Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Sygnalizacja Neuregulin1-ErbB4 zaangażowana w akupunkturę wspierającą regenerację mieliny u szczurów z urazem rdzenia kręgowego

448 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69166

⸱

20 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego badania jest zbadanie wpływu elektroakupunktury na regenerację mieliny w modelu szczura z rdzeniem rdzeniowym oraz potwierdzenie, czy szlak sygnalizacyjny Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 odgrywa rolę w tym procesie.

Streszczenie

Uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) często prowadzi do poważnych zaburzeń neurologicznych, a naprawa mieliny jest kluczowym krokiem w odzyskiwaniu funkcji neurologicznych. Elektroakupunktura (EA), metoda terapeutyczna łącząca tradycyjną akupunkturę ze stymulacją elektryczną, jest szeroko stosowana w dziedzinie naprawy nerwów. Jednak konkretne szlaki sygnalizacyjne zaangażowane w EA nie zostały w pełni wyjaśnione. Celem tego badania jest zbadanie wpływu EA na regenerację mieliny u szczurów z rdzeniem rdzeniowym oraz potwierdzenie, czy szlak sygnalizacyjny Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 odgrywa rolę w tym procesie. Szczury SCI zostały wywołane przez uraz tętniaka klipsowym w odcinku kręgosłupa T10. Cewnik polietylenowy (PE) został wszczepiony do kanału kręgowego pomiędzy przestrzeniami międzykręgowymi L5-6 i zamocowany podskórnie, aby ustanowić długoterminowy system podawania leków. Egzogenny NRG1 i jego antagonista podawano przez cewnik PE co drugi dzień, z objętością 20 μL na zastrzyk. Zabieg EA był stosowany w punktach akupunktury Dazhui (GV14) i Mingmen (GV4) co drugi dzień, każda sesja trwała 30 minut przez 4 kolejne tygodnie. Wyniki wykazały, że leczenie EA znacząco wspierało ekspresję białka zasadowego mieliny (MBP) w tkance rdzenia kręgowego oraz poprawiało funkcję ruchową kończyn tylnych u szczurów. Ponadto egzogenny NRG1 wywoływał podobne efekty jak EA. Podsumowując, szlak sygnalizacyjny NRG1-ErbB4 odgrywa ważną rolę w regeneracji mieliny indukowanej przez EA u szczurów z rdzeniem rdzeniowym.

Wprowadzenie

SCI to stan urazowy prowadzący do poważnych deficytów neurologicznych, zazwyczaj objawiających się upośledzeniem ruchu, utratą zmysłów oraz dysfunkcją autonomiczną, z rocznym wskaźnikiem zachorowalności na poziomie około 40-80 przypadków na milion osób na świeciewynoszącym 1,2. Po urazie pęknięcie aksonu i utrata mieliny są głównymi cechami patologicznymi utrudniającymi przewodzenie sygnału nerwowego3. Mielina jest tworzona przez oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) oraz komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym (PNS), a jej integralność jest kluczowa dla szybkiego przewodzenia impulsów nerwowych4. Jednak odpowiedź zapalna, stres oksydacyjny oraz powstawanie blizn glejowych w lokalnym mikrośrodowisku po rdzeniu rdzeniowym znacząco hamują regenerację mieliny, prowadząc do przewlekłej dysfunkcji neurologicznej5. Jednocześnie śmierć oligodendrocytów (OL) po urazach rdzenia mózgowego prowadzi do demielinizacji aksonów, procesu rozwijającego się przewlekle i trwało. Badania wykazały, że demielinizację aksonów zarówno w modelach ludzkich, jak i zwierzęcych można skutecznie naprawić poprzez regenerację mieliny6. Dlatego poszukiwanie strategii wspierających naprawę mieliny jest jednym z kluczowych kierunków leczenia rdzenia rdzeniowego.

Akupunktura, jako starożytna, tradycyjna technika medyczna, jest szeroko stosowana w praktyce klinicznej w wielu krajach, w tym w Chinach, Korei i Japonii 7,8. EA, która łączy tradycyjną akupunkturę ze stymulacją elektryczną, została szeroko przyjęta w środowiskach klinicznych. Coraz więcej dowodów wskazuje, że EA ma działanie terapeutyczne na różne choroby, szczególnie w stymulacji regeneracji mieliny po urazie rdzenia kręgowego. Wybór punktów akupunkturowych jest kluczowy podczas leczenia EA, takich jak GV14 i GV49. GV14 znajduje się poniżej wyrostka kolczastego siódmego kręgu szyjnego, blisko linii środkowej kręgosłupa, natomiast GV4 znajduje się pomiędzy kolczastymi wyrostkami drugiegoi trzeciego kręgulędźwiowego. Wcześniejsze badania wykazały, że szlaki sygnalizacji zapalnej, stres oksydacyjny, czynniki neurotroficzne oraz autofagia odgrywają rolęw naprawie mieliny wywołanej przez EA. Ponadto rosnące dowody sugerują, że konkretne punkty akupunkturowe, takie jak GV14 i GV4, odgrywają aktywną rolę w wspieraniu regeneracji mieliny podczas leczenia EA 13,14,15. Jednak molekularne mechanizmy, dzięki którym EA reguluje regenerację mieliny po urazie rdzenia kręgowego, nie zostały w pełni wyjaśnione.

