Efektywna produkcja limfocytów T receptorów antygenowych chimerycznych (CAR) z transgenami przekraczającymi 10 kb przy użyciu wektorów lentiwirusowych

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany sposób produkcji limfocytów T receptorów antygenów chimerycznych (CAR) z dużymi transgenami przekraczającymi 10 kb przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Streszczenie

Inżynieria wielu receptorów w komórki T receptorów chimerycznych antygenowych (CAR) ujawniła się jako potężna strategia zapobiegania nawrotom antygen-ujemnym oraz redukcji toksyczności na cel i poza nim. Jednak produkcja wieloreceptorowych komórek CAR T pozostaje wyzwaniem, ponieważ zwiększanie rozmiarów transgenów lentiwirusowych znacząco zmniejsza liczbę miarz wirusowych i tempo transdukcji limfocytów T. Obecne procesy produkcyjne często opierają się na sortowaniu komórek w celu wzbogacenia transdukowanych limfocytów T z produkcji o niskiej wydajności. Jednak techniki sortowania komórek nie zwiększają bezwzględnej liczby komórek CAR T i nie dodają dodatkowej złożoności już i tak skomplikowanego procesu produkcji. W konsekwencji te ograniczenia utrudniają kliniczne tłumaczenie wieloreceptorowych komórek CAR T i ograniczają rozwój immunoterapii nowej generacji.

Przedstawiamy tutaj szczegółowy, krok po kroku proces produkcji zoptymalizowany do generowania komórek CAR T z dużymi transgenami lentiwirusowymi. Korzystając z tego workflow, wykazujemy wzrost efektywności transdukcji zależny od wielkości w różnych rozmiarach transgenów, z najbardziej wyraźnym wzrostem sięgającym nawet 14,8 razy dla wektora lentiwirusowego o masie 10,1 kb. Co ważne, workflow wspiera solidne rozszerzanie komórek T i eliminuje potrzebę sortowania komórek. Przezwyciężając obecne ograniczenia wielkości transferu genów lentiwirusowych, ten proces umożliwia efektywną produkcję wieloreceptorowych komórek CAR T, co ułatwia rozwój zaawansowanych immunoterapii.

Wprowadzenie

Limfocyty T receptorów antygenowych chimerycznych (CAR) zrewolucjonizowały dziedzinę immunoterapii. Jednak pomimo niezwykłych sukcesów, pozostają kluczowe wyzwania, w tym immunosupresja pośredniczona przez mikrośrodowisko nowotworowe (TME), nawroty guzów antygen-ujemnych oraz toksyczność na cel i poza guzem ^1,2. Inżynieria komórek CAR T z wieloma syntetycznymi receptorami, takimi jak podwójne CAR, połączone konstrukty CAR i TCR czy receptory przełączników cytokinowych, ma potencjał do pokonania tych przeszkód ^3,4. W nowotworach krwi wyposażenie efektorowych limfocytów T w podwójne CAR pozwala na jednoczesne celowanie w dwa różne antygeny, takie jak CD19 i CD205^{, co zmniejsza} ryzyko ucieczki antygenów nowotworowych. W guzach litych toksyczność na i poza guzem można złagodzić poprzez włączenie np. syntetycznych obwodów receptorowych Notch (synNotch), które umożliwiają logiczne sterowane ekspresję CAR i zwiększają celowość 6,7,8,9,10,11,12,13 . Jednak produkcja komórek CAR T przenoszących wiele receptorów pozostaje trudna ze względu na wzrost rozmiaru transgenu. Samoinaktywujące się wektory lentiwirusowe trzeciej generacji pochodzące z wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV) typu 1 są obecnie złotym standardem produkcji komórek CAR T na skali^{badawczej i klinicznej 14}. Aby generować komórki CAR T, wektory lentiwirusowe są projektowane z dostosowanymi kasetami ekspresji CAR, otoczonymi długimi sekwencjami powtórek końcowych (LTR), które pośredniczą w integracji z genomem limfocytu T. Maksymalna efektywna pojemność pakowania (EPC) obecnych wektorów lentiwirusowych wynosi około 9,2 kilobaz (kb) LTR-do-LTR, co odpowiada natywnemu rozmiarowi genomu HIV-1. W miarę jak miana lentiwirusowego spadają półlogarytmicznie wraz ze wzrostem długości^{wektora 15}, inżynieria dużych transgenów z wieloma receptorami drastycznie zmniejsza wydajność produkcji lentiwirusów i ostatecznie utrudnia produkcję komórek CAR T¹⁶. Chociaż techniki sortowania komórek, takie jak sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie lub fluorescencyjnym (odpowiednio MACS lub FACS), mogą być stosowane do wzbogacania komórek CAR T z produkcji o niskiej wydajności, metody te nie zwiększają bezwzględnej liczby komórek CAR T i nie dodają dodatkowej złożoności już i tak skomplikowanemu procesowi produkcyjnemu. W rezultacie wyzwania produkcyjne komórek CAR T z dużymi transgenami lentiwirusowymi pozostają poważną barierą zarówno dla badań przedklinicznych, jak i zastosowań klinicznych.

Niedawno ustanowiliśmy proces produkcji komórek T CAR zoptymalizowany dla efektorowych komórek T przenoszących duże transgeny lentiwirusowe, takich jak system synNotch (svsNotch)¹⁷ z pojedynczym wektorem. Tutaj szczegółowo opisujemy metodologię w krok-po-kroku protokole, aby ułatwić jej szerokie wdrożenie. Jako dowód koncepcji demonstrujemy zależne od wielkości poprawy efektywności transdukcji w transgenach lentiwirusowych o rozmiarach od 5,7 kb do 9,2 kb i 10,1 kb. Ogólnie rzecz biorąc, ten zoptymalizowany workflow zwiększa szybkość transdukcji nawet do 14,8-krotnie, eliminując potrzebę sortowania komórek i umożliwiając efektywne generowanie efektorowych limfocytów T o rozmiarze transgenu przekraczającym 10 kb.

Protokół

Limfocyty T pozyskano przez Human Immunology Core Uniwersytetu Pensylwanii, który działa zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej z ustalonymi standardowymi procedurami operacyjnymi i/lub protokołami przyjmowania, przetwarzania, zamrażania i analizy próbek, zgodne z wytycznymi etyki MIATA i Uniwersytetu Pensylwanii.

