Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Streszczenie

Włóknienie płuc charakteryzuje się stopniowym odkładaniem się tkanki bliznowatej włóknistej w obrębie mięścia płuca, prowadząc do poważnie upośledzonej wymiany gazów. Jest podstawą spektrum przewlekłych chorób śródmiąższowych płuc, w szczególności idiopatycznego włóknienia płuc, schorzenia związanego z wyjątkowo złą rokownictwem. Ze względu na brak skutecznych terapii, solidne modele myszy są kluczowe do wyjaśnienia leżących u podstaw mechanizmów patologicznych oraz oceny nowych interwencji przeciwfibrotycznych. Błona płucna wywołana bleomycyną pozostaje najczęściej wykorzystywanym modelem eksperymentalnym. Typowe metody podawania u myszy to dożylne i dootrzęwne, inwazyjne otwarte instylowanie tchawicy oraz nieinwazyjne kapanie tchawicy. Jednak inwazyjne metody chirurgiczne często powodują wtórne uszkodzenia tkanek, co może obniżyć powtarzalność i stabilność modelu. Natomiast nieinwazyjne kapanie tchawicy zwykle prowadzi do nierównomiernego rozkładu bleomycyny w płatach płuc i niesie ryzyko uduszenia, co zmniejsza powtarzalność i zwiększa wyzwania techniczne. Aby sprostać tym ograniczeniom, opracowano udoskonaloną metodę podawania wewnątrztrachowców opartą na aerozoli, która jest operacyjnie prostsza, minimalnie inwazyjna, wysoce powtarzalna i etycznie lepsza, znacząco zmniejszając stres zwierząt. Za pomocą laryngoskopu dla małych zwierząt do bezpośredniej wizualizacji rima glottidis, do tchawicy wprowadza się specjalistyczną igłę aerozolazującą, znacznie węższą niż średnica tchawicy myszy. Roztwór bleomycyny podawany jest pod precyzyjnie kontrolowanym ciśnieniem, tworząc drobny aerozol. Zapewnia to równomierne i efektywne rozmieszczenie środka w całym parenchymie płuca. Ponadto można selektywnie celować w lewy lub prawy płuco, kierując igłę do odpowiedniego oskrzela. Relacja dawka-odpowiedź tego modelu jest szeroko charakteryzowana poprzez systematyczne monitorowanie zmian funkcji płuc, przejawów histopatologicznych oraz zawartości hydroksyproliny w płucach. Ten udoskonalony protokół eksperymentalny ma ułatwić standaryzację laboratoryjną, ostatecznie przyspieszając rozwój i przedkliniczną walidację nowych terapii przeciwfibrotycznych.

Wprowadzenie

Włóknienie płuc (PF) to grupa śmiertelnych chorób charakteryzujących się postępującym uszkodzeniem mięścia przydusznego płuca oraz nieprawidłową naprawą, z których idiopatyczna fibroza płuc (IPF) stanowi 30%-40%, przy medianie wieku diagnozy pacjentów to 65 lat, a ponad 80% z nich ma 60 lat więcej niż 60 lat^{1, 2}. W miarę nasilania się globalnego starzenia zachorowalność na IPF rośnie z roku na rok, osiągając światową częstość występowania IPF na poziomie 3-9/100 000/rok, a według badania przeprowadzonego w Stanach Zjednoczonych wśród osób powyżej 65. roku życia, częstość występowania w tej populacji wzrosła do 93,7/100 000/^{rok 3,4}.

Pierwszym historycznie opracowanym modelem włóknienia płuc był model wywołany bleomycyną, często stosowany w środowisku akademickim, z najlepszą charakterystyką i najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym obecnie⁵, powtarzającym wiele cech IPF i innych fibrotycznych ILD, w tym zapalenie płuc, uszkodzenie nabłonka, proliferację fibroblastów oraz nadmierne odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁶. Ponadto zarówno ostre, jak i przewlekłe włóknienie płuc można modelować w zależności od dawki i częstotliwości podawania bleomycyny. Zgłaszano, że płuca wchodzą w ostrą fazę zapalną w ciągu 5-7 dni po ekspozycji na bleomycynę, po której następuje faza fibrotyczna zaczynająca się około 7 dnia. Do 21. dnia zazwyczaj obserwuje się wyraźną remodelację włóknistą, co pozwala modelowi podsumować zarówno wczesną odpowiedź zapalną, jak i późną patologię fibrotyczną w określonym czasie⁷ (Rysunek 1A). Pozwala to na badanie całego procesu chorobowego od początkowego urazu aż do stadium włókniastego, co jest bardzo ważne dla rozwoju leków i badań mechanizmów na wszystkich etapach ^8,9.

