Artykuł metodologiczny

Stratyfikowane ramy genomowe do przewidywania serotypów Salmonelli : ocena MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S i SISTR w południowo-zachodnich Chinach

498 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

9 stycznia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten ustanawia stratyfikowany przepływ genomowy do przewidywania serotypów Salmonella , wykorzystując MLST lub SeqSero2S do rutynowej inwigilacji, SISTR z MLST z rdzeniowym genomem MLST do wykrywania wybuchów oraz SeqSero2S do szybkiego przesiewu. Protokół został zweryfikowany poprzez analizę wielocentrową, aby wzmocnić nadzór w Chinach.

Streszczenie

Dokładne serotypowanie Salmonelli jest niezbędne do skutecznego nadzoru i badania epidemii, ponieważ różnorodność serotypów bezpośrednio wpływa na patogenność i ocenę ryzyka zdrowia publicznego. Jednak konwencjonalne metody aglutynacji szkiełkowej są ograniczone przez niską powtarzalność, intensywność pracy i wysokie koszty, co utrudnia ich zastosowanie w programach monitorowania o wysokiej przepustowości. Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy i zweryfikowaliśmy proces genomowy integrujący Multilocus Sequence Typing (MLST), Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 oraz SeqSero2S do przewidywania serotypów z wykorzystaniem danych z całego genomu. Protokół ten został oceniony w oparciu o wieloośrodkową analizę 315 izolatów Salmonelli pobranych z żywności i ludzi w południowo-zachodnich Chinach. Wyniki tego badania wykazały istotnie wyższą zgodność między podejściami genomowymi (do 100%/99,1%/90,1% w zbiorze treningowym oraz 100%/97,1%/93,1% w zestawie walidacyjnym dla SISTR/MLST/SeqSero2S, odpowiednio) w porównaniu z tradycyjnym serotypowaniem. Workflow obejmuje zalecenia dotyczące wyboru odpowiednich metod predykcji w oparciu o kontekst nadzoru, z naciskiem na MLST i SeqSero2S do rutynowego monitorowania, SeqSero2S do szybkiego przesiewu oraz SISTR z MLST z rdzeniem genomu do badań w przypadku epidemii. Takie podejście ułatwia integrację serotypowania genomowego z praktyką zdrowia publicznego, zmniejszając poleganie na tradycyjnej serologii oraz poprawiając powtarzalność i skalowalność w programach monitorowania Salmonelli .

Wprowadzenie

Salmonella jest jednym z najważniejszych patogenów przenoszonych przez żywność na świecie, powodując znaczną zachorowalność i śmiertelność 1,2. W Chinach pozostaje główną przyczyną chorób przenoszonych przez żywność, a ograniczona liczba serotypów odpowiada za większość zakażeń3. Dokładna identyfikacja serotypów jest kluczowa dla nadzoru i badań w zakresie epidemii, ponieważ różnorodność serotypów jest ściśle powiązana z patogennością i ryzykiem dla zdrowia publicznego. Jest to dobrze znane u powszechnych serotypów, takich jak Salmonella enteritidis i Salmonella typhimurium, ale niektóre mniej zbadane serotypy, takie jak Salmonella Panama, są również istotną przyczyną globalnego rozprzestrzeniania się i inwazyjnych chorób4, co podkreśla ogólną potrzebę solidnych zdolności serotypowania. Tradycyjne metody serotypowania, od dawna uznawane za złoty standard, są czasochłonnym i kosztownym procesem, który wymaga ponad 150 antyserum5. Dodatkowo ogranicza je słaba powtarzalność6, pracochłonne procesy7 oraz wrodzona zmienność wynikająca z subiektywnej interpretacji reakcji aglutynacji8, co czyni je niewystarczającymi dla programów monitorowania o wysokiej przepustowości9.