UWAGA: Schematyczny przegląd zoptymalizowanego przepływu pracy dla produkcji komórek lentiwirusa i CAR T przedstawiono na Rysunku 1. Porównanie kluczowych kroków optymalizacji z obecnym standardowym przepływem pracy podsumowano w Tabeli 1. Wszystkie hodowle komórkowe utrzymywano w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ przy użyciu pożywki T-komórkowej (TCM) składającej się z RPMI-1640 uzupełnionego o 10% termicznie inaktywowane surowicę płodową bydła (FBS), 10 mM buforu HEPES, 2 mM L-alanylu-L-glutaminy (patrz Tabela materiałów), 100 U/mL penicyliny oraz 100 U/mL streptomycyny.

Rysunek 1: Zoptymalizowany przepływ pracy dla produkcji leniwirusów i komórek T CAR przy dużych transgenach. Schematyczne przedstawienie produkcji lentiwirusów (góra) i generacji komórek CAR T (na dole), podkreślające kluczowe kroki i optymalizacje zwiększające miary wirusa oraz efektywność transdukcji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

		Standardowy workflow	Zoptymalizowany przepływ pracy
Wirus	Otoczka wirusowa	VSV-G	Cocal-G
	Transfekcja	L2000	L30001
	Żniw LV	24 h2 + 48 h2	30-36 h3
Limfocyt T	Jednostka	Kolba T25	Płytka dna z 96 dołkami
	Stosunek powierzchni do objętości	Zmienna	5,12 cm2/mL4
	Adiuwant	Brak	SF1085
1 3μL L3000 na 1 μg DNA, bez zmiany medium
2wirowania o pojemności 106 800 x g przez 2,5 h, rurka z okrągłym dnem
3wirowania przy 12 300 x g przez noc, stożkowa rurka dolna
4dodatkowe suplementy po transdukcji
555 μg/mL

Tabela 1: Porównanie standardowych i zoptymalizowanych przepływów pracy. Kluczowe optymalizacje ulepszonego przepływu pracy w porównaniu do obecnego standardowego workflow. Ta tabela została zaadaptowana za zgodą Rommla i ^in.17.