NRG1 należy do rodziny czynników wzrostu naskórka i na podstawie jego obszaru aminoterminalnego można go zaklasyfikować na sześć typów (I-VI)16. NRG1 i jego rodzina receptorów, ErbB (ErbB1/2/3/4), odgrywają istotną rolę w rozwoju i naprawie układu nerwowego, w tym w procesach takich jak migracja neuronów, różnicowanie, remielinizacja i synaptogeneza. Podczas rozwoju PNS komórki Schwanna (SC) proliferują i migrują wzdłuż aksonów neuronów, tworząc mielinę, a szlak sygnalizacyjny NRG1-ErbB4 odgrywa kluczową rolę w dojrzewaniu komórek progenitorowych PNS Schwanna17,18. Wcześniejsze badania wykazały, że szlak sygnalizacji NRG1 bierze udział w różnicowaniu komórek macierzystych nerwowych w komórki Schwanna i sprzyja naprawie mieliny komórek nerwowych po SCI19. Dodatkowo jedno z badań wykazało, że po uszkodzeniu rdzenia kręgowego szlak sygnalizacyjny NRG1-ErbB4 sprzyja przemianie oligodendrocytowych komórek progenitorowych (OPC) w komórki podobne do Schwanna o potencjale remielinizacji20. Alex i in. stworzyli system współhodowli neuronów sensorycznych pochodzących z limfocytów macierzystych indukowanych przez człowieka pluripotentnych oraz komórek Schwanna szczura i stwierdzili, że blokowanie szlaku sygnalizacyjnego NRG1-ErbB lekami znacząco hamowało mielinizację neuronów, dostarczając bezpośrednich dowodów na rolę tego szlaku w promowaniu myelinizacji aksonów sensorycznychu człowieka 21. Inne badanie wykazało również, że leczenie EA może zwiększać ekspresję NRG1 w rdzeniu kręgowym i łagodzić ból zapalny22.

Badania nad wpływem EA na szlak sygnalizacyjny NRG1-ErbB4 w rdzeniu rdzeniowym są ograniczone, a mechanizmy leżące u podstaw pozostają niejasne. Celem niniejszego badania jest zbadanie, czy stymulacja EA w punktach akupunktury GV14 i GV4 może regulować transdukcję sygnału NRG1-ErbB4 oraz zbadanie jej potencjalnej roli w wspieraniu regeneracji mieliny i odzyskiwaniu funkcji neurologicznych u szczurów z rdzeniem rdzeniowym. Jest to pierwsze badanie badające związek między szlakiem sygnalizacyjnym NRG1-ErbB4 a regeneracją mieliny indukowaną przez EA u szczurów z rdzeniem rdzeniowym, dostarczając dowodów eksperymentalnych na opracowanie nowych i skutecznych strategii leczenia SCI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Podczas eksperymentu przestrzegano wszystkich wytycznych etycznych, aby zminimalizować cierpienie zwierząt. Protokół eksperymentalny i projekt zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Kunming (Zatwierdzenie nr KMMU2021051) i prowadzonych zgodnie z wytycznymi uniwersyteckimi dotyczącymi badań na zwierzętach. Dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (8 tygodni, ważące 250-270 g, n = 60) zostały pozyskane z Kunming Medical University (Yunnan, Chiny).

Przygotowanie zwierząt

Zwierzęta były trzymane w kontrolowanym środowisku ze stałą wilgotnością, umiarkowaną temperaturą i 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Zwierzęta zostały losowo przydzielone do 11 grup: grupa fikcyjna (S, n = 6), grupa SCI (M, n = 6), SCI z grupą leczącą EA (M + EA, n = 6), SCI z grupą leczenia NRG-1β (M + NRG-1β, n = 6), SCI z grupą rozpuszczalną z 5% DMSO (M + D, n = 6), SCI z inhibitorem PD158780 oraz grupa leczenia NRG-1β (M + PD+NRG-1β, n = 6), SCI z inhibitorem PD158780 i grupą leczenia EA (M + EA + PD, n = 6), SCI z rozpuszczalnikiem i grupą leczącą EA (M + EA + D, n = 6), SCI z shRNA oraz grupą leczącą EA (M + EA + shRNA, n = 6), SCI z lentiwirusem zawierającym niecelujące shRNA oraz grupą leczącą EA (M + EA + NC, n = 6), SCI z grupą leczącą shRNA (M + shRNA, n = 6). Obecna wielkość próby została ustalona na podstawie naszych wcześniejszych doświadczeń z podobnymi modelami i interwencjami, które konsekwentnie wykazywały istotne efekty przy tej liczbie. Ponadto, pomimo wielkości próby, zaobserwowaliśmy statystycznie solidne i istotne różnice w kluczowych wynikach, co wzmacnia zaufanie do raportowanych wyników.