Drogi modelowania bleomycyny są różnorodne i mogą być podawane lokalnie lub systemowo, w tym przez szlaki endotchawiczne, nosowe, dożylne i wewnątrzotrzewnowne. Najczęściej stosowanym jest zastrzyk do tchawicy. Minusem jest to, że powoduje to nacięcia u myszy, co wpływa na przeżywalność modelowanych myszy¹⁰. Później wprowadzono ulepszenia, aby umożliwić stosowanie igły do intubacji tchawicy i iniekcji kroplówkowej u myszy¹¹. Jednak lek podawany przez strzykawkę może być rozprowadzany w płucach jedynie jako blokada, co może prowadzić do nierównomiernego rozkładu bleomycyny w każdym płatku płuca, powodując lokalną nadgęstość i wpływając na stabilność modelu myszy. Ponadto do podawania bleomycyny używano wkładów do nebulizatorów komorowych, ale ilość wdychanego aerozolu bleomycyny w każdej myszy nie może być dokładnie określona, a czas pojedynczej indukcji wynosi^{długie 12}. Dlatego opracowano udoskonaloną metodę podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej opartej na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych myszowych modeli włóknienia płuc. Bleomycyna jest aerozolizowana, co umożliwia równomierną dyspersję i odkładanie się w płucach, a tym samym lepiej odtwarza patologię chorób płuc. Mamy nadzieję, że pojawienie się tej metody przyspieszy badania nad lekami, które mogą całkowicie wyleczyć włóknienie płuc.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC). Przez cały eksperyment wdrożono odpowiednie środki dotyczące dobrostanu zwierząt. Do eksperymentu wybrano samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni, ważące około 25 g. Tabela materiałów zawiera listę wszystkich zwierząt, odczynników i sprzętu używanych w tym badaniu oraz ich komercyjnych źródeł.

1. Selekcja i aklimatyzacja zwierząt

1. Wszystkie myszy trzymaj w określonych warunkach wolnych od patogenów, z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz improwizowanym dostępem do jedzenia i wody.
2. Przyzwyczaj myszy do pracy w ośrodku przez 5-7 dni przed rozpoczęciem modelu opartego na aerozolu.

2. Przygotowanie roztworu bleomycyny

UWAGA: Bleomycyna jest cytotoksycznym środkiem przeciwnowotworowym. Wszystkie kroki wykonuj w certyfikowanej szafce bezpieczeństwa biologicznego, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.

1. Używając sterylnej strzykawki o pojemności 1 mL, pobierz 3 mL bezpłodnej 0,9% chlorku sodu i wstrzyknij ją do fiolki zawierającej 15 U chlorowodorku bleomycyny.
2. Delikatnie mieszaj fiolkę, aż proszek się całkowicie rozpuści, aby uzyskać roztwór 5 U/mL.
3. Roztwór zapasowy należy do sterylnych rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL. Przygotuj roztwory robocze 3,75 U/mL i 2,5 U/mL poprzez rozcieńczenie sterylną solą fizjologiczną.
   UWAGA: Dla myszy masowej 25 g stężenia te odpowiadają dawkom odpowiednio 7,5 U/kg i 5 U/kg. Dostosuj stężenia, jeśli waga myszy się zmienia.
4. Przechowuj roztwory działające w 4 °C do tygodnia lub do 1 miesiąca w -80 °C. Rozmroz i przygotuj do temperatury pokojowej przed użyciem.