1. Produkcja lentiwirusa

1. Utrzymanie komórek HEK293T
   1. Upewnij się, że HEK293T komórki są równomiernie rozłożone, wolne od grudek i przy łączności 50-70% (typowa wydajność: 1,0-1,5 × 10^{7 komórek} na kolbę T150).
   2. Aspiruj supernatant, dodaj 20 mL PBS w temperaturze pokojowej (RT) na górną stronę kolby, aby nie wypchnąć komórek, delikatnie mieszaj PBS nad komórkami i aspiruj płukanie.
   3. Dodaj 3 mL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 15-30 sekund w RT, przechylając kolbę na boki. Monitoruj odłączenie cel.
   4. Dodaj 7 mL zimnego TCM, ponownie umieść ogniwa przy dnie kolby, aby wygenerować zawiesinę pojedynczą, i przenieś do probówki 50 mL. Umyj kolbę 10-20 ml zimnego TCM i dodaj przepłukanie do tej samej tubki.
   5. Wiruj komórki (300 × g, 5 min, 4 °C), aspiruj supernatant, ponownie zawiesij w 10 mL TCM i licz komórki.
   6. Nakładaj HEK293T komórek w kolbach T150 po 3 × 10^{6 komórek} w kolbie do przepuszczania co 2 dni (np. w poniedziałek i środę) lub 1 × 10^{6 komórek} w kolbie do przepuszczania co 3 dni (np. podkładanie w piątek w weekend) przy użyciu 30 ml TCM podgrzanego do 37 °C.
2. Transfekcja komórek HEK293T w celu produkcji lentiwirusa
   UWAGA: Przeprowadź mały eksperyment pilotażowy, aby określić gęstość siewu, która po 2 dniach konsekwentnie daje 70-80% konfluencji. Upewnij się, że konfluencja HEK293T komórek nie przekracza 80% w momencie transfekcji (patrz Dyskusja). Transfekcja została zoptymalizowana przy użyciu minimalnego medium esencyjnego o obniżonej surowicy oraz komercyjnych odczynników lipofekcyjnych (L3000 i P3000, patrz Tabela materiałów).
   1. Pobieranie HEK293T komórek poprzez trypsynizację, jak opisano powyżej, i podawanie 4 × 10^{6 komórek} na kolbę T150 z 30 ml TCM podgrzanego do 37 °C.
   2. Po 2 dniach potwierdzić, że hodowle są równomiernie rozłożone i 70-80% się pokrywają.
   3. Podgrzej 50 ml minimalnego niezbędnego medium o obniżonej surowicy do RT. Rozmroz plazmidy lentiwirusowe, delikatnie wymieszaj i szybko zakręć. Impulsowe odczynniki wirujące do lipofekcji, szybkie obracanie i zostawianie w RT.
   4. Przygotuj mieszanki DNA. Dla każdej kolby połącz w następującej kolejności: 2 mL minimalnego medium esencyjnego o obniżonej surowicy, 39 μg plazmidów opakujących lentiwirus (18 μg pTRP Gag-Pol, 18 μg pTRP RSV-Rev, 3 μg pTRP Cocal-G), 15 μg plazmidu transferowego oraz 108 μL odczynnika P3000 (2 μL P3000/μg DNA). Zwiększ skalę według potrzeb i zwiększaj końcowe ilości co najmniej o 10%, aby uwzględnić straty pipetowania. Puls vortex, szybkie obracanie i przechowywanie w RT.
   5. Przygotuj miksy masterowe L3000. Dla każdej kolby połącz w następującej kolejności: 1,84 mL minimalnego pożywka esencyjnego o obniżonej surowicy i 162 μL L3000 (3 μL DNA L3000/μg). Zwiększ skalę według potrzeb i zwiększaj końcowe ilości co najmniej o 10%, aby uwzględnić straty pipetowania. Wir pulsacyjny, szybki obrót i inkubacja w RT przez 5 minut.
   6. Po 5 minutach dodaj 2 mL mieszanki głównej L3000 na kolbę do odpowiedniego miksu DNA, aby uzyskać rozcieńczenie w przybliżeniu 1:2. Powoli dodawaj mieszankę L3000, zaczynając od dołu rurki, nie dotykając jej boków. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 15 minut w RT.
   7. Tymczasem ostrożnie usuń 6 ml supernatantu z każdej HEK293T hodowli i oznacz każdą kolbę.
   8. Po 15 minutach transfekcuj każdą hodowlę, przechylając kolbę ku górze i powoli wypuszczając 4 mL mieszanki transfekcyjnej do supernatantu po górnej stronie kolby, aby zapobiec wypchnięciu komórek. Powoli pipetuj w górę/w dół dwa razy, cofnij kolbę do pierwotnej pozycji, delikatnie zakręć, włóż z powrotem do inkubatora i zapisz czas.
      UWAGA: Pozostawić hodowle niezakłócone do zbioru lentiwirusa. W przeciwieństwie do zaleceń producenta, aby po transfekcji¹⁸ zastąpić HEK293T supernatant zawierający mieszankę transfekcyjną L3000 świeżym podłożem hodowlowym, pominięcie tego kroku zachowuje wyższe miany lentywirusowe¹⁷.
3. Zbieranie, koncentracja i zamrażanie supernatantów lentiwirusowych
   UWAGA: Utrzymuj supernatanty lentiwirusowe na lodzie lub w temperaturze 4 °C podczas wszystkich etapów przetwarzania, aby zapobiec degradacji.
   UWAGA: Wektory lentiwirusowe są klasyfikowane jako materiały zakaźne. Należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa biologicznego, w tym stosowanie środków ochrony osobistej (np. podwójne rękawiczki, jednorazowe fartuchy laboratoryjne). Wszystkie powierzchnie robocze odczyść 10% wybielaczem, a następnie 70% etanolem. Dezynfekować skażone materiały zużywalne i ciekłe odpady 10% wybielaczem przed utylizacją jako odpady biologicznie niebezpieczne, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego bezpieczeństwa biologicznego.
   1. Umyj sprzęt do ultrawirówek (wiadra, stożkowe rurki i stożkowe adaptery) za pomocą 10% wybielacza, a następnie przepłukaj wodą. Krótko suszę na powietrzu, następnie spryskuję 70% etanolem i suszę na powietrzu pod kapturem do hodowli tkanek.
   2. Wstępnie schładz ultrawirówkę z włożonym wirnikiem do 4 °C.
   3. Pobieraj supernatanty lentiwirusowe 30-36 godzin po transfekcji, przelewając je do probówek po 50 mL. Oczyszczaj supernatanty przez wirowanie (500 × g, 5 minut, 4 °C), filtruj przez filtr porowy o pojemności 0,45 μm i przechowuj na lodzie.
   4. Włóż stożkowe adaptery do wiader, przelej filtrowane supernatanty do stożkowych rurek ultrawirówek i załaduj je do wiader. Zrównoważ przeciwległe łyżki zimnym TCM, zapewniając, że różnice masowe są poniżej 0,1 g.