Model szczura SCI

Klips do wyciągu Yasargil (tytanowy, standardowa siła zamykania 70 g) został użyty do stworzenia modelu szczura rdzenia rdzeniowego za pomocą techniki zaciskowej (Rysunek 1A). Szczury zostały znieczulone 2% pentobarbitalem sodu (30 mg/kg, dootrzewnowkowo) i umieszczone na stole operacyjnym. Wykonano nacięcie o długości 3-4 cm w skórze pleców, po czym warstwa po warstwie rozwarstwiała tkankę podskórną i mięśnie, aby odsłonić wyrostki kolczaste T9-11 klatki piersiowej oraz łuki kręgów. Do usunięcia wyrostka kolczastego i łuku kręgowego T10 użyto klipsa naczyniowego, całkowicie odsłaniając rdzeń kręgowy. Klips tętniaka Yasargila został umieszczony pionowo na całym segmencie T10 i szybko zwolniony po 60-sekundowym czasie zatrzymania. Model uznano za udany, jeśli zaobserwowano dwa lub więcej z następujących objawów: (1) skurczowe drżenie ciała, (2) odruch merdania ogonem oraz (3) widoczne czarne ślady szczypania na rdzeniu kręgowym. Po zapewnieniu odpowiedniej hemostazy nacięcie zostało zdezynfekowane i przyszyte. W grupie pozorowanej operacji wykonano ten sam zabieg, z tą różnicą, że rdzeń kręgowy nie został zaciśnięty. Po operacji szczury otrzymywały prawidłową sól fizjologiczną (3 mL, dootrzewnowkowo) w celu nawodnienia oraz penicylinę (100 000 jednostek, dootrzewnowkowo) rano i raz wieczorem przez 3 kolejne dni, aby zapobiec infekcji. Zapewniano ręczną pomoc przy oddawaniu moczu, aż do przywrócenia samoistnego oddawania moczu (2 razy dziennie).

Rurki downętrzne szczurów i podawanie leków

Zgodnie z metodą Storksona i in.23, cewnik został wszczepiony do przestrzeni podpajęczynowej u szczurów tydzień przed wprowadzeniem modelu SCI. Po znieczuleniu szczury zostały zafiksowane na stole operacyjnym, a przestrzeń międzykręgowa L5-6 została odsłonięta. Igła 19G została użyta do pionowego przebicia przez oponę twardą i błonę pajęczynową. Igła została przesunięta o około 1-2 mm, a po przebiciu błony pajęczynowej odczuwano poczucie przestrzeni, po czym nastąpił wyraźny przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego, co wskazywało na pomyślne nakłucie. Cewnik PE-10 (polietylen, średnica wewnętrzna 0,38 mm, średnica zewnętrzna 1,09 mm) został wprowadzony do przestrzeni podpajęczynczynowej wzdłuż igły nakłucia. Cewnik został przesunięty do długości około 3 cm, a końcówka cewnika umieszczono blisko ciała kręgu L3. Podczas zakładania u szczurów obserwowano ruchy ogona i drganie tylnych kończyn, a płyn mózgowo-rdzeniowy wypływał przez cewnik, potwierdzając jego położenie w przestrzeni podpajęczynówkowej.

Zarówno NRG-1β, jak i PD158780 zostały rozpuszczone w dimetylosulfoksydzie (DMSO), a następnie rozcieńczone sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), co zapewniło, że końcowe stężenie DMSO pozostało poniżej 0,5%. Końcowe stężenia robocze wynosiły 20 nM dla NRG-1β i 20 μM dla PD15878024. Drugiego dnia po SCI szczury z grupy M + NRG-1β otrzymywały intratekalne zastrzyki 20 μL NRG-1β co drugi dzień. Szczury w grupie M + EA + PD podawano 20 μL PD158780 intrathecalnie25, 2 godziny przed leczeniem EA.

Leczenie EA

Trzeciegodnia po operacji szczury zostały unieruchomione na stole do terapii elektroakupunkturą (EA) w punktach akupunktury GV14 i GV4 (Rysunek 1B). W tych punktach wprowadzono dwie igły akupunkturowe (0,25 mm x 13 mm) na głębokość 3-4 mm. Terapia EA była stosowana za pomocą urządzenia elektroakupunkturowego o rzadko-gęstym wzorze fal (fala rzadka przy 2 Hz i gęsta fala przy 10 Hz, o stosunku częstotliwości 1:5)26. Intensywność wyjściowa była ustawiana na 5 (około 0,5 mA) przez 30 minut, co drugi dzień.

Ocena behawioralna

Funkcje lokomotoryczne oceniano za pomocą skali27 Basso, Beattiego i Bresnahana (BBB), która ocenia ruch kończyn, chód, koordynację oraz umiejscowienie łap w następujących punktach czasowych: 0, 3, 7, 14, 21 i 28 dni po operacji ( rysunek 2D). Skala BBB waha się od 0 (co oznacza całkowity paraliż) do 21 (oznacza normalny chód). Wszystkie oceny były przeprowadzane niezależnie przez dwóch badaczy, którzy nie znali przydziałów grup eksperymentalnych.