Pojawienie się sekwencjonowania całego genomu (WGS) zrewolucjonizowało charakteryzację patogenów, umożliwiając szybkie, wysokorozdzielcze przewidywanie serotypów 10,11,12. Opracowano kilka narzędzi in silico, w tym Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 oraz Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Podczas gdy MLST oferuje standaryzowane, długoterminowe monitorowanie epidemiologiczne16, SeqSero2 i SeqSero2S umożliwiają bezpośrednią analizę na podstawie surowych odczytów oraz ułatwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe typów serotypów 14,15. Natomiast SISTR wymaga złożonych genomów, ale integruje wykrywanie genów antygenów z typowaniem sekwencji wielolokusowych rdzenia genomu (cgMLST), zapewniając kompleksową rozdzielczość dla badań w przypadku epidemii17. Chociaż charakterystyka Salmonelli oparta na WGS jest coraz częściej przyjmowana jako główny dowód w badaniach 16,18,19, jej zastosowanie w nadzorze na dużą skalę pozostaje ograniczone, co częściowo przypisuje się nierozwiązanym praktycznym czynnikom wpływającym na przydatność metody. Globalne badanie wykazało, że tylko 8% uczestniczących laboratoriów korzysta z WGS do rutynowej inwigilacji, a złożoność analityczna stanowi główną barierę20. Na przykład wiarygodne przewidywanie serotypów zależy od odpowiedniej głębokości sekwencjonowania (zazwyczaj >75× dla efektywności kosztowej, idealnie ~200× dla analizy wysokiej jakości) oraz wysokiej jakości zespołów genomowych (N50 kontigów > 30 kbp jako opłacalna minimalna wartość, najlepiej >100 kbp), szczególnie dla narzędzi zależnych od składania, takich jak SISTR 21,22,23 . Dodatkowo wybór narzędzi musi być zgodny z zasobami obliczeniowymi i wiedzą laboratoryjną: narzędzia open-source, takie jak SeqSero2S, oferują szybsze alternatywy dla szybkiego przesiewania poprzez analizę surowych odczytów i omijanie wymagających obliczeniowo montażu15, podczas gdy laboratoria o ograniczonych możliwościach bioinformatycznych mogą mieć trudności z analizą i przechowywaniem danych. W konsekwencji nie ma wystarczających danych, aby ustalić, czy testy serologiczne można ograniczyć w ramach szeroko zakrojonej inwigilacji20,24, co podkreśla potrzebę podejścia adaptacyjnego do zasobów. Warto zauważyć, że po pandemii COVID-19 istnieje znaczna ilość instrumentów sekwencjonowania i qPCR na różnych szczeblach placówek medycznych, co daje możliwość wykorzystania tej zdolności do nadzoru genomowego.

Aby wypełnić tę lukę, przeprowadziliśmy wieloośrodkową ocenę wyżej wymienionych narzędzi serotypowania genomowego, wykorzystując 315 izolatów Salmonelli pobranych z żywności i ludzi w południowo-zachodnich Chinach25,26. Na podstawie tych ustaleń opracowaliśmy zhierarchizowany workflow, który uwzględnia zróżnicowane zasoby laboratoryjne i potrzeby nadzoru, dostarczając jasne kryteria wyboru narzędzi w różnych kontekstach. Ramy te priorytetowo traktują SeqSero2S do szybkich badań przesiewowych oraz SISTR w połączeniu z cgMLST do badań epidemii, co ułatwia wdrażanie podejść genomowych i zmniejsza zależność od tradycyjnych metod serotypowania. Tutaj szczegółowo opisujemy każdy etap przepływu pracy, w tym identyfikację izolatów, sekwencjonowanie, analizę danych oraz kryteria wyboru narzędzi predykcyjnych w różnych kontekstach nadzoru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pobieranie i obsługa próbek kału z ludzi odbywała się za zgodą Komisji Etyki Czwartego Szpitala Zachodnich Chin Uniwersytetu Syczuan (numer protokołu: HXSY-EC-2022093), zgodnie z Deklaracją Helsińską i Dobrą Praktyką Kliniczną. Świadoma zgoda została zniesiona zgodnie z krajowymi przepisami zdrowia publicznego.