   5. Skoncentruj supernatanty przez ultrawirowanie w 12 300 × g przez noc w 4 °C.
   6. Następnego ranka ostrożnie wyjmij wiadra i przechowaj je na lodzie.
   7. Przygotuj pudełko z suchym lodem do zamrażania i oznaczonymi kriovialami do alicytacji.
   8. Pod kapturem do hodowli tkanek otwórz każde wiadro i wyjmij rurkę ultrawirówki z wnętrza za pomocą kleszczy. Dla każdej lampy postępujemy następująco:
   9. Ostrożnie zasysaj supernatant do odległości 0,5 cala od dna rurki i przelej pozostałą ciecz do płytki 6-dołkowej. Delikatnie stuknij w rurkę, aby usunąć trochę resztek płynu.
   10. Dodaj 300 μL zimnego TCM, delikatnie zawiesz przez 30 sekund i przenieś zawiesinę do kriovialu.
   11. Przemyj tubkę 200 μL zimnego TCM i dodaj przepłukanie do tego samego krioviala.
   12. Delikatnie wymieszaj i alikwotuj 60 μL do dawkowania titerowania lentiwirusów (patrz krok 1.4), kilka alikwotów po 100 μL do produkcji komórek CAR T oraz jedną dodatkową probówkę z pozostałą objętością. Natychmiast zamroz aliquoty na suchym lodzie. Przenieś aliquoty do -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.
4. Titrowanie skoncentrowanego lentiwirusa przy użyciu pierwotnych limfocytów T
   UWAGA: Potrzebne jest około 1 × 10 5 komórek T na rozcieńczenie na lentiwirus. Na przykład sześć lentiwirusów z ośmioma rozcieńczeniami każdy wymaga: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10 komórek⁶ T. Dodatkowe komórki powinny być przygotowane, aby uwzględnić utratę pipetowania. Limfocyty T są stymulowane za pomocą kulek aktywacji magnetycznej pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 (patrz Tabela materiałów).
   1. Aktywacja limfocytów T (dzień 0)
      1. Warunkiem wstępnym: Utrzymuj oczyszczone ludzkie limfocyty CD4⁺ i CD8⁺ w TCM gotowe.
      2. Policz limfocyty T CD4⁺ i CD8⁺ i łącz je w proporcji 1:1.
      3. Przemyj kulki aktywacyjne w następujący sposób: Dodaj 1 mL TCM do rurki, ponownie zawiesij kulki przez wirowanie i przelej wymaganą ilość, aby uzyskać stosunek 3 do 1 między kulkami a komórkami T. Umieść rurkę w magnetycznym stojaku i pozwól, by kulki utworzyły osadę wzdłuż ścianki rurki. Po 30 sekundach ostrożnie zasysaj supernatant, wyjmij rurkę z podstawki magnetycznej i ponownie zawiesz kulki w 1 mL TCM. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
      4. Dodaj kulki aktywacyjne do limfocytów T i dostosuj końcowe stężenie do 1× 10^{6 komórek} /mL z TCM podgrzanym do 37 °C.
      5. Dobrze wymieszaj i przelej zawiesinę do zbiornika odczynnikowego. Komórki płytowe w płytkach płaskich z 96 dołkami z 100 μL TCM na otwór za pomocą pipety wielokanałowej. Dokładnie mieszaj co 1-2 minuty, aby zapobiec osiadaniu koralików.
   2. Transdukcja limfocytów T (dzień 1)
      UWAGA: Dla lentiwirusów z dużymi transgenami (np. 9 kb LTR-do-LTR) przygotuj 6 warunków przy użyciu rozcieńczeń seryjnych 1:2 (nierozcieńczone, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Dla lentiwirusów o mniejszych transgenach (np. 7 kb LTR-do-LTR) wymagane są 8 warunków z rozcieńczeniami seryjnymi 1:4. Używaj pozostałych studni jako kontrolek nietransducowanych (UTD).
      1. Rozmroz 60 μL każdego skoncentrowanego lentiwirusa w RT i przechowuj w lodzie.
      2. Przygotuj serię rozcieńczania na 96-dołkowej płycie z okrągłym dnem: Dodaj 60 μL lentiwirusa do górnego rzędu, dodaj 30 μL zimnego TCM do każdego wiersza poniżej, przelej 30 μL z góry do drugiego rzędu i wymieszaj (rozcieńczenie 1:2), przelej 30 μL z drugiego do trzeciego rzędu i wymieszaj (rozcieńczenie 1:4). Kontynuuj, aż przygotuje się łącznie sześć warunków (nierozcieńczone, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Użyj natychmiast do transdukcji.
      3. Między 23 a 26 godzinami po stymulacji kulek transdukuj limfocyty T z 25 μL lentiwirusa na jamkę z płytki rozcieńczającej za pomocą pipety wielokanałowej. Dodaj 25 μL TCM do studni sterujących UTD.
   3. Karmienie limfocytami T (dzień 3)
      1. Delikatnie dodaj 125 μL TCM podgrzanego do 37 °C do każdego otworu za pomocą pipety wielokanałowej.
   4. Usuwanie komórek T i analiza cytometrii przepływowej (dzień 5)
      1. Przygotuj trzy zestawy 1,5 mL rurek z nakręcaną kapslą dla każdego stanu i zdejmij pokrywki. Umieść dwa z trzech zestawów w magnetycznym stojaku.
      2. Ponownie zawiesz każdą jamkę i przenieś komórki do pierwszego zestawu rurek, aby kulki mogły utworzyć pelet wzdłuż ścianki rurki. Po 30 sekundach ostrożnie przenieś supernatanty do drugiego zestawu rur. Odczekaj 30 sekund (kulki powinny być już niewidoczne), potem przelej supernatanty do trzeciego zestawu probówek i przechowuj w lodzie.
      3. Barwi komórki T dla odpowiedniego markera transdukcji (np. synNotch anty-CD19 CAR lub anty-HER2) za pomocą przeciwciał (patrz Tabela materiałów) i analizuje ekspresję markerów za pomocą cytometrii przepływowej.
      4. Zidentyfikuj warunki z szybkością transdukcji poniżej 30%, odpowiadającą mniej więcej liniowemu zakresowi między objętością wirusa a tempem transindukcji.
      5. Oblicz miano lentiwirusowe według następującego wzoru:
         Miano (TU/mL) = (początkowa liczba limfocytów T x procent komórek przekształconych x czynnik rozcieńczający)/objętość wirusa (mL)
         np. ekspresja CAR 20% z rozcieńczeniem zapasów lentiwirusowych 1:32:
         (100 000 komórek x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. Produkcja ogniw T CAR

