niezakłócony dostęp komórek CAR-T do organoidów nowotworowych, przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności 3D w zawiesie. Po 24 godzinach mikroskopia jasnego pola ujawnia postępującą dezintegrację PDTO, charakteryzującą się zaburzeniami morfologii 3D, kurczeniem komórek nowotworowych oraz utratą żywotności. Obrazowanie żywych komórek i mikroskopia fluorescencyjna dodatkowo wizualizują interakcje między fluorescencjonalnie oznakowanymi komórkami CAR-T a celami nowotworowymi. Do oceny cytotoksyczności stosuje się ilościowe testy śmierci komórkowej. Ta kokultura immunologiczna oparta na organoidach stanowi solidną i dostosowaną do pacjenta platformę do oceny skuteczności przeciwnowotworowej komórek CAR-T ex vivo, umożliwiając optymalizację terapii i wspieranie translacji klinicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosowano organoidy pochodzące od pacjentów z rakiem jelita grubego. Fragmenty tkanki nowotworowej pozyskano od pacjentów nieleczonych z histologicznie potwierdzonym pierwotnym gruczolakiem jelita grubego (CRC). Wszystkie tkanki zostały pobrane z próbek endoskopowych pobranych podczas standardowych procedur diagnostycznych w Szpitalu Strefy Wolnego Handlu w Shenzhen Qianhai Shekou. Wszystkie tkanki dawcy zostały potwierdzone jako CRC poprzez badanie histopatologiczne przeprowadzone przez patologów instytucjonalnych. Protokół opiera się na wytycznych instytucjonalnych. Wszyscy pacjenci uzyskali pisemne świadome zgody. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szpitala Strefy Wolnego Handlu w Shenzhen Qianhai Shekou (2024KY-009-01K).

1. Kultura PDTO

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Umieść fragmenty tkanki nowotworowej pobrane w wyniku biopsji kolonoskopii od pacjentów z histologicznie potwierdzonym pierwotnym gruczolakiem jelita grubego (CRC) do sterylnej probówki o pojemności 50 mL.
    2. Dodaj 30 mL roztworu do płukania zimnych tkanek składającego się z Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 1% Bowine Serum Albumin (BSA), 100 U/mL penicyliny, 0,1 mg/mL streptomycyny, 50 μg/mL gentamicyny, 5 μg/mL amfoterycyny B oraz 10 μM inhibitora kinazy powiązanej z Rho (Y-27632).
    3. Umieść rurkę na lodzie i delikatnie kołysz przez 5 minut, aby umyć tkankę.
    4. Powtórz krok 1.1.3. dwa kolejne razy z nowym roztworem do mycia tkanek.
  2. Trawienie tkanek
    1. Przytnij martwiczą lub tkankę tłuszczową i pokrój guz na fragmenty tkanki.
    2. Podgrzej 8 mL pożywki trawiennej (DMEM, 500 U/mL kolagenaza IV, 1,5 mg/mL kolagenaza II, 20 μg/mL hialuronidaza, 0,1 mg/mL dyspaza typu II, 10 μM Y-27632 oraz 1% surowicy płodowej) do 37 °C.
    3. Przenieś fragmenty do buforu trawienia i inkubuj w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej. Delikatnie mieszaj rurkę ręcznie przez ~10 sekund co 5 minut, aby ułatwić penetrację enzymów.
      UWAGA: Dostosuj objętość buforu trawienia zgodnie z rozmiarem bloku tkankowego. Zazwyczaj 8-10 ml wystarcza do rozmiarów biopsji endoskopowych.
    4. Obserwuj pod mikroskopem po 15 minutach, aby sprawdzić stan dysocjacji. Jeśli fragmenty tkanek pozostają, kontynuuj trawienie maksymalnie do 30 minut.
    5. Gdy skupiska są widoczne, delikatnie pipetuj (5-10 razy) za pomocą pipety 10 mL, aby mechanicznie się rozłączyć. Wirówka na 350 × g przez 5 minut.
    6. Usuń supernatant; ponownie zawiesij pellet w 10 mL roztworu płukania i wiruj w 350 × g przez 5 minut. Powtarzaj pranie dwa razy.
      UWAGA: PDTO zazwyczaj zaczynają tworzyć zwarte struktury kuliste w ciągu 3-5 dni od hodowli. Organoidy wykazywały silną proliferację i osiągały odpowiedni rozmiar do eksperymentów (około 100-200 μm średnicy) do 10-14 dnia. Passaging wykonywano co 7-10 dni, aby utrzymać zdrowy wzrost i zapobiec nadmiernemu zbiegowi lub martwicy centralnej. Zazwyczaj na biopsję stosuje się bufor trawienny o pojemności 8-10 ml (fragmenty 2 mm³), zapewniając TrypLE Express w końcowym stężeniu roboczym 1×.