3. Podawanie bleomycyny wewnątrztchawicowej za pomocą aerozoli

1. Przygotowanie i podawanie znieczulenia
   1. Przygotuj roztwór znieczulający, rozpuszczając 0,1 g proszku sodu pentobarbitalu w 10 ml bezpłodnej soli fizjologicznej. Filtr używa membranowego filtra PES o średnicy 0,22 μm. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C w środowisku chronionym przed światłem i użyj w ciągu 3 dni od przygotowania.
   2. Podawaj roztwór pentobarbitalu sodu przez iniekcję dootrzewną za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL z igłą 26-gauge w dawce 60 mg/kg masy ciała. Jeśli głębokość lub czas działania znieczulenia jest niewystarczający, dostosuj dawkę w zależności od reakcji zwierzęcia pod okiem weterynarza.
   3. Zmierz głębokość znieczulenia kilka minut po wstrzyknięciu, mocno ściskając palec i potwierdzając brak odruchu odstawienia przed dalszymi zabiegami.
2. Przygotowanie aparatury do dostarczania aerozoli
   1. Przygotuj aparat do dostarczania aerozolu, upewniając się, że igła nebulizująca, strzykawka i filar dozujący są obecne i sterylne (Rysunek 1B).
   2. Zanurz strzykawkę aerozolową w sterylnej soli fizjologicznej. Powoli wdychajcie płyn i robicie pauzę na 8 sekund. Szybko wypróżnij płyn. Powtórz to trzy razy, aby napełnić i przepłukać system.
   3. Po ostatecznym wydaleniu ponownie napełnij strzykawkę solą fizjologiczną. Przymocuj igłę aerozolizującą, upewniając się, że połączenie jest wypełnione solą fizjologiczną.
   4. Zanurz złożoną igłę w soli fizjologicznej i powtórz cykl aspiracji-pauzy-wypychania jeszcze trzy razy, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Aby potwierdzić gotowość, wydłuż sól fizjologiczną na ciemnym tle. Upewnij się, że szybko wydzielona sól fjologiczna tworzy wachlarzowatą mgiełkę na ciemnym tle.
3. Procedura podawania aerozoli wewnątrztchawicowego
   1. Sprzątaj igłę aerozolową roztworem roboczym bleomycyny, zasysając i wydychając ją trzykrotnie z 8-sekundowymi przerwami.
   2. Na szczycie słupka 50 μL wstaw kolumnę dozującą 25 μL, aby skalibrować objętość. Aspiruj wymaganą objętość (50 μL). Wyrzuć nadmiar płynów.
      UWAGA: Taka konfiguracja dawkowania zapewnia spójne dostarczanie poprzez minimalizację błędów ludzkich.
   3. Umieść znieczuloną mysz na platformie intubacyjnej, zaczepiając górne siekacze i tapiąc kończyny, aby ustabilizować (rysunek 1C).
      UWAGA: Potwierdź rytmiczne ruchy klatki piersiowej. Jeśli zwierzę wydaje się aktywne, podaj dodatkową dawkę znieczulującego.
   4. Użyj wygiętych kleszczy, aby delikatnie wyciągnąć język. Włóż laryngoskop małego zwierzęcia, aby odsłonić krtanię (Rysunek 1D).
   5. Włóż igłę aerozolizującą pionowo przez krlotę. Dostarcz aerozol bleomycyny szybko (rysunek 1E).
      UWAGA: Skieruj końcówkę igły w kierunku pożądanego płuca dla celowanego podania. Unikaj zbyt głębokiego wkładania, aby zapobiec urazom. Końcówka igły nebulizatora powinna być umieszczona blisko, ale nie dotykając, punktu bifurkacji (pierwszego bifurkacji) tchawicy myszy, aby uzyskać najlepszy efekt modelowania. Jeśli czubek zostanie umieszczony tylko w środku tchawicy, aerozol może uderzyć jedynie w ścianę tchawicy, tworząc duże krople, które są wyplywane lub połykane. Jeśli czubek znajduje się zbyt blisko rozgałęzienia tchawicy, istnieje ryzyko uszkodzenia tchawicy.

4. Powrót do zdrowia po zabiegu

1. Połóż mysz na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Obserwuj mysz nieprzerwanie, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu (zazwyczaj 1-2 godziny).
2. Wykonaj szczypnięcie palca, aby sprawdzić refleks i upewnić się, że mysz żyje.
3. Codziennie monitoruj klinicznie przez 21 dni, w tym masę ciała, poziom aktywności, pielęgnację i objawy układu oddechowego.
4. Uśpienie zwierząt, gdy spełnione są następujące kryteria: (i) >20% utrata masy ciała w porównaniu do poziomu wyjściowego przed leczeniem, lub ≥15% utrata towarzysząca innym klinicznym oznakom cierpienia; (ii) utrzymujący się ciężki niedociąg oddechowy w spoczynku (ciężkie lub brzuszne oddychanie, wyraźna tachypnoja lub bradypneja, rozszerzenie nosa lub oddychanie otwartymi ustami), z cynianizą kończyn lub bez niej; (iii) niemożność zdobycia jedzenia lub wody, wyraźna ospałość lub wygląd umierania (brak reakcji na dotyk i/lub utrata odruchu prostowania); lub (iv) silne odwodnienie, hipotermia lub inne oznaki nieodwracalnego pogorszenia się według oceny weterynarza prowadzącego. Gdy te humanitarne cele zostaną osiągnięte, należy uśpić zwierzęta przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (≥150 mg/kg, i.p.), a następnie wykonać wtórną metodę fizyczną (np. zwichnięcie szyjki macicy), aby zapewnić śmierć i zminimalizować ból oraz niepokój.