Zbieranie próbek

Po zakończeniu eksperymentu znieczulone szczury zostały umieszczone na platformie do sekcji w celu pobierania tkanek. Jama brzuszna została otwarta, aby całkowicie odsłonić przeponę, którą starannie nacięto nożyczkami do tęczówki, aby zapobiec uszkodzeniu naczyń. Następnie klatka żebrowa została przecięta wzdłuż obu brzegów żebrowych, aby odsłonić serce, po czym igła została wprowadzona do lewej komory na wierzchołku i około 300-400 ml wcześniej schłodzonego PBS zostało szybko przeinfundowane, aby oczyścić krew ogólnoustrojową, aż z prawego przedsionku wypłynęła przezroczysta płyn. W analizie białek molekularnych perfuzję zatrzymano na tym etapie, a kręgosłup został przecięty. Po usunięciu sąsiednich żeber i mięśni w celu odsłonięcia kręgów, zlokalizowano segment T10, a segment rdzenia kręgowego o długości około 1 cm od rostralnego i ogon do T10 pobrano nożyczkami do tęczówki, następnie zamroziano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C. Do badań morfologicznych perfuzję przesunięto na 4% paradehydu po PBS, a skuteczne utrwalenie wskazywało na skurcz mięśni i sztywność tułowia. Ten sam segment kręgosłupa został następnie starannie rozcięty, aby zachować architekturę tkanki, i zafiksowany w 4% paradehydzie w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.

Barwienie hematoksylyną i eozyną

Sekcje parafiny rdzenia kręgowego umieszczono w piekarniku o temperaturze 60 °C na 30 minut. Odwoskowanie: ksylen I przez 15 minut, następnie ksylen II przez 15 minut. Rehydratacja: Traktowane 100% etanolem przez 2 minuty, potem 95% etanolem przez 2 minuty, następnie 80% etanolem przez 2 minuty, a następnie 70% etanolem przez 2 minuty, I na koniec destylowaną wodę przez 5 minut. Barwienie hematoksyliną trwało 7 minut, po czym spłukano wodą destylowaną, aby usunąć resztki roztworu barwienia. Przez 3 sekundy przeprowadzono różnicowanie w 1% alkoholu kwasu solnego, po czym płukano wodą destylowaną w celu usunięcia resztek roztworu barwiącego. Przez 2 minuty wykonano niebieszczące roztwór z 5% amoniaku, po czym zmywano resztki roztworu niebieszczącego. Wykonano barwienie eozyną przez 30 sekund, a następnie płukano wodą destylowaną, aby usunąć resztki roztworu barwiącego. Odwodnienie sekcji odbywało się 70% etanolem przez 10 sekund, potem 80% etanolem przez 10 sekund, a na końcu 100% etanolem przez 30 sekund. Oczyszczanie odbyło się przez 5 minut traktowanie ksylenem. Po montażu slajdy były suszone na powietrzu, a zdjęcia wykonywano po wyschnięciu.

Szybkie niebieskie barwienie Luxol

Fragmenty były odwoskowane 2 razy ksylenem przez 10 minut każda, następnie barwione roztworem mielinowym LFB i inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia nadmiar roztworu barwiącego usunięto za pomocą 90% etanolu. Sekcje były rozróżniane w roztworze różniczkowym Luxol przez 10 sekund (C0631S), po czym przez 30 sekund zanurzono w etanolu 75% aż istota szara stała się przezroczysta. Na koniec sekcje były barwione roztworem eozynowym przez 1 minutę.

Western blotting

Próbki białka gotowano w wodzie przez 5 minut. Łącznie 5 μL markera białkowego najpierw załadowano do żelu elektroforezy, a następnie kolejno załadowano próbki białka testowego. Elektroforeza była rozpoczęta przy napięciu 80 V, aż pasma markerów zostały wyraźnie rozdzielone, po czym napięcie wzrosło do 130 V i utrzymywało się do zakończenia elektroforezy. Wcześniej wycięte membrany PVDF były aktywowane w metanolu przez 1 minutę, następnie umieszczane na papierze filtracyjnym i nakładane przygotowanym żelem. Transfer białka przeprowadzono przy stałym prądzie 300 mA, z czasem transferu dostosowanym do masy cząsteczkowej (± 10 min). Po transferze membrana PVDF była umieszczana w pudełku inkubacyjnym, płukana buforem TBST przez 5 minut, a następnie blokowana 5% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej na shakerze przez 2 godziny. Następnie błona była myta 3 razy buforem TBST przez 5 minut przed inkubacją z pierwotnymi przeciwciałami, w tym GAPDH (1:2000), Tubulin (1:2000), NRG1 (1:1000), ErbB4 (1:1000) i MBP (1:1000), przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym potrząsaniem. Następnego dnia błona była myta 3 razy buforem TBST przez 5 minut każda, a następnie inkubowana z przeciwciałem wtórnym, kozim antykrólikiem (1:4000), w temperaturze pokojowej na shakerze przez 2 godziny. Po myciu TBST zobrazowano pasma białkowe za pomocą chemiluminescencji. Zaimportuj obraz WB do oprogramowania ImageJ i wykonaj odejmowanie tła z użyciem promienia toczącej się kuli 50 pikseli. W przypadku przechylonych pasów użyj narzędzia Segmented Line, aby je wyprostować. Użyj narzędzia Prostokąt, aby wybrać docelowe pasma i wygenerować profil gęstości, wybierając Plot Lanes , aby zwizualizować wartości pasm w skali szarości. Użyj narzędzia Magic Wand, aby segmentować szczyty i wyodrębnić wartości w skali szarości. Po zapisaniu danych użyj oprogramowania GraphPad Prism do tworzenia wykresów słupkowych.

