Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

405 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69258

⸱

13 marca 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Streszczenie

Protokół ten określa kompleksową, wolną od oznakowania platformę, która integruje spektroskopię Ramana wspomaganą powierzchnią (SERS) z uczeniem maszynowym (ML) w celu wykrywania i molekularnego profilowania pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) w zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych. Metoda rozpoczyna się od izolacji sEV za pomocą chromatografii wykluczenia rozmiaru lub ultrawirowania. Następnie izolowane pęcherzyki są analizowane na inżynieryjnie zaprojektowanych podłożach 2D z plazmoniczną nanopiramidą złota, zdolnych do czułości pojedynczych pęcherzyków. Wykorzystując wewnętrzne biochemiczne odciski palców Ramana, protokół umożliwia wykrywanie wysokiej swoistości bez zewnętrznych etykiet. Po akwizycji widmowej dane przechodzą wstępne przetwarzanie i są analizowane za pomocą wytrenowanych algorytmów uczenia maszynowego (np. LDA, SVC) w celu klasyfikacji stanów chorobowych, skutecznie odróżniając raka żołądka od zdrowych kontrolnych za pomocą EV z tkanek, osocza i śliny o odpowiedniej dokładności klasyfikacji 90,1%, 70,9% i 60,7%. Dodatkowo jego zastosowanie terapeutyczne wykazuje ilościowe określenie obciążenia doksorubicyną w pojedynczych sEV, co jest rozszerzone o zastosowanie podłoża pokrytych grafenem jako standardu wewnętrznego. Takie podejście umożliwia analizę wysokoprzepustową, która obejmuje heterogeniczność populacji niezbędną do wczesnego wykrywania chorób i zrozumienia efektywności ładowania leków na poziomie pojedynczych pęcherzyków.

Wprowadzenie

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV), zwykle o średnicy od 30 do 200 nm, są naturalnie wydzielane przez komórki do płynów biologicznych i przenoszą białka, lipidy oraz kwasy nukleinowe wskazujące na ich komórkę pochodzenia 1,2,3. Ponieważ nieinwazyjne biomarkery obecne w ślinie, moczu i innych płynach ustrojowych4, mają nadzieję na wczesną diagnozę, rokowanie i monitorowanie terapeutyczne, zwłaszcza w onkologii 5,6,7. Jednak ich tłumaczenie kliniczne jest utrudnione przez wysoką heterogeniczność i niską częstość w złożonych macierzach biologicznych8. Aby pokonać takie wyzwania, protokół wykorzystuje powierzchniowo wzmocnioną spektroskopię Ramana (SERS), potężną metodę analityczną zdolną do wzmocnienia rozpraszania Ramana do 1010-10 razy11 razy za pomocą substratówplazmonicznych 9, 10, 11. SERS rejestruje wewnętrzne molekularne widma "odciska palca" poszczególnych sEV w ciągu kilku sekund, umożliwiając ultraczułą analizę pojedynczych pęcherzyków i unikając długich czasów analizy.