5. Pomiar końcowej funkcji płuc i pobieranie tkanek

1. W dniu 21 znieczulanie myszy podano 90 mg/kg dożylnie tego samego roztworu znieczulenia, aby wywołać głęboką anestezję i zahamować oddychanie.
2. Potwierdź całkowite znieczulenie przez uszczypanie palca. Odsłonij tchawicę, przecinając skórę i rozdzielając mięśnie.
3. Wykonaj małe, skosowane nacięcie w tchawicy i włóż igłę do intubacji. Zabezpiecz się chirurgiczną ligaturą.
4. Przenieś mysz do komputerowego respiratora mechaniki płuc małych zwierząt. Inicjuj wentylację mechaniczną i upewnij się, że nie oddychaj spontanicznie. Używaj systemu respiratora do pomiaru parametrów funkcji płuc.
5. Wykonaj perfuzję prawej komory z 5-10 ml bezpłodnej soli fizjologicznej, aż płuca będą wyglądać na zblednięte.
6. Rozciąń całe płuco. Zabezpiecz lewe płuco w neutralnej buforowanej formalinie na 24 godziny.
7. Osadzić ustaloną tkankę płucną w parafinie, przeciąć ją i wykonać barwienie H&E, barwienie trójchromowe Massona oraz immunohistochemiczne barwienia dla COL1A1 i α-SMA.
8. Umieść prawe płuco w rurce homogenizacyjnej o pojemności 2 mL z kulkami. Dodaj wodę zgodnie z protokołem zestawu hydroksyproliny. Ujednolicz i kontynuuj test.

Wyniki

W tym badaniu zaproponowaliśmy metodę podawania wewnątrzoskrzelowej opartą na aerozolu, mającą na celu wywołanie włóknienia płuc u myszy za pomocą bleomycyny. W eksperymentach wstępnych zielony barwnik był aerozolizowany i podawany do płuc różnych myszy. Barwnik wykazywał plamkowany wzór rozmieszczenia w płucach, co wskazuje, że podanie wewnątrzoskrzelowe na bazie aerozoli umożliwiało równomierne rozproszenie środka we wszystkich płatach płuc (Rysunek 1F). Podawanie zielonego tuszu pokazane ...

Dyskusja

Badanie to zaproponowało zoptymalizowany model nieinwazyjnej nebulizacji tchawicy u myszy wywołanej bleomycyną włóknieniem płuc. Do zlokalizowania krloty użyto małego zwierzęcego laryngoskopu, a do dróg oddechowych myszy wprowadzono maleńką igłę nebulizacyjną. Ręcznie zastosowano ciśnienie, aby roznietleniać lek do płuc, zmniejszając tym samym dyskomfort i duszenie związane z igłą retencyjną stosowaną w nieinwazyjnych zastrzykach^13,14. Dodatkowo te aerozole mogą ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 μ Filtr strzykawkowy m polietersulfonu	Cytosci	CSTPE3320
1 mL jednorazowej strzykawki	BD	300481
Rurka mikrowirówki o pojemności 1,5 mL	Servicebio	EP-150-M
2,0 mL wzmocnionej rurki lizy	Servicebio	HT-200-M
4 stopnie; Chłodnica laboratoryjna C	Meiling	BCD-402WPCX
50 mL stożkowa rurka wirówkowa	Servicebio	EP-5001-J
-80 &°; Zamrażarka C o ultraniskiej temperaturze	Haier Biomedical	DW-86L828J
Absolutny etanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Roztwór różniczkowania kwasowego	Servicebio	G1039
Mikrospryskiwacz aerozolowy do intubacji małych zwierząt	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Podstawowy zestaw narzędzi chirurgicznych	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Roztwór chlorowodorku bleomycyny	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Odczynnik niebieski	Servicebio	G1040
Komputerowo sterowany respirator mechaniki płuc małych zwierząt	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.	FX-2
Taśma izolacyjna elektryczna	3M	1500
Roztwór barwienia Eozyną Y	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Zielony tusz do znakowania	Pilot	Chiku-rin
Roztwór barwienia hematoksylyny	Servicebio	G1004
Zestaw do analizy ilościowej hydroksyproliny	Abcam	ab222941
Laminarny okap	HDL	DL-CJ-1N
Laryngoskop do procedur u małych zwierząt	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Mikroskop świetlny	Nikon	E100
Roztwór dewaksowania o niskiej toksyczności	Servicebio	G1128
Zestaw do trójbarwnego barwienia Massona	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Czytnik mikropłyt z detekcją absorpcji	Agilent	Synergia H1
Neutralna formalina buforowana	Servicebio	G1101-3ML
Neutralne medium mocujące	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Rekombinowane przeciwciało monoklonalne przeciwko COL1A1 dla królików	Huabio	HA722517
Wirówka chłodzona	Eppendorf	5424R
Woda wolna od RNaz	Generalbiol	TYJC002
Platforma do intubacji tchawicy dla małych zwierząt	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Bezpłodny roztwór chlorku sodu 0,9%	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Homogenizator tkanek	Servicebio	KZ-III
Ksylen	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Koraliki do mielenia cyrkonii	Servicebio	G0203