UWAGA: Wszystkie procedury związane z żywymi hodowlami Salmonelli i próbkami ludzkiego kału muszą być przeprowadzane w laboratorium Biosafety Level 2 (BSL-2) przez personel przeszkolony w zakresie standardowych praktyk mikrobiologicznych i procedur biobezpieczeństwa. Zawsze noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle ochronne. Dezynfekuj i regularnie wymieniaj zanieczyszczone rękawice. Zdekontaminuj wszystkie powierzchnie robocze przed i po eksperymentach odpowiednim środkiem dezynfekującym (np. 70% etanolu, 1% podchlorynu sodu). Przed utylizacją odczyszcz wszystkie odpady ciekłe i stałe zawierające materiały biologiczne poprzez autoklawowanie (np. w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut). Unikaj powstawania aerozoli i rozbryzgów. Wykonuj wszystkie procedury, które mogą powodować wytwarzanie aerozoli (np. wirowanie, intensywne wstrząsania) wewnątrz certyfikowanej szafy bezpieczeństwa biologicznego.

1. Pobieranie próbek żywności i identyfikacja szczepów

  1. Zbieraj próbki żywności z sklepów detalicznych lub zakładów przetwórczych. Izoluj salmonellę z próbek żywności zgodnie z krajowym standardem bezpieczeństwa żywności GB 4789.4 oraz protokołami poufności Programu Monitorowania Chorób Przenoszonych przez Żywność.
  2. Przedwzbogacenie:
    1. Waż dokładnie 25 g każdej próbki jedzenia. Do próbki dodaj 225 mL wody buforowanej Peptoneu (BPW) (współczynnik rozcieńczenia 1:10) i zachowuj wir przez 30 sekund, aby zapewnić pełną homogenizację i zanurzenie.
    2. Inkubuj próbkę w BPW w temperaturze 36°C ± 1°C przez 8-18 godzin w inkubatorze potrząsającym ustawionym na 150 obr./min.
      UWAGA: Wstępne wzbogacenie bulionu nieselektywnego znacząco zwiększa ładunek patogenów. Wszystkie późniejsze materiały (pojemniki, pipety itp.) traktuj jako wysoce zakaźne.
  3. Selektywne wzbogacanie: Po wstępnym wzbogaceniu przenosi się 1 mL próbki do bulionu tetrationowego (TTB). Inkubuj TTB w 42 °C przez 18-24 godziny bez potrząsania.
  4. Izolacja: Po inkubacji rozpraszać wzbogaconą hodowlę na następujące selektywne płytki agarowe: agar Hektoen enteric (HE), agar z deoksycholatem lizyny (XLD) oraz salmonella CHROMagar. Inkubuj płytki w temperaturze 36 °C przez 18-24 godziny.
    UWAGA: Podczas rozmazywania płyt należy uważać, aby nie tworzyć aerozoli i zanieczyszczenia krzyżowego. Na agarze HE domniemane kolonie Salmonelli zazwyczaj występują w odcieniach niebiesko-zielonych do niebieskich, z czarnymi środkami lub bez nich. Otaczający agar może przybierać podobny zielonkawy odcień. Na agarze XLD domniemane kolonie Salmonelli są zazwyczaj czerwone z czarnymi środkami. Na CHROMagarze domniemane kolonie Salmonelli charakteryzują się kolorem od magenty do mauve, zgodnie z zaleceniami producenta. Na każdej płytce selektywnej spodziewaj się dobrze izolowanych kolonii po 18-24 godzinach inkubacji. Przerośnięte płytki (>300 kolonii) mogą wymagać rozcieńczenia i ponownego rozpraszania.
  5. Identyfikacja: Zbadaj płytki pod kątem podejrzeń kolonii Salmonelli . Identyfikacja podejrzanych szczepów za pomocą automatycznego systemu identyfikacji za pomocą karty identyfikacyjnej Gram-ujemnej (GN), zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi analizy.
    UWAGA: Upewnij się, że numery partii kart GN są ważne i mieszczą się w dacie ważności.
    1. Przygotuj zawiesinę bakteryjną z czystej kolonii do określonej mętności (standard McFarlanda 0,50-0,63) przy użyciu roztworu soli fizjologicznej 0,45%.
    2. Załaduj zawieszenie na kartę GN i przeprowadź test. Upewnij się, że system jest ustawiony na automatyczną inkubację karty w temperaturze 35,0 °C ± 2,0 °C oraz monitoruj reakcje biochemiczne do 8 godzin.
    3. Akceptuj wynik Salmonella enterica ssp. enterica z prawdopodobieństwem ≥ 95% i doskonałą stopnią zaufania.
  6. Serotypowanie: Pobieranie pojedynczych kolonii z płyty agaru rojowego po inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C. Wykonanie testów aglutynacji preparatów w celu wykrycia antygenów O i H. Do testów używaj dostępnych komercyjnie zestawów przeciwserum przeciw Salmonelli (patrz Tabela materiałów).