2. Budowa PDTO

  1. Osadzanie macierzy
    1. Włóż 200 μL BMM (wstępnie schłodzonego w 4 °C) do czystej rurki i pipetuj pellet komórki w górę i w dół co najmniej 10-15 razy za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety, aż zawiesina będzie jednorodna, bez widocznych grudek.
    2. Do każdej dołki płytki 24-dołkowej należy wprowadzić około 30 μL kropel. Inkubuj w 37 °C przez 10 minut, aby się zastygnąć.
    3. Dodaj 500 μL pożywki hodowli organoidów (Advanced DMEM/F12 medium, zawierające 50 μg/mL R-spondin 1, 10 μg/mL Noggin, 500 μg/mL EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocyn, 500x Gentamicyn/amfoterycyna B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-Acetylcysteiny, 1 M Niacynamid, 5 mM inhibitora Alk 4/5/7, 30 M inhibitora p38, 100 μM gastryny i 100 μM prostaglandyny E2) na dołek.
      UWAGA: Użyj około 30 μL BMM na kroplę; Dostosuj w zależności od gęstości komórek.
  2. Utrzymanie kultury
    1. Hodowanie organoidów w temperaturze 37 °C z zawartością 5%CO2; Zmieniaj medium co 3 dni.
    2. Codziennie monitoruj powstawanie organoidów. Spodziewaj się małych sferoidów już trzeciego dnia.
    3. Oceń udane ustanowienie organoidów w dniach 6-10. Czas powstawania (od 3 do 14 dni) zależy od żywotności tkanek i ich łodygówności.

3. Uprawnienia PDTO przepuszczające

  1. Rozdzielenie
    1. Wstępnie schłodzić wirówkę do 4°C. Usuń podłoże i dodaj 1 ml lodowatego HBSS i delikatnie pipetuj 3-5 razy, aby zakłócić wypływ (BMM).
      UWAGA: Dobrze rozwinięte organoidy można zaobserwować gołym okiem jako małe białe kropki.
    2. Przełóż zawiesina do sterylnej probówki 15 mL i wiruj w 350 × g przez 5 minut.
  2. Dysocjacja enzymów
    1. Usuń supernatant i dodaj 1 mL TrypLE. Umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty.
    2. Dodaj 2 mL HBSS, aby zneutralizować TrypLE; Wirówka na 350 × g przez 5 minut.
    3. Usuń supernatant i ponownie zawiesij w 2 ml HBSS. Ponownie wiruj na 350 × g przez 5 minut.
  3. Ponowne osadzanie
    1. Dodaj świeży BMM do pelletu w proporcji 1:3-1:6 (pellet organoidalny: BMM, v/v); delikatnie zawiesij. Każda kropla zawiera około 30 μL objętości końcowej. Umieść krople w nowej płytce z 24 dołkami; inkubuj w 37 °C przez 10 minut.
    2. Dodaj 500 μL pożywki hodowlanej na dołek i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    3. Codziennie sprawdzaj studnie; obserwuj ponowne składanie 3D w ciągu około 48 godzin.
    4. Po 3-5 przejściach wybieraj zdrowe organoidy do dalszych badań lub kriokonserwacji.