Immunofluorescencja

Sekcje parafiny były odwoskowane 2 razy ksylenem przez 10 minut każda, a następnie nawodnione przez serię z ethanolem stopniowym. Pobieranie antygenów przeprowadzano przez gotowanie fragmentów w roztworze kwasu cytrynowego 5% przez 15 minut, a następnie blokowanie za pomocą 10% surowicy koziej przez 2 godziny. Następnie sekcje były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z następującymi głównymi przeciwciałami: myszym monoklonalnym NRG-1 (1:200), króliczym monoklonalnym ErbB4 (1:300) oraz ludzkim monoklonalnym MBP (1:300). Po trzech płukaniach solą fizjologiczną z buforem fosforanowym zawierającą 0,1% Triton X-100 (PBST) przez 10 minut każda, sekcje były inkubowane przez 1 godzinę w ciemności z następującymi przeciwciałami wtórnymi: FITC-znakowanym anty-mysim IgG (1:500), FITC-znakowanym anty-króliczym IgG (1:500) oraz FITC-znakowanym anty-ludzkim IgG dla kóz (1:500). Sekcje były myte 3 razy PBST przez 10 minut każda, następnie mocowane i montowane odczynnikiem antyfade, aby zachować sygnały fluorescencyjne. Zjeżdżalnie przechowywano w temperaturze 4 °C w ciemności. Po umieszczeniu komórek docelowych pod obiektywem 10x za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, przejdź na soczewkę 40x, aby uchwycić obraz fluorescencyjny.

Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

Primery dla ErbB4 oraz referencyjnego genu GAPDH zostały zaprojektowane na podstawie strony internetowej NCBI. Sekwencje zapalników były następujące: ErbB4 przedni zapalnik: ACAGCCCTCCCTGCCTAC; ErbB4 odwrotny spłonnik: ATCTCAGCCGTTGCACCCT; GAPDH przedni podręcznik: CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; GAPDH odwrotny podkład: TACGCCAAATCCGTTCACA. Tkanka rdzenia kręgowego wielkości soi została umieszczona w rurce wirówki o pojemności 1,5 mL, a następnie dodano 600 μL całkowitego odczynnika do ekstrakcji RNA. Tkanka była dokładnie ujednoliczona i inkubowana na lodzie przez 5 minut, po czym nastąpiła wirówka w 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant został przeniesiony do nowej rurki o pojemności 1,5 mL, a następnie dodano 400 μL chloroformu. Mieszanka była dokładnie wymieszana i wirowana w 12 000 x g przez 5 minut w 4 °C. Supernatant został ponownie przeniesiony do nowej lampy, a dodano 400 μL izopropanolu. Roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przez 10 minut wirowano w 12 000 x g . Supernatant został odrzucony, a pellet RNA został przemyty 400 μL 75% etanolu. Po wirowaniu w temperaturze 7 500 x g przez 5 minut w 4 °C, supernatant został odrzucony, a rurka została odwrócona, aby wyschnąć na czystej powierzchni. Pellet RNA rozpuszczono w 60 μL wody wolnej od RNA, dokładnie wymieszano, a stężenie RNA zmierzono. Czystość i stężenie RNA zostały zarejestrowane poprzez pomiar absorpcji na 260 nm i 280 nm, co zapewniło, że stosunek 260/280 wynosi około 2,0. Do syntezy cDNA dokładnie wymieszano Reakcję 1 (zawierającą gDNA Eraser itp.) oraz Reakcję 2 (zawierającą odwróconą transkryptazę itp.) i inkubowano ją w temperaturze 95 °C przez 15 minut. System reakcji PCR z fluorescencją został przygotowany zgodnie z instrukcjami zestawu syntezy cDNA. Do 23 μL mieszaniny reakcji PCR dodano próbkę o pojemności 2 μL, a amplifikacja przeprowadzono zgodnie z protokołem ilościowego zestawu PCR z fluorescencją. Temperatura wyżarzania została ustawiona na 60 °C, a warunki wzmacniania były następujące: Przeddenaturacja: 95 °C przez 30 s, 1 cykl; Reakcja PCR: 95 °C przez 3 s, 60 °C przez 30 s, 40 cykli; Analiza krzywej dysocjacji została przeprowadzona następująco: 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 30 s, a następnie stopniowy wzrost od 60 °C do 95 °C przy ciągłym pozyskiwaniu sygnału fluorescencyjnego. Wartości CT zmierzono i obliczono za pomocą oprogramowania komputerowego Bio-Rad, a względne poziomy mRNA określono metodą 2-ΔΔCt .