Nasza metoda synergicznie łączy SERS oparte na bezoznakowaniu, aby uzyskać szybką, ultraczułą charakterystykę poszczególnych sEV 12,13,14,15,16. Bezoznakowy SERS rejestruje wewnętrzne sygnatury biochemiczne i w połączeniu z modelami uczenia maszynowego, takimi jak LDA, SVC, wykazano, że rozróżnia sEV pochodzące ze zdrowych od chorych komórek o wysokiej swoistości13. Aby jeszcze bardziej zwiększyć powtarzalność i możliwości ilościowe naszej platformy, nasza metoda jest w pełni kompatybilna z podłożami Ramana pokrytymi grafenem16. Grafen jednowarstwowy zapewnia chemicznie jednolitą powierzchnię, która stabilizuje gorące punkty plazmoniczne i zwiększa adsorpcję molekularną17,18, a co ważniejsze, grafen jednowarstwowy pełni funkcję "wbudowanego" wskaźnika sygnałów SERS12,19, umożliwiając kwantyfikację wykrytych cząsteczek. Pomimo że średnica wiązki lasera Ramana (~ 1 μm) jest większa niż typowy sEV, nasza platforma osiąga efektywną rozdzielczość pojedynczych pęcherzyków dzięki unikalnej interakcji mechanizmów fizycznych i statystycznych. Quasi-periodyczne złote nanopiramidalne podłoże generuje silnie zlokalizowane plazmoniczne "gorące punkty" o rozmiarach mniejszych niż 100 nm, które wzmacniają sygnały Ramana w sposób super liniowy12. W rezultacie sygnał z sEV, stochastycznie najbliższy najintensywniejszemu gorącemu punktowi w wiązce, dominuje w widmie. Dodatkowo, obrazowanie SEM potwierdza, że sEV są dobrze rozmieszczone (> 1 μm), minimalizując nakładanie się spektralne, podczas gdy mapy intensywności Ramana ujawniają lokalizację sygnału odpowiadającą rozmiarowi pojedynczych pęcherzyków13,14. Te cechy razem zapewniają, że każde zebrane widmo odpowiada głównie pojedynczemu sEV, umożliwiając statystycznie solidną, wolną od etykiet analizę pojedynczych pęcherzyków. W porównaniu z konwencjonalnymi podejściami, takimi jak western blot, spektrometria mas czy zwykłe rozpraszanie Ramana, które wymagają dużych objętości próbek i nie rozstrzygają pojedynczych pęcherzyków20, nasza platforma SERS z pojedynczym pęcherzykiem oferuje wyższą czułość, przepustowość i rozdzielczość cząsteczkową. Ten workflow jest odpowiedni dla badaczy dążących do opracowania minimalnie inwazyjnych, wysokorozdzielczych narzędzi diagnostycznych lub badania heterogeniczności sEV i efektywności ładowania leków w indywidualnych badaniach terapeutycznych. W tym protokole pokazujemy, jak nasza platforma SERS wykorzystuje pojedyncze sEV do wykrywania chorób i zastosowań terapeutycznych, szczególnie w przypadku nowotworów, w tym cały proces izolacji pęcherzyków, przygotowania substratu plazmonicznego (substrat), pozyskiwania Ramana oraz analizy danych z użyciem uczenia maszynowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zbieranie próbek ludzkich przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) UCLA. Wszyscy dawcy udzielili pisemnej świadomej zgody przed udziałem w badaniu.

UWAGA: W tym badaniu użyto łącznie 4 linii komórkowych: AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), wszystkie zakupione od komercyjnego dostawcy. Linie te były hodowane i przekazywane ściśle zgodnie z instrukcjami i odczynnikami dostawcy. Przygotowane media były zbierane i przechowywane w temperaturze -20 °C przed przetworzeniem. W Samsung Medical Center w Korei dawcy dobrowolnie przekazali próbki tkanek, osocza i śliny. Tkanka raka żołądka została pobrana podczas resekcji chirurgicznej, natomiast biopsje od kontrolnych osób nienowotworowych wykonano za pomocą endoskopii . Osocze pobierano w probówkach EDTA zgodnie ze standardowymi protokołami klinicznymi. Od każdego uczestnika pobrano około 5 ml niestymulowanej pełnej śliny, a następnie wirowano w dawce 2 600 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Aby zachować RNA zewnątrzkomórkowe, supernatant został uzupełniony inhibitorem RNazy SUPERase-In w dawce 20 U/mL. Wszystkie okazy przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania. sEV izolowano z podłoża kondycjonowanego i próbek klinicznych zgodnie z ustalonymi protokołami21.