UWAGA: Typowe początkowe ilości produkcji limfocytów T CAR to 1-5 × 10 6 limfocytów T na grupę. Zwiększenie liczby komórek w grupie kontrolnej UTD o 50%, ponieważ ta grupa będzie również wykorzystywana do normalizacji poziomów transdukcji w eksperymentach kolejnych. Spodziewaj się 5-6 podwojeń populacji podczas ekspansji. Transdukcja komórek T została zoptymalizowana za pomocą kopolimeru blokowego jako wzmacniacza (patrz Tabela materiałów) oraz z określonymi stosunkami powierzchni do objętości w płytkach płaskich o 96 dołkach¹⁷.

1. Przygotowanie roztworu wzmacniacza 100 mg/mL
   1. Dodaj 5 g wzmacniacza kopolimeru do plastikowej butelki, a następnie 45 mL ultraczystej wody. Mieszaj przez noc w RT.
   2. Przelej roztwór do cylindra z podziałem i dostosuj objętość do 50 mL z ultraczystą wodą.
   3. Przefiltruj roztwór przez porowy filtr o średnicy 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.
2. Aktywacja limfocytów T (dzień 0)
   1. Warunkiem wstępnym: Utrzymuj oczyszczone ludzkie limfocyty CD4⁺ i CD8⁺ w TCM gotowe.
   2. Policz limfocyty T CD4⁺ i CD8⁺ i łącz je w proporcji 1:1.
   3. Płucz kulki aktywacyjne w następujący sposób.
      1. Dodaj 1 mL TCM do probówki, ponownie zawiesij kulki przez wirowanie i przenieś ilość potrzebną do uzyskania stosunku 3 do 1 komórek T. Umieść rurkę w magnetycznym stojaku i pozwól, by kulki utworzyły osadę wzdłuż ścianki rurki.
      2. Po 30 sekundach ostrożnie zasysaj supernatant, wyjmij rurkę z podstawki magnetycznej i ponownie zawiesz kulki w 1 mL TCM. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
   4. Dodaj kulki aktywacyjne do limfocytów T i dostosuj końcowe stężenie do 1× 10^{6 komórek} /mL z TCM podgrzanym do 37 °C.
   5. Dobrze wymieszaj i przelej zawiesinę do zbiornika odczynnikowego. Komórki płytowe w płytkach płaskich z 96 dołkami z 50 μL TCM na dołek przy użyciu pipety wielokanałowej. Dokładnie mieszaj co 1-2 minuty, aby zapobiec osiadaniu koralików.
3. Transdukcja limfocytów T (dzień 1)
   UWAGA: Dobrać ilości lentiwirusa na podstawie wyników poprzedniej dawki, zapewniając, że końcowe poziomy transdukcji są porównywalne między grupami (zazwyczaj od 20% do 30%). Aby uniknąć wielu integracji lentiwirusowych, utrzymuj maksymalne poziomy transdukcji ≤ 30%. Lentiwirusy z dużymi transgenami zazwyczaj wymagają albo nierozcieńczonego wirusa, albo rozcieńczenia 1:4-1:8. Dostosuj wielkość grup, aby uniknąć pozostałości lentiwirusa, ponieważ każdy cykl zamrożenia i rozmrażania zmniejsza liczbę miarek lentiwirusowych. Stosuj lentiviral master mix zaraz po przygotowaniu.
   1. Rozmroz wymagane ilości skoncentrowanego lentiwirusa w RT i przechowuj w lodzie.
   2. Przygotuj wywar roboczy o stężeniu 2 mg/mL w zimnym TCM, mieszając np. 100 μL stymulatora (100 mg/mL) z 4,9 mL TCM.
   3. Przygotować mieszanki główne lentiwirusa na podstawie wyników miareczkowania i dodać wzmacniacz do końcowego stężenia 275 μg/mL. Zwiększ końcowe objętości o co najmniej 10%, aby uwzględnić straty pipetowania. Np. aby uzyskać rozcieńczenie 1:16 przy 100 studniach:
      Całkowita objętość: 100 otworów × 12,5 μL lentiwirusa × 110% = 1 375 μL
      Rozcieńczenie 1:16: 1 375 μL/16 = 85,9 μL lentiwirusa
      Wzmacniacz: 189 μL (275 μg/mL końcowy)
      Ostateczna mieszanka master: 1 100 μL TCM + 85,9 μL lentiwirusa + 189 μL wzmacniacza = 1 375 μL
   4. Między 23-26 godzinami po stymulacji kulek transdukuj limfocyty T 12,5 μL na dołek z mieszanką lentiwirusową za pomocą pipety wielokanałowej, co daje końcowe stężenie wzmacniacze 55 μg/mL. Dodaj 12,5 μL TCM do studni sterujących UTD.
4. Karmienie limfocytami T (dzień 3)
   1. Delikatnie dodaj 125 μL TCM podgrzanego do 37 °C do każdego otworu za pomocą pipety wielokanałowej.
5. Usuwanie komórek T (dzień 5)
   UWAGA: Przygotuj zbiornik sterylny oraz trzy zestawy probówek po 50 ml dla każdej hodowli. Ogranicz całkowitą objętość płukania do ≤ 20% objętości hodowli limfocytów T, aby uniknąć rozcieńczania komórek poniżej 8 × 10^{5 komórek} /mL.
   1. Każdą hodowlę zgromadzić w sterylnym zbiorniku za pomocą pipety wielokanałowej, przemyć oryginalne płytki TCM i dodać płukanie do zbiornika. Przełóż każdą zawiesinę ogniwa do pierwszego zestawu probówek 50 mL.
   2. Umieść rurki w magnetycznym stojącku, aby kulki mogły utworzyć pelet wzdłuż ścianki rurki. Po 30 sekundach ostrożnie przenieś supernatanty do drugiego zestawu lamp i umieść je w stojaku magnetycznym. Odczekaj 30 sekund (kulki powinny już nie być widoczne), potem przelej supernatanty do trzeciego zestawu probówek i przechowuj je w inkubatorze.
   3. Policz każdą hodowlę i normalizuj do 8 × 10^{5 komórek} /mL z TCM podgrzanym do 37 °C. Nakładaj płytkę w odpowiednim naczyniu hodowlowym w zależności od końcowej objętości (Tabela 2).
   4. Pozwól limfocytom T odpocząć przez 1 dzień, a następnie rozpocznij codzienne karmienie od 7. dnia (patrz kolejny krok).
6. Karmienie limfocytami T (7. dzień i codziennie po tym)
   UWAGA: Limfocyty T podwajają się mniej więcej co 24-36 godzin i przechodzą 5-7 podwojeń populacji przed odpoczynkiem. Monitoruj objętości komórek T za pomocą licznika ogniw opartego na impedancji elektrycznej (patrz Tabela materiałów), aby określić optymalny moment czasu na krioprezerwację.
   1. Zgrupuj każdą hodowlę, dobrze wymieszaj i policz komórki.
   2. Normalizuj każdą hodowlę do 8 × 10^{5 komórek} /mL z TCM podgrzanym do 37 °C i ponownie nakładaj do odpowiedniego naczynia hodowlanego (Tabela 2).
   3. Kontynuuj rozszerzanie, aż średnia objętość komórek spadnie poniżej 320 μm³, następnie przejdź do etapu krioprezerwacji.
7. Walidacja transdukcji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej
   UWAGA: Transdukcję limfocytów T można ocenić w dowolnym momencie między 5. dniem a dniem krioprezerwacji. Poziomy ekspresji będą maleć w trakcie rozwinięcia, tak aby wczesne pomiary zapewniły wyraźne rozdzielenie ujemnych i dodatnich ułamków podczas analizy cytometrii przepływowej.
   1. Pobierz 2 × 10 komórek^{po 5} T z każdej hodowli.
   2. Barwi komórki T dla odpowiedniego markera transdukcji (np. anty-CD19 CAR lub anty-HER2 synNotch) przeciwciałami (patrz Tabela materiałów) i analizuje ekspresję markerów za pomocą cytometrii przepływowej
8. Kriokonserwacja komórek T (zazwyczaj między dniem 10-12)
   UWAGA: Kriokonserwatywne rozszerzanie komórek T tuż przed lub po stanie spoczynku, aby poprawić żywotność podczas rozmrażania. Średnia objętość 320^μm3 może stanowić granicę dla kriochrony. Gdy objętość komórek spada poniżej 300 μm³, limfocyty T przestają się dzielić, a ich całkowita liczba zaczyna maleć. Upewnij się, że wszystkie grupy mają porównywalną objętość w momencie krioprezerwacji, co może wymagać dodatkowego dnia kultury dla niektórych grup. Zamrażaj komórki ze stałą prędkością -1 °C na minutę, używając odpowiednich pojemników zamrażających (np. pojemniki do zamrażania komórek bez alkoholu, patrz Tabela materiałów).
   1. Każdą hodowlę zgromadzić w odpowiedniej probówce (np. 500 mL), liczyć komórki i przechowywać je w inkubatorze.
   2. Oblicz całkowitą liczbę komórek oraz pożądane ilości aliquotów.
   3. Komórki wirówkowe (300 × g, 10 min, 4 °C) zasysają supernatanty i ponownie zawieszają każdą hodowlę w medium mrożącym zawierającym 50% medium bezsurowiczne, 40% beztemperaturowe FBS oraz 10% dimetylosulfentlenku (DMSO) przy stężeniu 2 × 10^{7 komórek} /mL (patrz Tabela materiałów).
   4. Komórki aliquotowe do kriovialów (250 μL do 1 mL, co odpowiada 5-20 × 10^{6 komórek} na fiolkę). Umieść krioviale w pojemniku zamrażającym komórki i przechowuj je na noc w temperaturze -80 °C.
   5. Przenieś krioviale do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.
9. Rozmrażanie komórek T
   UWAGA: Dla każdej grupy limfocytów T przygotuj jedną probówkę z 50 ml TCM podgrzanej do 37 °C, aby rozcieńczyć DMSO w ośrodku zamrażającym po rozmrożeniu. Podgrzej dodatkowy TCM do nakładania talerza.
   1. Szybko rozmroz krioviale w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej lub pod ciepłą wodą.
   2. Gdy tylko pojawi się płyn, przejdź do okapu do hodowli tkankowej, dodaj 500 μL podgrzanego TCM, delikatnie wymieszaj i przenieś komórki do przygotowanych probówek zawierających 50 mL TCM.
   3. Przemyj kriovial 500 μL TCM i dodaj przepłukanie do tej samej tubki.
   4. Inkubuj komórki przez 10 minut w RT.
   5. Ogniwa wirówkowe (300 × g, 10 min, temperatura pokojowa) zasysają supernatanty i ponownie zawieszają komórki w temperaturze 4× 10^{6 komórek} /mL.
   6. Komórki położ w odpowiednim naczyniu hodowlowym (Tabela 2).
   7. Odpocznij komórki na noc w inkubatorze przed przystąpieniem do dalszych eksperymentów.