2. Pobieranie próbek przez ludzi i identyfikacja szczepów

UWAGA: W przypadku izolacji Salmonelli z próbek kału u ludzi należy stosować się do protokołów poufności Programu Monitorowania Chorób Przenoszonych przez Żywność.

  1. Pobieranie: Zbieraj około 2 g świeżo opróżnionych próbek ludzkiego kału. Umieść próbki kału w czystych, suchych pojemnikach z szerokimi ustami. Przetransportuj próbki kału do laboratorium w ciągu 1 godziny, korzystając z izolowanych skrzynek transportowych, aby zachować integralność próbki.
    UWAGA: Próbki kału u ludzi mogą zawierać wiele patogenów poza salmonellą. Traktować wszystkie próbki jako potencjalnie zakaźne i przestrzegać standardowych środków ostrożności dotyczących obchodzenia się z materiałami niebezpiecznymi biologicznymi.
  2. Inokulacja: Zaszczepić pobrane próbki kału bezpośrednio na następujących selektywnych płytkach agarowych: CHROMagar Salmonella, Salmonella-XLD agar oraz Shigella (SS) agar.
    UWAGA: Należy odnieść się do kroku 1.4 dotyczącego charakterystycznej morfologii kolonii na agarze CHROMagar Salmonella i XLD. Na agarze SS domniemane kolonie Salmonelli zazwyczaj wyglądają bezbarwnie, nieprzezroczyste lub jasnobrązowe z czarnymi środkami. Sam agar pozostaje stosunkowo niezmieniony.
  3. Identyfikacja: Identyfikacja podejrzanych kolonii Salmonelli , jak opisano w kroku 1.5.
  4. Serotypowanie: Wykonaj serotypowanie przez aglutynację szkiełkową, jak opisano w kroku 1.6.

3. Przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie całego genomu

  1. Posiew bakteryjny: Salmonella na agarze LB, inkubacja w 37 °C przez 12 godzin. Zbierz kolonię, zaszczep w bulionie 200 mL LB i wstrząśnij z częstotliwością 150 obr./min (37 °C, 12 h). Wirówka w 12 000 × g przez 10 minut, aby pobrać komórki.
    UWAGA: Wszystkie etapy wirowania wykonuj z zamkniętymi wirnikami lub kubkami bezpieczeństwa, aby zapobiec powstawaniu aerozoli.
  2. Ekstrakcja DNA: Ekstrakcja DNA genomowego za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Odczynniki w komercyjnych zestawach do ekstrakcji DNA (np. lizy, proteinaza K) mogą być szkodliwe przy wdychaniu lub kontakcie ze skórą i oczami. Wykonaj wyciąg w okapu oparowym lub szafce zabezpieczeń biologicznych, jeśli używane są lotne odczynniki, i używaj odpowiedniej ochrony osobistej.
  3. Ocena jakości DNA: Oczyść DNA genomowego i ilościowo określić za pomocą fluorometru za pomocą zestawu dsDNA High-Sensitivity Astest Kit. Weryfikacja integralności DNA za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym o stężeniu 1% pod napięciem 100 V przez 45 minut; Wysokiej jakości DNA pojawia się jako pojedynczy, zwarty pas >20 kbp z minimalnym rozmazywaniem27.
    UWAGA: (Krytyczny krok) Wysokiej jakości, wysokomolekularne DNA genomowe (z stosunkiem A260/A280 ~1,8-2,0) jest kluczowe dla skutecznego przygotowania i sekwencjonowania biblioteki.
    UWAGA: Barwniki kwasowe nukleinowe stosowane w elektroforezie żelu agarozowego (np. GelRed, bromek etydu) są mutagenne. Zawsze noszę rękawiczki podczas obsługi żeli i roztworów do zabarwiania oraz utylizuj je zgodnie z przepisami dotyczącymi niebezpiecznych odpadów instytucjonalnych.
  4. Fragmentacja DNA: Fragmentacja około 150 ng kwalifikowanego DNA genomowego do średniego rozmiaru ~350 bp za pomocą systemu ultrasonacji skupionej zgodnie z protokołem producenta.
  5. Zbuduj bibliotekę sekwencjonowania z przeciętych fragmentów DNA, korzystając z komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki (patrz Tabela materiałów). Wykonaj naprawę końcową i fosforylację 5'-przeciętych fragmentów DNA. Następnie dodaj pojedynczą bazę 'A' na końcach 3' i zliżuj adaptery sekwencyjne indeksowane.
  6. Wzmacniaj i wzbogacaj fragmenty DNA powiązane z adapterem za pomocą programu PCR o ograniczonym cyklu, zgodnie z określeniem w zestawie.
  7. Kwalifikuj i ilościowo określ ostateczną bibliotekę za pomocą metod takich jak fluorometria i elektroforeza kapilarna.
  8. Wykonaj sekwencjonowanie parowe (2 × 150 bp) na platformie sekwencjonującej, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.

4. Analiza danych

  1. Kontrola jakości surowych danych sekwencjonowania: Wykonaj początkową kontrolę jakości surowych plików FASTQ za pomocą fastp (wersja 0.23.0) z domyślnymi parametrami. Celem jest usunięcie sekwencji adapterów i odczytów niskiej jakości, co generuje czyste dane FASTQ do dalszej analizy.
  2. Złóż wysokiej jakości, filtrowane odczyty w szkice genomów za pomocą SPAdes (wersja 3.15.0) z ostrożną opcją redukcji niezgodności i krótkich indelów26.
  3. Wykorzystaj sekwencje genomu (pliki FASTQ / FASTA) jako dane wejściowe do przewidywania różnych serotypów.
    1. Dla MLST zaimportuj plik FASTQ do oprogramowania BioNumerics (wersja 7.6).
      1. W oknie Import Template kliknij Edytuj parsowanie w opcjach zaawansowanych. Ustaw ciąg parsowania danych i dekorację danych na [DATA]. Do parsowania nazw plików należy zastosować wyrażenia regularne DATA]_* i [DATA]. Zapisz szablon, zaznacz go i kliknij Następny , a następnie Zakończ. Potwierdź przesłanie w oknie Submit Task , aby przesłać dane. Narzędzie CEStoreUploader automatycznie się otworzy, aby przesłać surowe dane WGS do silnika obliczeniowego.
      2. Wybierz wpis genomu po przesłaniu. Przejdź do WGS Tools i wybierz "TraNetGenotype", aby automatycznie przewidywać ST. W oknie dialogowym TraNetGenotype wybierz Salmonella jako typ szczepu, wybierz Analizę Serotypów, Analizę Wirulencji oraz Analizę Wrażliwości Przeciwdrobnoustrojów, i kliknij Tak.
    2. Dla SISTR (wersja 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parametry: wszystkie parametry są domyślne), otwiera terminal i przechodzi do katalogu zawierającego złożony plik genomu assembly.fasta.
      1. Wykonaj następujące polecenie, aby wykonać przewidywanie serowary i wygenerować kompleksowy raport w formacie CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. To polecenie generuje raport zawierający przewidywaną wartość serowara.
        UWAGA: -qc: Przeprowadza kontrole jakości zespołu. -i assembly.fasta: Określa wejściowy plik FASTA. -f csv: Definiuje format wyjściowy jako CSV. -o sistr_results: Ustala bazową nazwę pliku wyjściowego (np. sistr_results.csv). -p 4: Wykorzystuje 4 wątki CPU do analizy, aby przyspieszyć obliczenia. --alleles-output: zapisuje sekwencje alleli i informacje do pliku JSON. --cgmlst-profiles: eksportuje profile allel cgMLST do pliku CSV.
    3. Dla SeqSero (wersja 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parametry: wszystkie parametry są domyślne), przejdź do katalogu zawierającego plik danych wejściowych. Wykonaj następujące polecenie z domyślnymi parametrami analizy: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. Narzędzie tworzy katalog wyjściowy zawierający plik Seqsero_result.txt z przewidywanym serotypem.
      UWAGA: -m 4 określa typ wejściowy jako skład genomu. -i definiuje plik wejściowy FASTA.
    4. Dla SeqSero2 (wersja 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parametry: wszystkie parametry są domyślne). Wykonaj następujące polecenie: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Narzędzie wysyła przewidywany serotyp bezpośrednio na ekran terminala po ukończeniu. Wyniki dostarczają przewidywanego serotypu.
      UWAGA: -m k: określa workflow oparty na k-merach do szybkiego przewidywania serotypów z wykorzystaniem unikalnych k-merów determinantów serotypu. -t 4: oznacza typ wejściowy jako złożone sekwencje.
    5. Dla SeqSero2S (wersja 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parametry: wszystkie parametry są domyślne): Uruchom go za pomocą dostarczonego skryptu: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Wyniki dostarczają przewidywanego serotypu.
      UWAGA: -m k umożliwia analizę surowych odczytów lub zespołów genomu opartą na k-mer. -t 4 określa wejście sekwencji złożonej na zewnątrz.