4. Współhodowla komórek CAR-T i PDTO

  1. Przygotowanie podłoża kokulturalnego
    1. Uzupełnij podstawowy pożywkę hodowli organoidów o 10 ng/L IL-2 oraz 0,05 mM β-merkaptoetanolu, aby wspierać żywotność CAR-T.
      UWAGA: Podstawa wspiera strukturę 3D i wykonalność PDTO.
  2. Przygotowanie do PDTO
    1. Usuń krople BMM zawierające dojrzałe PDTO (np. dzień 4-6) z płyty hodowlanej za pomocą sterylnego skrobaka lub końcówki pipety.
    2. Przelej mieszankę BMM/PDTO do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
    3. Dodaj do probówki 5-10 ml lodowatego roztworu HBBS lub roztworu do płukania tkanin (zgodnie z krokiem 1.1.2). Odwróć delikatnie 5-10 razy, aby usunąć organoidy z stolicy ciała.
    4. Pozwól mieszance stać na lodzie przez 5 minut. BMM stanie się ciekły, podczas gdy dysocjowane PDTO pozostają w zawieszeniu.
    5. Ostrożnie zasysaj supernatant zawierający BMM, zostawiając granulkę PDTO. Unikaj poruszania granulek.
    6. Powtórz kroki 4.2.3 do 4.2.5 jeszcze dwa razy, aby zapewnić całkowite usunięcie BMM.
    7. Po końcowym płukaniu pobierz supernatant zawierający PDTO i poddaj w wirówce w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Aspiruj supernatant i ponownie zawiesij pellet PDTO w 1-2 mL pożywki organoidowej lub podłoża współhodowlanego.
    9. (Opcjonalne do liczenia) Przygotuj zawiesinę jednokomorową.
      1. Jeśli wymagane jest precyzyjne liczenie, przenieś ponownie zawiesowane organoidy do nowej rurki i inkubuj z wcześniej podgrzanym TrypLE Express w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, a następnie delikatnie pipetuj, aby uzyskać zawiesinę pojedynczą. Kontynuuj liczenie komórek (np. za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek).
        UWAGA: Ten etap rozłącza organoidy i służy jedynie do liczenia przed ponownym powlekaniem.
    10. Dobór wielkości i standaryzacja: Aby zapewnić spójny rozmiar organoidów do współhodowli, przepuszczaj ponownie zawieszone PDTO (od etapu 4.2.8) przez sitko komórkowe o pojemności 70 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mL. Ten etap usuwa duże agregaty organoidalne i zanieczyszczenia, co stanowi ustandaryzowaną frakcję wielkości odpowiednią do jednolitej kokultury.
    11. Wiruj standaryzowaną zawiesinę organoidową w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    12. Aspiracja supernatantu i ponowne zawieszenie ustandaryzowanych PDTO w odpowiedniej objętości podgrzewanego podłoża kokulturowego.
    13. Policz standaryzowane PDTO (np. używając hemocytometru pod mikroskopem, licząc liczbę organoidów na pole).
      UWAGA: Liczenie opiera się na liczbie organoidów, a nie na liczbie komórek.
    14. Zasiewaj standaryzowane PDTO do pożądanej płyty wielodołowej (np. 96-dołkowa płyta U-bottom) przy docelowej liczbie na odwiert.
    15. Dodawaj ogniwa CAR-T do otworów przy pożądanych stosunkach efektor-cel (E:T).
  3. Oznaczanie PDTO
    1. Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C. Aspirować podłoże; dodaj 1 mL HBSS, aby usunąć krople.
    2. Przelej do probówki wirówki o pojemności 15 mL, dodaj 4 mL HBSS i delikatnie pipetuj. Wirówka na 350 × g przez 5 minut.
    3. Usuń supernatant, dodaj 5 ml HBSS i delikatnie pipetuj. Ponownie wiruj w 350 × g przez 5 minut.
    4. Przygotuj rozwiązanie robocze Hoechst 33342.
    5. Ponownie zawiesnij pellet w roztworze 1 mL Hoechst 33342 (końcowe stężenie 5 μg/mL). Delikatnie mieszaj przez inwersję 3-5 razy, aby zapewnić równomierne przenikanie barwnika. Chroń przed światłem owijając tubkę folią aluminiową. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po barwieniu myj dwa razy HBSS, aby usunąć nadmiar barwnika.
  4. PDTO do poszycia
    1. Oszacuj gęstość organoidów przy stosunku kropli żelu do studni 1:5; ponownie zawiesz w podłożu współhodowlającym przy około 1 × 103 organoidów/mL.
    2. Dodaj 100 μL na odwiert do płyty z 96 dołkami; Uwzględnij co najmniej potrójne warianty na każde schorzenie.
      UWAGA: Nie wykonuj liczenia komórek na tym etapie; organoidy pozostają nienaruszone.
  5. Kokultura CAR-T
    UWAGA: Protokół ten koncentruje się na współhodowli i ocenie skuteczności komórek CAR-T z PDTO. Generowanie i charakterystyka komórek CAR-T użytych w tym badaniu opisano w Sekcji 8.
    1. Zbieraj komórki CAR-T w fazie logariatu. Barwienie Trypan Blue potwierdza przydatność >95%.
    2. Ogniwa wirówkowe o pojemności 350 × g przez 5 minut; Zawiesić w medium kokulturowym.
    3. Dostosuj stężenia do 4 × 106/mL, 2 × 106/mL oraz 1 × 106/mL.
    4. Dodaj 100 μL zawieszenia CAR-T na odwiert zgodnie z projektem eksperymentalnym. Dodaj 100 μL podłoża kokulturowego, aby kontrolować studnie.
    5. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 6-24 godziny.