Jednostka	Minimalna objętość	Maksymalna objętość
96-well	0,1 mL/well*	0,25 mL/studnia
48-studnia	0,2 mL/studnia	1 mL/studnia
24-studnia	0,5 mL/studnia	2 mL/studnia
12-studnia	1 mL/studnia	4 mL/studnia
6-studnia	2 mL/studnia	6 mL/studnia
T25 (poziomo)	3 mL	8 mL
T75 (pozioma)	8 mL	20 mL
T150 (poziomo)	20 mL	60 mL
* objętość hodowli jest tymczasowo zmniejszana do 50 μL/dołek, aby zwiększyć transdukcję limfocytów T

Tabela 2: Zalecane objętości podłoża hodowlanego dla ekspansji komórek CAR T. Minimalne i maksymalne objętości mediów hodowlanych w powszechnie stosowanych formatach naczyń podczas ekspansji limfocytów T.

Wyniki

Aby zademonstrować ulepszenia osiągane dzięki zoptymalizowanemu workflow (Rysunek 1) dla szerokiego zakresu rozmiarów transgenów, wybraliśmy trzy rozmiary wektorów lentiwirusowych: 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) oraz 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Rysunek 2A). Lentiwirusy były produkowane w warunkach standardowych lub zoptymalizowanych (Rysunek 2B: std vs. opt oraz Tabela 1).

Dla najmniejszego wektora o pojemności 5,7 kb zaobserwowano jedynie umiarkowaną poprawę transdukcji komórek T w jednej partii produkcyjnej (Rysunek 2B: góra, 73% vs. 88% przy użyciu nierozcieńczonego wirusa). Konsekwentnie miany lentiwirusowe wzrastały tylko nieznacznie około 1,5-krotnie (rysunek 2C: góra, 2,86 × 10⁸ TU/mL vs. 4,35 × 10⁸ TU/mL). Dla porównania, wektor 9,2 kb wykazał znacznie lepszą wydajność, z maksymalną częstotliwością transdukcji limfocytów T wzrosłą około 5,4 lub 3,8 razy w zależności od partii (Rysunek 2B: środek, 8,3%/16,6% vs. 45,1%/63,1% przy użyciu nierozcieńczonego wirusa), a miany funkcjonalne poprawiły się około 3,3-krotnie (Rysunek 2C: środek; 3,1 × 10⁶ TU/mL vs. 10,1 × 10⁶ TU/mL). Najsilniejszy efekt zaobserwowano przy wektorze 10,1 kb, gdzie tempo transdukcji wzrosło około 12,4- lub 9,8-krotnie (Rysunek 2B: dolny, 1,4%/1,5% w porównaniu do 17,3%/14,7% przy użyciu nierozcieńczonego wirusa), a miany funkcjonalne poprawiły się około 10-krotnie (Rysunek 2C: dolny, 0,24 × 10⁶ TU/mL vs. 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Następnie komórki T od zdrowych dawców zostały przetworzone wektorami lentiwirusowymi produkowanymi w standardowych lub zoptymalizowanych warunkach, wykorzystując odpowiednie workflow (Rysunek 3 i Tabela 1). Aby porównać efektywność transdukcji, w każdym procesie pracy zastosowano równe ilości lentiwirusa, a dawkę wirusa dostosowano tak, aby utrzymać tempo transdukcji na poziomie lub poniżej 30%, aby zapobiec wielokrotnym zdarzeniom integracyjnym. W porównaniu z komórkami T transdukowanymi w warunkach standardowych i przy produkcji lentiwirusów, transdukcja wzrosła średnio 5,1-krotnie dla wektora 5,7 kb, 13,3-krotnie dla wektora 9,2 kb oraz 14,8-krotnie dla wektora 10,1 kb (Rysunek 3A i Tabela Uzupełniająca 1). Wybrane hodowle komórek T generowane w zoptymalizowanym procesie pracy były dalej rozszerzane, aż osiągnęły stan spoczynku (Rysunek 3B,C). Podwojenia populacji wahały się od 5,3 do 6,7, w zależności od dawcy limfocytu T (Rysunek 3B). Dzienne pomiary objętości komórek T wykazały minimalne ilości zanieczyszczenia komórkowego, co nie wskazuje na oznaki toksyczności podczas ekspansji. Przed krioprezerwacją tempo transdukcji oceniano przez barwienie pod kątem ekspresji receptorów CAR/synNotch lub pomiar fluorescencji mTag-BFP2¹⁹ (Rysunek 3C i Ilustracja uzupełniająca 1). Szybkość transdukcji wynosiła 31,2% dla wektora 5,7 kb (; rozcieńczenie lentiwirusa 1:512), 29,8% dla wektora 9,2 kb (czerwony; rozcieńczenie lentiwirusa 1:16) oraz 20,2% dla wektora 10,1 kb (niebieski; rozcieńczenie lentiwirusa 1:4). Dodatkowe dane funkcjonalne potwierdzające wydajność wygenerowanych komórek T svsNotch i komórek T CAR przedstawiono w naszym badaniu towarzyszącym¹⁷. Co ważne, efektorowe limfocyty T wyprodukowane zoptymalizowanym protokołem nie wykazały różnic w podwojeniu populacji ani fenotypie limfocytów T w porównaniu do tych generowanych standardowym workflow¹⁷.