5. Kluczowe parametry i kwestie praktyczne

UWAGA: Poniższe kwestie są kluczowe dla pomyślnej implementacji tego genomowego przepływu pracy, zwłaszcza w warunkach o ograniczonych zasobach.

  1. Sprawdź, czy surowe dane sekwencjonowania zapewniają wystarczającą głębię pokrycia. Głębokość sekwencjonowania około 100x jest zazwyczaj wystarczająca do wysokiej jakości analizy.
    UWAGA: Dla laboratoriów stawiających na efektywność kosztową zaleca się minimalną głębokość sekwencjonowania 75x jako praktyczny niższy próg wiarygodnego przewidywania serotypów za pomocą MLST lub SeqSero221.
  2. Potwierdź, że jakość surowych odczytów jest wysoka, z wynikiem Q30 (bazowa dokładność wywołań 99,9%), zazwyczaj powyżej 90%.
  3. Oceń jakość złożenia genomu de novo przed przystąpieniem do narzędzi predykcyjnych serotypów wymagających złożonych kontigów. Użyj statystyki N50 jako kluczowej metryki.
    UWAGA: Zalecane jest N50 co najmniej 100 kbp22, natomiast N50 powyżej 30 kbp powinno być traktowane jako minimalny wymóg do wiarygodnej analizy23.
  4. Sprawdzaj kompletność zestawu, zapewniając współczynnik odtworzenia co najmniej ≥98% podczas mapowania filtrowanych odczytów z powrotem na złożony genom.