5. Barwienie martwych komórek

  1. Zielone barwienie SYTOX
    1. Na każde 1 ×10 5 komórek przygotuj 100 μL roztworu barwienia Nuclear Green, rozcieńczając 1 μL SYTOX Green (1000x) do 1 mL buforu testowego.
    2. W punktach czasowych 6- i 24-godzinnej kokultury należy dodawać 100 μL roztworu barwienia SYTOX Green na odwiert. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut w ciemności.

6. Akwizycja obrazu

  1. Aspiruj supernatant i dodaj 100 μL DMEM/F12.
  2. Rejestrowanie obrazów w jasnym polu i fluorescencji za pomocą mikroskopu (np. konfokalnego):
    Hoechst 33342 (PDTO): wzbudzenie (Ex)/emisja (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (martwe komórki): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Uchwyć co najmniej potrójne zdjęcia na studnię, skupiając się na polu centralnym.

7. Analiza danych

  1. Launch ImageJ (wersja 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); importuj obrazy kanału SYTOX Green. Ręcznie ustaw próg, aby odróżnić sygnały fluorescencji od tła (Obraz > Adjust > Threshold).
  2. Użyj funkcji Analizuj > Mierz, aby obliczyć gęstość całkowitą. Eksportuj dane .csv do późniejszej analizy statystycznej w odpowiednim oprogramowaniu do analizy statystycznej (np. GraphPad Prism).
  3. Ustaw próg, aby oddzielić sygnały fluorescencji od tła.
  4. Wybierz całe pole; run Analizuj > Mierz, aby obliczyć zsumowaną intensywność sygnału fluorescencyjnego.
  5. Eksportować dane i przeprowadzić analizę statystyczną w celu porównania leczonego z kontrolnym po 24 godzinach.