Rysunek 2: Produkcja Lentivirusów według standardowych i zoptymalizowanych przepływów pracy. (A) Schematyczny przegląd wektorów lentiwirusowych o odpowiadających transgenach¹⁷. Góra: CAR wobec CD19 (CD19 CAR) jest wyrażany przez promotor czynnika elongacyjnego-1 alfa (EF1α) u człowieka, o łącznej wielkości transgenu około 5,7 kb. Środkowy i dolny: Receptor synNotch HER2 jest współekspresowany albo z białkiem reportera fluorescencyjnego (BFP2) (środkowy) lub z lucyferazą klikchrząszcza (CBG) (dolny) za pośrednictwem samorozszczepiającego peptydu 2A (P2A) przez promotor EF1α. Ekspresja CAR celującego w mezotelinę (MSLN) (MSLN) jest kontrolowana przez promotor GAL4-specyficznego minimalnego cytomegalowirusa (CMV) (GAL4-CMV). Całkowite rozmiary transgenów wynoszą około 9,2 kb dla HER2-MSLN svsNotch (środkowy) oraz 10,1 kb dla HER2-MSLN-CBG svsNotch (dolny). SIN = wektor samoinaktywujący; LTR = długa sekwencja powtórzeń końcowych. (B) Transdukcja komórek T za pomocą seryjnego rozcieńczenia lentiwirusa generowanych w standardowych (std) i zoptymalizowanych (opt) warunkach, wykorzystując wektory opisane w (A). Dwie niezależne produkcje (okręgi i trójkąty) na wektor, każda z dwoma partiami, oraz dwóch różnych dawców limfocytów T na partię. Tempo transdukcji uśredniono wśród dawców limfocytów T. (C) Funkcjonalne miana standardowych (std, otwarte okręgi) i zoptymalizowanych (opt, zamknięte koła) produkcji wirusów pokazane w (B). Dane zostały wygenerowane z dwóch niezależnych produkcji lentiwirusów, każda w dwóch partiach, z użyciem dwóch różnych dawców limfocytów T na partię. Wszystkie paski błędu wskazują średnią ± SD. Istotność statystyczna została obliczona za pomocą dwustronnego testu t w parach. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Ilustracja ta została zaadaptowana za zgodą Rommla i ^in.17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Produkcja ogniw CAR T z użyciem standardowych i zoptymalizowanych przepływów pracy. (A) Zwiększone tempo transdukcji komórek T przy zoptymalizowanym (opt) workflow w porównaniu do standardowego (std) workflow (patrz także Tabela S1). Dane pozyskano z dwóch lub trzech niezależnych ekspansji limfocytów T z użyciem różnych dawców oraz dwóch niezależnych produkcji lentiwirusów. (B) Podwojenia populacji rozbudowy komórek T generowane przy użyciu zoptymalizowanego przepływu pracy. Dla każdego wektora pokazano dwie niezależne ekspansje limfocytów T od różnych dawców normalnych (ND), z których każda wykorzystuje osobną produkcję lentiwirusa. (C) Wykresy cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję receptorów CAR, BFP2 i synNotch w rozszerzonych efektorowych komórkach T w dniu 7 (10,1 kb) lub dniu 10 (5,7 kb i 9,2 kb) (patrz także Rysunek Uzupełniający 1). Wszystkie słupki błędu wskazują średnią ± SD. Istotność statystyczna została obliczona za pomocą dwustronnego testu t parowego. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Ilustracja ta została zaadaptowana za zgodą Rommla i ^in.17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ilustracja uzupełniająca 1: Strategia bramkowania do oceny ekspresji CAR, receptora synNotch i BFP2, powiązana ze Rysunkiem 3C. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej pokazujące strategię bramkowania stosowaną do określenia ekspresji CAR, synNotch i BFP2 w rozwiniętych hodowlach limfocytów T. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Tempo transdukcji pomiędzy poszczególnymi rozszerzeniami limfocytów T, powiązane z Rysunkiem 3A. Szybkości transdukcji rozbudowy komórek T generowane przy użyciu standardowych i zoptymalizowanych procesów pracy. Ta tabela została zaadaptowana za zgodą Rommla i ^in.17. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół szczegółowo opisujący zoptymalizowany proces produkcji komórek CAR T z dużymi transgenami lentiwirusowymi, takimi jak komórki T svsNotch. Ten proces eliminuje potrzebę sortowania komórek i umożliwia efektywną generację efektorowych limfocytów T przenoszących duże transgeny lentiwirusowe. Korzystając z tego procesu, rutynowo produkujemy efektorowe limfocyty T z transgenami lentiwirusowymi o masie 9-10 kb i maksymalną szybkością transdukcji 60-70% (9 kb) lub 15-20% (10 kb).

Podczas diagnostyki niskich miarek wirusowych lub tempa transdukcji należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych czynników. Po pierwsze, jakość HEK293T komórek. Ważne jest, aby HEK293T komórki były przekazywane według regularnego harmonogramu i nigdy nie pozwoliło im rosnąć powyżej 50-70% współbycia. Z naszego doświadczenia wynika, że wektory lentiwirusowe produkowane z komórek HEK293T wcześniej przerośniętych wykazują obniżone mia, nawet gdy komórki wydają się morfologicznie regenerowane. Rutynowo generujemy wektory wirusowe o wysokiej zawartości miana przy użyciu HEK293T komórek powyżej przejścia 30, co wskazuje, że wyższe liczby przepuszczeń są tolerowane, jeśli komórki są odpowiednio utrzymywane. Oprócz jakości komórek, kluczowym czynnikiem jest zbieg HEK293T komórek w momencie transfekcji. Zaobserwowaliśmy obniżoną liczbę miana lentiwirusowego podczas transfekcji HEK293T komórek przy wysokiej konfluencji (90-100%).

Po drugie, ścisłe przestrzeganie terminów, stężeń i objętości określonych w tym protokole jest niezbędne, ponieważ wiele kroków zostało dokładnie zoptymalizowanych w poprzednim badaniu¹⁷. Na przykład wzmacniacz kopolimerów (patrz Tabela materiałów) został titrowany, aby zmaksymalizować szybkość transdukcji bez wykrywalnej toksyczności. Chociaż wyższe stężenia mogą dodatkowo zwiększyć transdukcję, powodują także toksyczność i zmniejszają rozszerzanie limfocytów T. Podobnie, pobieranie supernatantów lentiwirusalnych poza zalecanym oknem 30-36 godzin (np. po 24 godzinach lub 48 godzinach) dawało niższe miany w odpowiednim eksperymencie czasowym¹⁷. Dla porównania, ścisłe przestrzeganie stosunku limfocytów T CD4 do CD8 nie jest konieczne, ponieważ nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic w wydajności transdukcji przy użyciu komórek T o zmiennym rozkładzie CD4/CD8. Jednak odchylenia od tego stosunku mogą wpływać na czas trwania ekspansji oraz liczbę podwojeń populacji. Dlatego zazwyczaj utrzymujemy stosunek CD4 do CD8 1:1 dla spójności w różnych eksperymentach.