6. Zalecany protokół przewidywania serotypów do monitorowania wysokoprzepustowego wykrywania salmonelli

UWAGA: Wybieraj metody przewidywania serotypów na podstawie kontekstu nadzoru, wymaganej dokładności oraz dostępnych zasobów laboratoryjnych. W przypadku wysokoprzepustowego nadzoru nad Salmonellą stosuj się do poniższego protokołu:

  1. Wstępna identyfikacja: Przeprowadzić wstępne badania przesiewowe zgodnie z GB 4789.4, aby potwierdzić izolatów jako Salmonella spp.
    UWAGA: Na tym etapie nie ma potrzeby identyfikowania konkretnego serotypu izolatów.
  2. Rutynowy nadzór (tryb wysokiej przepustowości): Do rutynowego nadzoru, ponieważ BioNumerics nie jest już aktualizowany, korzystaj z otwartoźródłowych MLST28, SeqSero2S lub innych zweryfikowanych, przyjaznych dla użytkownika platform do analizy genomowej, które otrzymują stałe wsparcie techniczne i aktualizacje.
    UWAGA: Dla MLST: Schemat 7-genowy oferuje standaryzowany, przenośny i filogenetycznie informacyjny profil (Typ sekwencji, ST), który jest idealny do długoterminowej epidemiologii i globalnego porównywania szczepów. Jej prostota zapewnia szybką analizę i minimalne obciążenie obliczeniowe. Dla SeqSero2S: Zapewnia podwójną przewagę: szybkie przewidywanie serotypów oraz zintegrowane wyniki MLST w jednym przebiegu. Może analizować surowe odczyty sekwencjonowania bezpośrednio, omijając składanie genomu, oszczędzając czas i zasoby. Nawet przy zebranych danych FASTA jest szybszy niż narzędzia takie jak SISTR, ponieważ wykonuje przewidywanie serotypów niezależnie, bez polegania na analizie obliczeniowej.
  3. Szybkie przesiewowe badania (ustawienia ograniczone czasowo): Dla szybkich wyników lub w laboratoriach o ograniczonej mocy obliczeniowej używaj SeqSero2S do wstępnej prognozy serotypu.
    UWAGA: Podczas przeprowadzania prognoz SeqSero2S zaleca się zasadniczo interpretację "I_4,[5],12:i:-" jako Salmonella Typhimurium.
  4. Badanie epidemii (tryb wysokiej dokładności): Do śledzenia ognisk wymagających wysokiej rozdzielczości stosuj SISTR, który wykorzystuje cgMLST do uzupełniania predykcji serotypów oraz do wysokiej rozdzielczości analizy klastrowej do lokalizacji źródeł.
  5. Kontrola jakości i niespójne potwierdzenie wyników:
    1. Dla typowych odkształceni typów sekwencjonowania należy wykonać losową weryfikację. Dla tych niepospolitych stosuj współczynnik weryfikacji na poziomie 20%. W przypadku niespójnych wyników serotypowania należy skierować izolaty do laboratorium wyższego szczebla lub referencyjnego w celu uzyskania ostatecznego wyniku.
    2. Do analizy potwierdzającej należy stosować wiele zweryfikowanych metod, w tym: powtarzaną analizę genomową z co najmniej dwoma różnymi narzędziami predykcji in silico ; powtarzane in silico przewidywanie z co najmniej dwoma różnymi narzędziami; filogenetyczna kontekstualizacja z wykorzystaniem metod opartych na WGS o wysokiej rozdzielczości (np. cgMLST lub analiza SNP całego genomu)29.
    3. Przypisz ostateczny serotyp na podstawie konsensusu z tego kompleksowego dowodu.
      UWAGA: Zalecany wskaźnik weryfikacji 20% dla serotypów nietypowych opiera się na obserwacji, że narzędzia genomowe utrzymują wysoką zgodność (93,3% dla SISTR vs. MLST, 95,0% dla SISTR vs. SeqSero2S) nawet wśród serotypów niewspólnych (Tabela 1). Ten próg jest opłacalny i zapewnia wystarczający margines bezpieczeństwa, aby wykryć niską częstotliwość rozbieżności między narzędziami genomowymi w rutynowej inwigilacji.