8. Generowanie i charakteryzacja komórek CAR-T

  1. Projekt konstrukcji CAR
    UWAGA: Komórki CAR-T użyte w tym badaniu celują w B7-H3 (zakodowany przez gen CD276), antygen często nadekspresjony w raku jelitagrubego 14. Konstrukcja CAR składa się z:
    Domena zewnątrzkomórkowa: Fragment zmiennej pojedynczej łańcuchowej (scFv) pochodzący z przeciwciała monoklonalnego przeciwko klonowi B7-H3 376.96.
    Domena zawiasowa i transbłonowa: domena zawiasowa CD8α i domena transbłonowa.
    Domena współstymulująca: ludzki CD28.
    Domena sygnalizacji: ludzki CD3ζ.
  2. Generowanie ogniw CAR-T
    1. Izolacja: Izoluj komórki jednojądrowe krwi obwodowej (PBMC) z zdrowych sierści buffy za pomocą wirowania gęstościowego Ficoll-Paque14.
    2. Aktywacja: Aktywuj ludzkie PBMC z przeciwciałami anty-CD3/CD28 z wiązaniem płytkowym przez 48 godzin w ośrodku limfocytów T, uzupełnionym o 10 ng/mL IL-7 i 5 ng/mL IL-15. Przygotuj podłoże T-komórkowe, mieszając równe ilości (po 250 ml każda) RPMI 1640 i Click's Media, uzupełniając o 10% płodowe surowicę bydła (FBS), 1x GlutaMAX i 1% penicylin-streptomycyny (Pen/Streptokoka).
    3. Transdukcja: Transdukcja aktywowanych limfocytów T za pomocą supernatantu retrowirusowego za pomocą płytki pokrytej retronektyną, jak opisanowcześniej 15.
    4. Ekspansja: Pozyskaj i hoduj limfocyty T 3 dni po transdukcji w kompletnym ludzkim pożywce T-komórkowym zawierającym IL-7 i IL-15 przez dodatkowe 7-9 dni przed charakterystyką i testami funkcjonalnymi.
  3. Charakteryzacja komórek CAR-T
    1. Ekspresja CAR: Ocena ekspresji CAR 5-7 dni po transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą rekombinowanego białka B7-H3-Fc, a następnie fluorescencyjnie oznakowanego przeciwciała wtórnego przeciwko ludzkiemu Fc14. Typowa sprawność transdukcji (ogniwa CAR+) waha się od 80% do 90%.
    2. Fenotyp: Scharakteryzuj podzbiory limfocytów T (np. CD4+, CD8+ itd.) za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał przeciwko CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7itd. 14.
    3. Walidacja funkcjonalna (opcjonalna pre-ko-hodowla): Przed eksperymentami współhodowlanymi należy funkcjonalnie zweryfikować komórki CAR-T poprzez współhodowlę z liniami komórkowymi docelowymi B7-H3 i B7-H3-ujemnymi oraz mierzyć uwalnianie cytokin (np. IFN-γ przez ELISA) lub cytotoksyczność (np. za pomocą cytometriiprzepływowej 15).
  4. Przygotowanie do współkultury (Test PDTO)
    1. Używaj komórek CAR-T do współhodowli podczas ich logarytmicznej ekspansji (zazwyczaj między dniami 10-14 po aktywacji). Przed użyciem należy dwukrotnie przemyć komórki HBSS, aby usunąć IL-7/IL-15 i ponownie je zawiesijować w podłożu kohodowlającym opisanym w kroku 4.1.
    2. Potwierdź żywotność na >95% za pomocą barwienia Trypan Blue.
    3. Punkty kontrolne wizualne: Sprawdź małe skupiska sferyczne (50-100 μm) w dniach 3-5 oraz dojrzałe sferoidy (100-200 μm) w dniach 10-14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy raka jelita grubego zostały pomyślnie pobrane z próbek biopsji endoskopowej (Rysunek 1), a tożsamość guza potwierdzono diagnozą patologiczną (Rysunek 2). Fragmenty guza hodowane w BMM zaczęły tworzyć struktury 3D w ciągu 24 godzin. Organoidy pierwszej generacji (P0) były przepuszczane między dniem 7-14. Organoidy wykazywały różnorodne morfologie, w tym struktury kuliste, torbielowate i okrągłe (Rysunek 2A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono metodę oceny cytotoksycznego wpływu komórek CAR-T na PDTO, łączącą obrazowanie w jasnym polu i barwienie fluorescencyjne w celu oceny żywotności organoidów. To podejście podwójnej modalności umożliwia solidną wizualizację śmierci komórek nowotworowych w modelu 3D i zapewnia półilościową ocenę cytotoksyczności CAR-T.