1. izolacja i charakterystyka sEV

  1. Przygotuj próbki sEV
    1. Całkowicie rozmroz oczyszczony supernatant hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej.
    2. Przepuszcz supernatant przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm, aby usunąć zanieczyszczenia i większe zanieczyszczenia.
    3. Wyrównaj kolumnę chromatografii wykluczenia rozmiaru (SEC) o średnicy 35 nm roztworem PBS o pojemności 1×.
    4. Nałóż 500 μL przefiltrowanej próbki do kolumny.
    5. Elutuj próbkę 1x PBS zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Zbieraj frakcje wzbogacone EV i przechowuj je w czystych fiolkach w temperaturze −20 °C.
  2. Określ stężenie i rozmiar cząstek
    1. Rozcieńcz próbki sEV w sterylnym DPBS do końcowego stężenia cząstek 107-10 9 cząstek/mL.
    2. Za pomocą narzędzia do analizy śledzenia nanocząstek nagrywaj pięć filmów na próbkę w ciągu 60 sekund. Użyj poziomu kamery 14 i stałego przepływu 25.
    3. Przeanalizuj filmy za pomocą oprogramowania instrumentu, stosując współczynnik rozcieńczania do określenia końcowego stężenia cząstek (cząstek/mL) i średniej średnicy (nm).
  3. Charakteryzacja ekspresji tetraspaniny
    1. Wstępne skanowanie ludzkich chipów tetraspaniny (1 cm × 1 cm, wcześniej powlekane anty-CD9, anty-CD63 i anty-CD81), aby ustalić sygnał bazowy.
    2. Załaduj rozcieńczone próbki sEV na układy scalone w szczelnej 24-dołowej płycie i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
    3. Dodaj 35 μL przeciwciał wykrywających (anty-CD9 CF488, anty-CD63 CF647, anty-CD81 CF555) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Myj chipy zgodnie z protokołem producenta.
    5. Mierz ekspresję tetraspaniny pęcherzykowej za pomocą czytnika do charakteryzacji biomarkerów oraz powiązanego oprogramowania skanującego.
  4. Potwierdź morfologię sEV za pomocą TEM
    1. Napraw ~100 μL sEV z ~100 μL 4% paraformaldehydu przez 30 minut.
    2. Załaduj około 100 μL stałych sEV na siatki miedziane o rozmiarze 300 siatek i inkubuj przez 5 minut.
    3. Przepłucz kratki wodą dejonizowaną.
    4. Barw kratki roztworem 1% octanu uranylu (~ 20 μL) w wodzie destylowanej.
    5. Wykonaj ostatnie płukanie wodą i pozwól kratownicom całkowicie wyschnąć na powietrzu.
    6. Zrób obrazowanie próbek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), aby potwierdzić rozmiar i morfologię sEV.

2. Plazmoniczna produkcja podłoża SERS 12,18,19

  1. Stwórz nanosferę monowarstwową
    1. Rozłóż kule polistyrenowe o średnicy 500 nm na powierzchni wody w korycie Langmuir-Blodgett.
    2. Delikatnie skompresuj kule, tworząc gęsto upakowaną sześciokątną monowarstwę.
    3. Przenieś monowarstwę sfery na płytkę Si o średnicy 4 cali (z ~50 nm termicznym SiO2), zanurzając płytkę w żłobie i powoli ją wyciągając w górę.
  2. Trawienie matrycy nanosfer
    1. Zmniejszyć średnicę sfery z 500 nm do ~250 nm za pomocą systemu trawienia jonów reaktywnych z plazmą tlenową (przepływ gazuO2 przy 100 sccm, 50 s, moc 200 W). Więcej szczegółów dotyczących procesu produkcji można znaleźć w publikacji z naszych wcześniejszych prac 12,18,19.
    2. Nałóż warstwę Cr o średnicy 50 nm na zmniejszoną matrycę kul poprzez odparowanie wiązką elektronów z prędkością 1,5 Å na sekundę.
    3. Zdejmij kule z polistyrenu za pomocą acetonu, aby pozostawić perforowaną maskę Cr na powierzchniSiO 2 .
    4. Trawić odsłoniętą warstwę SiO2 w otworach Cr za pomocą mieszanki 25 sccm AR, 25 sccm CHF3, z mocą RIE 200W przez 2 minuty.
  3. Wytwarzaj odwrócone piramidy
    1. Zanurz płytkę w 60% masy KOH w 60 °C na 2 minuty, aby wytrawić odwrócone piramidalne dołki w krzemie.
    2. Zdejmij maskę Cr za pomocą trawiciela Cr na 5 minut.
    3. Usuń warstwęSiO 2 w temperowanym tleczku 6:1 do całkowitego wytrawienia.
    4. Naniesie warstwę Au o średnicy 200 nm konformnie nad odwróconymi piramidami, stosując parowanie wiązką elektronów.
  4. Finalizacja substratu plazmonicznego
    1. Nałóż szybko utwardzający epoksyd (~1 mL) na osobny substrat SiO2/Si. Naciśniesz płytkę pokrytą złotem na epoksyd, aby utworzyć strukturę kanapkową z warstwą złota pośrodku.
    2. Po całkowitym utwardzeniu epoksydu oderwij epoksyd od formy krzemowej, aby utworzyć wolnostojące podłoże plazmoniczne Au.