7. Analiza statystyczna

  1. Analizę danych wykonuj za pomocą oprogramowania R (wersja 4.1.2).
  2. Przedstawiamy zmienne kategoryczne jako częstotliwości z procentami.
  3. Porównaj grupy używające testów χ2 dla danych kategorycznych30, rozważ wartość P <0,05 jako statystycznie istotną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół został zweryfikowany przy użyciu 315 izolatów Salmonelli z południowo-zachodnich Chin, z czego 213 izolatów (2/3) służyło jako zestaw treningowy do porównania pięciu metod predykcyjnych serotypów opartych na WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 i SeqSero2S) z konwencjonalnymi wynikami serotypowania, natomiast pozostałe 102 izolatów (1/3) posłużyły jako zestaw walidacyjny do oceny wydajności MLST, SISTR i SeqSero2S.

Analiza zbiorów treningowych (n = 213)
...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ta szeroko zakrojona ocena, obejmująca 315 izolatów Salmonelli z południowo-zachodnich Chin, wykazuje lepszą powtarzalność metod serotypowania opartych na WGS w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami (84,1% vs. 62,9% pokrycia, P<0,001). Nasze wyniki potwierdzają kompleksowy przepływ pracy genomowej, gdzie kluczowe początkowe kroki przygotowania próbki i kontroli jakości DNA (sekcje 1-3) bezpośrednio wpływają na niezawodność dalszych etapów. Protokół kładzie nacisk na wysokiej jakości zespoły genomu (najlepiej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Prace te były wspierane grantami z Biura Nauki i Technologii Tybetu i Syczuanu (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 dla H.Z. oraz 2024NSFSC0033 dla X.P.), Programem Nauki i Technologii Syczuan (2024JDRC0032 do Y.X.), Projektem Instytutu Nowej Produktywności Zdrowia (HN240302C do H.Z.), Projektem Ożywienia Dyscyplin Nauk Laboratoryjnych Zdrowia Publicznego (2023SY-04 do H.Z.). Zachodniochińska Szkoła Zdrowia Publicznego/Zachodniochiński Czwarty Szpital, Uniwersytet Syczuan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioNumerics (wersja 7.6)Matematyka stosowanahttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/przewidywanie serotypów/analiza filogenetyczna
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson and Company214983Selektywne pożywki chromogeniczne Salmonella
Fastp (wersja 0.23.0)Open-sourcehttps://github.com/OpenGene/fastpKontrola jakości odczytu
System sekwencjonowania Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Platforma sekwencjonowania całego genomu
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295Strzynanie DNA
Magbeads Fast DNA Kit do glebyMP BiomedicalsMP116560200Zestaw do ekstrakcji DNA genomowej
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Zarządzanie danymi
Szybki zestaw DNA-Seq NEXTFLEXRevvity50-255-1124Przygotowanie biblioteki sekwencyjnej
Qubit 2.0 FluorometrThermo Fisher ScientificQ32866Ilościowa ilościowość DNA
Zestaw do testów Qubit dsDNA o wysokiej czułościThermo Fisher ScientificQ32851Ilościowa ilościowość DNA
R (wersja 4.1.2)Fundacja Rhttps://www.r-project.org/Obliczenia statystyczne
Zestaw przeciw sąrycy na salmonellęStatens Serum Institute60898Detekcja antygenów O/H
SeqSeroOpen-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSeroPrzewidywanie serotypów
SeqSero2Open-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2Przewidywanie serotypów
SeqSero2SOpen-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2sPrzewidywanie serotypów
SISTROpen-sourcehttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdPrzewidywanie serotypów
SPAdes (wersja 3.15.0)Open-sourcehttps://github.com/ablab/spadesSkładanie genomu
Swarm AgarBD Biosciences211519Wykorzystywane do serotypowania i inkubacji
Fluorometr TBS-380Turner BioSystemsP/N 3800-003Ilościowa ilościowość DNA
VITEK 2 Compact SystemBioMé rieux95061-768Zautomatyzowany system identyfikacji mikroorganizmów

Bibliografia

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Genomowe serotypowaniewielomiejscowe typowanie sekwencyjnesekwencjonowanie ca ego genomunadz r nad zdrowiem publicznymbadanie ognisk epidemicznychcgMLSTzgodno serotyp w

Powiązane artykuły