Zasady bezpieczeństwa i obsługi

Utrwalanie paraformaldehydu: Używaj paraformaldehydu wyłącznie w dobrze wentylowanym okapie wyparowym. Zawsze noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), w tym maseczkę, rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz gogle ochronne. Przechowuj roztwór paraformaldehydu w szczelnie zamkniętym pojemniku, z dala od bezpośredniego światła słonecznego i źródeł ciepła. Odpady z paraformaldehydu utylizuj zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa laboratoryjnego Uniwersytetu Medycznego w Kunming, umieszczając je w pojemniku na odpady niebezpieczne.

Rozwiązanie DMSO: DMSO może być wchłaniane przez skórę i przenikać do organizmu. Podczas obchodzenia się z osobami osobistymi noś osobistą, w tym rękawiczkami i okularami ochronnymi. Przechowuj DMSO w szczelnym pojemniku w temperaturze pokojowej, z dala od silnych środków utleniaczych. Odpady DMSO uwalniają zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa laboratoryjnego Uniwersytetu Medycznego w Kunming, umieszczając je w pojemniku na odpady niebezpieczne.

Znieczulenie pentobarbitalowe: Pentobarbital jest substancją kontrolowaną i powinien być stosowany wyłącznie przez upoważnione osoby. Unikaj przypadkowego narażenia podczas manipulacji i zapewnij odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Noś odpowiedni sprzęt ochronny. Pentobarbital przechowywać w zamkniętej szafce w temperaturze pokojowej, pod nadzorem upoważnionych pracowników. Utylizacja odpadów pentobarbitalowych zgodnie z wytycznymi Kunming Medical University dotyczącymi substancji kontrolowanych, zapewniając prawidłowe zezwolenia na stosowanie i procedury utylizacji odpadów.

Ogólna utylizacja odpadów: Wszystkie niebezpieczne chemikalia i odczynniki muszą być utylizowane zgodnie z wytycznymi zarządzania laboratorium Kunming Medical University. Upewnij się, że wszystkie odpady są odpowiednio oznaczone i umieszczone w odpowiednich pojemnikach dla bezpiecznej utylizacji.

Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach lub więcej. Wartości gęstości pasmowej białek docelowych zostały znormalizowane do wartości grupy kontrolnej, aby ułatwić porównania między grupami. Dane przedstawiane są jako mediana (zakres interkwartylowy) lub średnia ± odchylenie standardowe, gdzie n oznacza liczbę szczurów. Dla danych o normalnym rozkładzie istotne różnice między grupami oceniono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Dla danych o nienormalnym rozkładzie zastosowano test Kruskala-Wallisa H do porównania grup. Istotność statystyczna została ustalona na p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Barwienie H&E oraz ocena BBB wykazują ochronne działanie EA dla szczurów z rdzeniem mózgowym

Barwienie H&E wykorzystano do badania morfologii i struktury tylnych komórek rogów rdzenia kręgowego (Rysunek 2D). Wyniki H&E wykazały, że w grupie S tylne komórki rogów były starannie ułożone, z wyraźnie zdefiniowanymi konturami komórek i centralnie rozmieszczonymi jądrami. Dla porównania, liczba tylnych komórek rogowych w grupie M została zmniejszona, z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to wykazuje, że leczenie EA łagodzi kawitację rdzenia kręgowego i demielinizację po zranieniu rdzenia kręgowego, wspierając remielinizację poprzez zwiększenie ekspresji białka MBP, a w konsekwencji poprawia funkcję ruchową kończyn tylnych u szczurów. Ponadto zidentyfikowaliśmy szlak sygnalizacyjny NRG-1/ErbB4 jako kluczowy mediator remielinizacji neuronów oraz potencjalny mechanizm terapeutyczny, dzięki któremu EA wspiera remielinizację i regenerację funkcji ruchowej kończyn tylnych u szczurów z rdzeniem rdzeniow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy autorom za ich wkład w to badanie. Badanie to zostało finansowo wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 81960817, 82260387) oraz Specjalny Program Badań Podstawowych Planu Nauki i Technologii Prowincji Yunnan (202301AS070020). Projekt Naukowo-Badawczo-rozwojowy Północnego Syczuan Medical College (CBY22-QNA20)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do wykrywania białek BCA Beyotime BiotechnologyP0012SAnaliza ilościowa białek
Urządzenie elektroakupunkturyInstrument do elektroakupunktury Huatuo, SDZ-V, Suzhou—Sprzęt terapeutyczny
IgG anty-ludzki dla koz oznaczony FITCBeyotimeA0556Fluorescencyjne przeciwciało wtórne
IgG dla kóz oznaczonych FITCBeyotimeA0568Fluorescencyjne przeciwciało wtórne
IgG antykrólikowy z oznaczeniem FITCBeyotimeA0562Fluorescencyjne przeciwciało wtórne
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus——
Ludzki monoklonalny MBPAbcamab209328Przeciwciało specyficzne
Roztwór mielinowy LFBSolarbioG3240Barwienie osłonki mielinowej
Millipore ECLMilliporeWBKLS0100Odczynniki detekcyjne
Myszy monoklonalny NRG-1  Santa CruzSC-57384Przeciwciało specyficzne
Nanodrop ND-1000LabTech—
NRG1-1 betaNovoprotein Technology CoC753Rekombinowana ludzka NRG1-1 beta
PD158780Technologia GlpBioGC15925Inhibitor tyrozyny receptora czynnika wzrostu naskórnego (EGFR)
Przewód PE-10Becton, Dickinson and Company427401Iniekcja downętrzna
Penicylina sodowa do zastrzykówHarbin Zhongjing Biotechnology Co80451182Pooperacyjna terapia przeciwinfekcyjna
Królik monoklonalny ErbB4Abcamab109273Przeciwciało specyficzne
Zestaw RNAiso PlusTakara9109Odczynniki RT-PCR
Zestaw do odczynników RTTakaraRR037AOdczynniki RT-PCR
Przeciwciało wtórneBeyotime Biotechnology—Przeciwciało specyficzne
Pentobarbital soduSigma-Aldrich69020100Znieczulenie zwierząt
Klips tętniaka YasargilaRebstock Instruments GmbH—Konstrukcja modelu urazu rdzenia kręgowego szczura