Przyszłe działania optymalizacyjne mogą skupić się na dodatkowych strategiach poprawy transdukcji limfocytów T przy użyciu jeszcze większych transgenów lentiwirusowych, takich jak specjalistyczne formuły mediów czy dostosowane schematy cytokinowe. Rozszerzenie tego procesu na inne typy komórek odpornościowych, w tym naturalne komórki zabójcze i makrofagi, mogłoby poszerzyć jego zastosowanie terapeutyczne. Co ważne, kliniczne tłumaczenie tego przepływu pracy może również pomóc w obniżeniu kosztów produkcji produktów z terapii komórkowej modyfikowaną lentiwirusem.

Kompleksowy protokół krok po kroku przedstawiony tutaj stanowi praktyczne źródło do produkcji komórek CAR T z dużymi transgenami lentiwirusowymi i stanowi podstawę do opracowania nowych komórek CAR T przeciwko nowotworom stałym i krwi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała - anty-CD19 CAR	Cytoart	200101	Anty-CD19 CAR (idiotyp), AF647-sprzężony, 1:100
Przeciwciało - synNotch anty-HER2	R& D Systems	FAB95471G	Anty-Trastuzumab (idiotyp), sprzężony AF488, 1:80
Wybielacz	Clorox	Wybielacz zarazkowy
Pojemnik zamrażający komórki	Biocyzja	FTS30	Bez alkoholu
Wirówka (duża)	Thermo Scientific	Legend XTR
Wirówka (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Wirówka (mała)	Eppendorf	5425
Licznik Coultera	Beckman Coulter	Multisizer 4	Licznik ogniw oparty na impedancji elektrycznej, który określa liczbę komórek i objętości komórek
Rurki kriogeniczne	Thermo Scientific	375418
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Technologia sygnalizacji komórkowej	12611P
DPBS (bez wapnia, bez magnezu)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Koraliki aktywacyjne używane do stymulacji limfocytów T
Etanol	Decon Laboratories	200 Proof
FBS (nieaktywowany termicznie)	Avantor (VWR)	97068-091
Cytometr przepływowy	BD	LSRFortessa (647177)
Zamrażarka (-80 stopni; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Zamrażarka (ciekły azot)	MVE HEco	1500-190
Lodówka (4 i stupnie; C)	Fisher Scientific	Isotemp
Rękawice (nitrylowe)	Halyard	55082
Suplement GlutaMAX	Gibco	35050-061	L-alanyl-L-glutamina
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Lód (suchy)	N.A.	N.A.
Lód (mokry)	N.A.	N.A.
Wiadro z lodem	Fisher Scientific	07-210-108
Fartuch laboratoryjny (jednorazowy)	Kappler	PVS112WH-MD
Plazmidy pakujące lentiwirusy	Własność	N.A.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Plazmidy transferowe lentiwirusowe	Własność	N.A.	np. pTRPE svsNotch
Lipofektamin 3000 Reagent transfekcyjny	Invitrogen	L3000015	Komercyjny odczynnik lipofekcyjny; zawiera lipofektaminę 3000 (L3000) oraz jej odczynnik wzmacniający (P3000)
Podstawka magnetyczna (duża)	Komórka macierzysta	EasySep 18103	Dla 5 mL/15 mL
Podstawka magnetyczna (mała)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	Dla probarek 1,5 mL
Magnetyczny pręt mieszający	Fisher Scientific	14-513-82	Zestaw do mieszania
Magnetyczna platforma mieszania	Thermo Scientific	S88857100
Cylinder pomiarowy (100 mL)	VWR	76019-316
Woda MQ	Merck	Q-POD	Ultrapue Water; używa filtra końcowego Millipak 40 Express, 0,22 mikrona (MPGP04001)
Pipeta wielokanałowa	Fisher Scientific	Zobacz komentarze	30-300 & mikro; L:  FBE1200300; 5-50 i mikro; L:  FBE1200050
Opti-MEM (z L-glutaminą, Phenol Red)	Gibco	31985-070	Minimalne niezbędne medium o obniżonej surowicy stosowane do transfekcji DNA
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL, 10 000 i mikro; g/mL)	Gibco	15140-122
Pipety	Fisherbrand	Zobacz komentarze	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipety (aspiracyjne)	Falcon	357558	2 mL
Pipeta	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Kontroler pipety	Hirschmann	Pipetus Z314951
Końcówki pipety	Thomas Scientific	Zobacz komentarze	1000 &mikro; L: 1159M42; 200 & mikro; L: 1159M40; 20 & mikro; L: 1159M43; 10 & mikro; L: 1159M41
Plastikowa butelka do przechowywania (500 mL)	Corning	430282
Rezerwuar odczynnikowy	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (z L-glutaminą, Phenol Red)	Gibco	11875-085
Skala	Ohaus	Pionier	Wymagana minimalna dokładność 0,1 g
Filtr Steriflip (0,45 & mikro; m)	Millipore	SE1M003M00
Synperonic F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Kopolimer blokowy stosowany do wspomagania transdukcji limfocytów T
Kolba do hodowli tkanek - T150	Corning	430825
Kolba do hodowli tkanek - T25	Corning	430639
Kolba do hodowli tkanek - T75	Corning	430641U
Okap hodowli tkanek	Thermo Scientific	Seria 1300 A2
Inkubator do hodowli tkanek	Thermo Scientific	Heracell 150i
Płytka hodowla tkankowa – 6-dołkowa	Corning	3516
Płytka do hodowli tkankowej – płaska dno z 96 dołkami	Falcon	353072
Płytka do hodowli tkanek – 96-dołkowa, okrągłe dno	Falcon	353077
Trypsyna-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054
Rurki – 1,5ml nakrętki	Sarstedt	72692005
Lampy - 15 mL	Falcon	352099
Lampy - 5 mL	MSP	62-1028-2
Lampy - 500 mL	Corning	431123
Tubki - 50ml	Falcon	352098
Ultrawirówka	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Wirnik ultrawirówki z łyżkami	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Adaptery do rurek ultrawirówek (do lamp stożkowych)	Seton Scientific	4230
Rurki ultrawirówki (stożkowe)	Seton Scientific	5067
Wir	Fisher Scientific	02215414
Kąpiel wodna (37 stopni; C)	Fisher Scientific	Isotemp 210	Używana z koralikami Lab Amor (Gibco) zamiast wody
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	Nośniki bezsurowicze używane do zamrażania limfocytów T