3. Transfer grafenu na podłoże plazmoniczne

  1. Przygotuj film grafenowy
    1. Przygotuj roztwór FeCl3 o pojemności 1 M (1 M roztworu zapasowego bezwodnego chlorku żelaza przygotowano przez rozpuszczenie 81 g FeCl3 w wodzie dejonizowanej i rozcieńczenie do końcowej objętości 500 mL), aby trawić podłoże miedzi z monowarstwowej warstwy grafenu pokrytej PMMA.
    2. Umieść miedzianą pokrytą grafenem płytę ledwie do dołu na powierzchni roztworu FeCl3 , aż miedź całkowicie się rozpuści.
  2. Folia grafenowa do płukania
    1. Za pomocą czystej szklanej szkiełki ostrożnie przenieś unoszącą się warstwę grafenową do kąpieli wodnej dejonizowanej, aby spłukać pozostałości trawiciela.
    2. Powtórz ten krok płukania trzy razy.
  3. Transfer grafenu na podłoże
    1. Upływaj plazmoniczne podłoże SERS pod warstwą grafenową w końcowej kąpieli wodnej DI.
    2. Delikatnie podnieś podłoże, aby grafen równomiernie się ułożył na jego powierzchni.
    3. Suszenie podłoża pokrytego grafenem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Przelej go do komory próżniowej i susz pod obniżonym ciśnieniem w 180 °C przez 1 godzinę.
  4. Oczyść podłoże końcowe
    1. Zanurz wysuszone podłoże w kąpieli acetonowej w temperaturze 50 °C na godzinę, aby rozpuścić PMMA.
    2. Opłucz podłoże trzy razy alkoholem izopropylowym.
    3. Przed użyciem wysusz oczyszczone podłoże plazmoniczne przenoszone grafenem w suszarce.

4. Przygotowanie próbki SERS i pozyskiwanie widm

  1. Przygotuj próbkę na podłożu
    1. Pipety nałożą około 5 μL próbki sEV na odpowiedni substrat plazmoniczny.
      UWAGA: Aby ilościowo określić sEV obciążone lekami, należy zastosować pęcherzyki na podłoże złoto-grafenowe. Do wszystkich innych eksperymentów używaj zwykłego złotego podłoża plazmonowego.
    2. Włóż podłoże do osuszacza i pozwól kropli całkowicie wyschnąć (~15 min).
  2. Kalibruj system Ramana
    1. Przenieś podłoże do konfokalnego mikroskopu Ramana.
    2. Rozpocznij zbieranie danych za pomocą oprogramowania instrumentu (wersja WiRE 4.4).
    3. Ustaw laser wzbudzający na 785 nm przy 5 mW.
    4. Skalibruj system, ustawiając szczyt referencyjny krzemu do 520 cm-1.
  3. Pozyskiwanie widm ze złotego podłoża (diagnostyka)
    1. Wykonaj skanowanie rozpoznawcze na obszarze 300 μm × 300 μm, aby zlokalizować pojedyncze pęcherzyki w trybie statycznym i następujących ustawieniach: 50% mocy, 0,1 s ekspozycji, 10 μm kroku.
    2. Po zlokalizowaniu sEV wykonaj mapowanie wysokiej rozdzielczości w trybie statycznym w siatce 5 × 5, stosując następujące ustawienia: krok 1 μm, 50% mocy, 0,2 s ekspozycji na punkt.
  4. Pozyskiwanie widm z podłoża grafenowego (terapie)
    1. Wykonaj skanowanie rozpoznawcze na obszarze 300 μm × 300 μm, aby zlokalizować poszczególne pęcherzyki w trybie statycznym i następujących ustawieniach: 50% mocy lasera, ekspozycja 0,1 s, krok 10 μm.
    2. Wykonaj mapowanie w wysokiej rozdzielczości w trybie rozszerzonym z siatką 2 × 2, stosując następujące ustawienia: krok 1 μm, moc lasera 1%, ekspozycja 10 s.