Kluczowym elementem tego protokołu jest podłoże hodowlane. Ponieważ komórki CAR-T i organoidy nowotworowe mają różne wymagania odżywcze, najpierw oceni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), Projekt Nauki i Technologii w Systemie Medycznym i Zdrowotnym Nanshan (NSZD2024046, NS2024105) oraz Fundusz Badań Medycznych Shenzhen (D2401023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka 15 mLSAINING3030100
Płytka z 24 dołkamiCORNING3524
Rurka 50 mLSAINING3030000
Płyta z 96 dołamiCORNING3599
Zaawansowane DMEM/F12GibcoC11330500BT
Inhibitor Alk 4/5/7MCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Szafka do bezpieczeństwa biologicznego (Klasa II)Thermo FisherNie ma
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA9056
Talerz hodowli komórkowychBIOFILTCD010060
WirówkaEppendorf5810R
Medium ClickaFUJI FILM9195
Inkubator CO2YamataIP610
Kolagenaza IISolarbioC8150
Kolagenaza IVSigma AldrichC9407
Mikroskop laserowy konfokalnyZeissLSM900
Medium kriokonserwacyjneZENOAQCELLBANKERTM2
Bufor trawieniaOdczynniki przygotowywane na miejscuNie maKompozycja zawarta w rękopisie
Shaker cyfrowyMIULABHS-25
Typ dyspozycji IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Surowica bydła płodowaGibco1631389
GastrynaGlpBioGA20228
Gentamicyna/amfoterytyna BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Zrównoważony Roztwór Soli HanksaGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342  BeyotimeC1027
HialuronidazaSolarbioH8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NowoproteinCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (open-source)https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted  Mikroskop fluorescencyjnyMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AcetylcysteinaSigma AldrichA7250-5G
NiacynamidSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocynaInvivoGenANT-NR-1
Medium hodowlane organoidówOdczynniki przygotowywane na miejscuNie maKompozycja zawarta w rękopisie
Inhibitor p38MCEHY-10295 
Streptomia penicylinowaGibco15140122
Prostaglandyna E2MCEHY-101952  
inhibitor kinazy związanej z Rho Komórki macierzyste72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
Wypełniacze Pipetów z sezonu 1Thermo Scientific9501
Pipeta serologicznaBIOFILGSP-010-050
Pipeta jednokanałowaEppendorf3123000063
Pipeta jednokanałowaEppendorf3123000055
Pipeta jednokanałowaEppendorf3123000098
Pipeta jednokanałowaEppendorf3123000022
Sterylne jednorazowe skalpeleTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196
Zbiornik na wodę termostatuBluepardBWS-10
Trypan BluePhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-merkaptoetanolGibco21985023

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewowe badanie kom rek CAR Ttr jwymiarowe organoidyorganoidy pochodz ce od pacjent wkokultura organoid w immunologicznychorganoidy raka jelita grubegomatryca b ony podstawnejbarwienie martwych kom rekaktywno cytotoksyczna przeciwko guzowitest cytotoksyczno ci

Powiązane artykuły