Bibliografia

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
  3. Anjum, A., et al. Spinal Cord Injury: Pathophysiology, Multimolecular Interactions, and Underlying Recovery Mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  4. Fang, M., Chen, L., Tang, T., Qiu, M., Xu, X. The committed oligodendrocyte precursor cell, a newly-defined intermediate progenitor cell type in oligodendroglial lineage. Glia. 71 (11), 2499-2510 (2023).
  5. Hellenbrand, D. J., et al. Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. J Neuroinflammation. 18 (1), 284(2021).
  6. Pukos, N., et al. Chronic demyelination and myelin repair after spinal cord injury in mice: A potential link for glutamatergic axon activity. Glia. 71 (9), 2096-2116 (2023).
  7. Birch, S., Robinson, N. Acupuncture as a post-stroke treatment option: A narrative review of clinical guideline recommendations. Phytomedicine. 104, 154297(2022).
  8. Jiang, K., Sun, Y., Chen, X. Mechanism Underlying Acupuncture Therapy in Spinal Cord Injury: A Narrative Overview of Preclinical Studies. Front Pharmacol. 13, 875103(2022).
  9. Wang, X., et al. Electroacupuncture at Dazhui (GV14) and Mingmen (GV4) protects against spinal cord injury: the role of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Neural Regen Res. 11 (12), 2004-2011 (2016).
  10. Li, S. S., et al. Electroacupuncture treatment improves motor function and neurological outcomes after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural regen res. 17 (7), 1545-1555 (2022).
  11. Liu, C., et al. Electroacupuncture promotes oligodendrocyte differentiation and myelin repair in a rat model of vascular dementia: Investigation of the mechanism from NF-κB-mediated inflammation. Neuroscience. 572, 21-34 (2025).
  12. Tong, T., et al. Electroacupuncture ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and cognitive impairment through suppressing oxidative stress and neuroinflammation in rats. Brain Res Bull. 206, 110838(2024).
  13. Ahn, S. M., et al. Electroacupuncture ameliorates memory impairments by enhancing oligodendrocyte regeneration in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion. Sci Rep. 6, 28646(2016).
  14. Kong, Y., Yang, J., Fan, Y. Q., Wang, W. S., Zhang, Y. T. "Huayu Tongluo" moxibustion improves learning-memory ability and promotes myelin regeneration by regulating Sonic Hedgehog signaling pathway in vascular dementia rats. Zhen Ci Yan Jiu. 48 (6), 578-584 (2023).
  15. Chen, W. C., et al. Influence of electroacupuncture of Dazhui (EX-B2) and Mingmen (GV4) on NR2B expression in anterior horns of spinal cord in rats with acute spinal cord injury. Zhen Ci Yan Jiu. 44 (2), 95-101 (2019).
  16. Mei, L., Nave, K. A. Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases. Neuron. 83 (1), 27-49 (2014).
  17. Birchmeier, C., Bennett, D. L. Neuregulin/ErbB Signaling in Developmental Myelin Formation and Nerve Repair. Curr Top Dev Biol. 116, 45-64 (2016).
  18. Chen, S., et al. Neuregulin 1-erbB signaling is necessary for normal myelination and sensory function. J Neurosci. 26 (12), 3079-3086 (2006).
  19. Bartus, K., et al. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury. Glia. 67 (6), 1036-1046 (2019).
  20. Tao, F., et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem cells. 31 (1), 83-91 (2013).
  21. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  22. Wan, C., et al. Neuregulin1-ErbB4 Signaling in Spinal Cord Participates in Electroacupuncture Analgesia in Inflammatory Pain. Front Neurosci. 15, 636348(2021).
  23. Tseropoulos, G., et al. Immobilized NRG1 Accelerates Neural Crest like Cell Differentiation Toward Functional Schwann Cells Through Sustained Erk1/2 Activation and YAP/TAZ Nuclear Translocation. Adv Sci (Weinh). 11 (33), e2402607(2024).
  24. Luo, M., et al. Neuronal activity-dependent myelin repair promotes motor function recovery after contusion spinal cord injury. Brain Res Bull. 166, 73-81 (2021).
  25. Hesp, Z. C., Goldstein, E. Z., Miranda, C. J., Kaspar, B. K., McTigue, D. M. Chronic oligodendrogenesis and remyelination after spinal cord injury in mice and rats. J Neurosci. 35 (3), 1274-1290 (2015).
  26. Levy, G., et al. Gtf2i-encoded transcription factor Tfii-i regulates myelination via Sox10 and Mbp regulatory elements. Nat Commun. 16 (1), 8518(2025).
  27. Cescon, M., et al. Gut microbiota depletion delays somatic peripheral nerve development and impairs neuromuscular junction maturation. Gut Microbes. 16 (1), 2363015(2024).
  28. Ayar, Z., et al. The effect of low-level laser therapy on pathophysiology and locomotor recovery after traumatic spinal cord injuries: a systematic review and meta-analysis. Laser Med Sci. 37 (1), 61-75 (2022).
  29. Ghane, N., Beigi, M. H., Labbaf, S., Nasr-Esfahani, M. H., Kiani, A. Design of hydrogel-based scaffolds for the treatment of spinal cord injuries. J Mater Chem B. 8 (47), 10712-10738 (2020).
  30. Laskin, J. J., Waheed, Z., Thorogood, N. P., Nightingale, T. E., Noonan, V. K. Spinal Cord Stimulation Research in the Restoration of Motor, Sensory, and Autonomic Function for Individuals Living With Spinal Cord Injuries: A Scoping Review. Arch Phys Med Rehabil. 103 (7), 1387-1397 (2022).
  31. Li, G., et al. Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes Motor Functional Recovery by Enhancing Oligodendrocyte Survival and Differentiation and by Protecting Myelin after Spinal Cord Injury in Rats. Neurosci Bull. 36 (4), 372-384 (2020).
  32. Csomó, K. B., et al. A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats. J Vis Exp. (181), e63534(2022).
  33. Li, J. J., et al. Animal Models for Treating Spinal Cord Injury Using Biomaterials-Based Tissue Engineering Strategies. Tissue eng part b-re. 28 (1), 79-100 (2022).
  34. Coman, I., Barbin, G., Charles, P., Zalc, B., Lubetzki, C. Axonal signals in central nervous system myelination, demyelination and remyelination. J Neurol Sci. 233 (1-2), 67-71 (2005).
  35. Inouye, H., Kirschner, D. A. Evolution of myelin ultrastructure and the major structural myelin proteins. Brain Res. 1641 (Pt A), 43-63 (2016).
  36. Chen, X., Li, H. Neuronal reprogramming in treating spinal cord injury. Neural Regen Res. 17 (7), 1440-1445 (2022).
  37. Huang, S., et al. Protective Effect of Electroacupuncture on Neural Myelin Sheaths is Mediated via Promotion of Oligodendrocyte Proliferation and Inhibition of Oligodendrocyte Death After Compressed Spinal Cord Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1870-1881 (2015).
  38. Kang, Z., et al. Electroacupuncture promotes regeneration and repair of myelin sheath of corpus callosum in demyelination mice. Zhen Ci Yan Jiu. 45 (1), 1-7 (2020).
  39. Zhu, K., et al. Electroacupuncture Promotes Remyelination after Cuprizone Treatment by Enhancing Myelin Debris Clearance. Front Neurosci. 10, 613(2017).
  40. Lu, J. Y., et al. Effects of electroacupuncture at different acupoints on the histomorphology of neurogenic bladder and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels in interstitial cells of Cajal in a rat model of suprasacral spinal cord injury. Ann Palliat Med. 9 (6), 3830-3838 (2020).
  41. Tu, W. Z., et al. The regulatory effect of electro-acupuncture on the expression of NMDA receptors in a SCI rat model. Life Sci. 177, 8-14 (2017).
  42. Ding, Z., et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 134, 111168(2021).
  43. Kataria, H., et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia. 66 (3), 538-561 (2018).
  44. Schmitd, L. B., et al. Deletion of murine Sarm1 results in a microenvironment that delays peripheral nerve regeneration after injury. Sci Transl Med. 17 (819), eadp9155(2025).
  45. Hu, X., et al. Pan-ErbB inhibition impairs cognition via disrupting myelination and aerobic glycolysis in oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (45), e2405152121(2024).
  46. Størkson, R. V., Kjørsvik, A., Tjølsen, A., Hole, K. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods. 65 (2), 167-172 (1996).
  47. Rahimi-Movaghar, V., Jazayeri, S. B. When do we start Basso, Beattie, and Bresnahan assessment after experimental spinal cord injury. Acta Med Iran. 51 (8), 5183(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

leczenie elektroakupunkturąregeneracja nerwówpodstawowe białko mielinyfunkcja kończyn tylnychpunkty akupunkturyegzogenny NRG1szlak sygnałowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.