5. Wstępne przetwarzanie danych

  1. Wykonywanie kontroli jakości widmowej
    1. Przesiewaj początkowe surowe widma, aby wykluczyć sygnały o silnym szumie lub widma o nieprawidłowych kształtach.
    2. Usuń izolowane skoki promieniowania kosmicznego za pomocą detekcji progowej lub filtrowania odchyleń lokalnych.
  2. Filtruj i normalizuj widma
    1. Zastosuj filtr Savitzky'ego-Golaya do każdego widma, aby zmniejszyć tło fluorescencyjne i wygładzić dane.
    2. Oblicz stosunek sygnału do szumu (SNR) każdego widma, zazwyczaj stosując stosunek szczytu do linii bazowej lub odchylenie standardowe. Aby wyjaśnić dokładniej, zazwyczaj SNR dla każdego widma obliczano jako stosunek maksymalnej intensywności (po odejmowaniu linii bazowej) w reprezentatywnym paśmie Ramana do odchylenia standardowego szumu. Szum oszacowano na podstawie resztkowego widma uzyskanego przez odejmowanie wygładzonej przez Savitzky'ego-Golaya wersji widma (rozmiar okna = 11, rząd wielomianów = 3) od oryginalnego widma, izolując tym samym fluktuacje wysokoczęstotliwościowe. Aby empirycznie określić odpowiedni próg SNR, wszystkie widma zostały uporządkowane rosnąco względem SNR oraz trwałości charakterystycznych pików biochemicznych – konkretnie pasma fenyloalaniny (~1002 cm-1 , aminokwas), pasma amidów I (~1650 cm-1 , białko) oraz pasma deformacji CH2 (~1440 cm-1 , lipid) oceniano w różnych spektrach rankingowych. Próg został ustawiony w momencie, w którym którykolwiek z tych diagnostycznych szczytów konsekwentnie znikał w szumie bazowym. Dla naszych parametrów podłoża i akwizycji SERS z nanopiramidą złota (wzbudzenie 785 nm, moc lasera 5 mW, całkość 0,2 s) empirycznie odpowiadało to progowi SNR wynoszącemu 28.
    3. Wyklucz wszelkie widma poniżej progu SNR zgodnie z 5.2.2 powyżej. W naszym procesie pracy widma o SNR poniżej 28 były wyłączane z zbioru danych treningowych, ponieważ ustalenie progu na tym poziomie gwarantuje, że do analizy dalszej i poprawy odporności modelu zachowane są wyłącznie widma wysokiej jakości.
    4. Normalizuj każde widmo do maksymalnej maksymalnej intensywności lub całkowitej powierzchni pod krzywą.

6. Analiza spektralna z użyciem uczenia maszynowego

  1. Trenuj Model
    1. Przypisz etykietę do każdego pomiaru spektralnego odpowiadającego jego pochodzeniu (np. pacjent z rakiem żołądka vs. zdrowa kontrola).
    2. Wprowadź dane spektralne do klasyfikatora wektorów wsparcia (SVC) z jądrem liniowym.
    3. Użyj podziału na stratyfikowane tasowanie do 5-krotnej walidacji krzyżowej.
    4. Uśrednij metryki dokładności z każdego fałdu, aby ocenić wydajność modelu.
  2. Zredukuj wymiarowość i sklasyfikuj
    1. Użyj Analizy Liniowej Dyskryminacyjnej (LDA) do wizualizacji wysokowymiarowych danych SERS w zredukowanych wymiarach.
    2. Do bezpośredniej klasyfikacji między grupami prób używaj modelu LDA.
  3. Ocena modelu
    1. Oceniaj wytrenowane modele na wytrwałym zestawie oślepionych próbek pacjentów, aby zasymulować rzeczywisty scenariusz diagnostyczny. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z publikacjami naszej grupy 13,15,22.
      UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj czystymi narzędziami w środowisku wolnym od kurzu. Monowarstwowy grafen był hodowany lub pozyskiwany na podłożu miedzianym i pokryty warstwą PMMA, aby chronić go podczas transferu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślna implementacja protokołu SERS dla pojedynczych pęcherzyków daje odrębne widma Ramana od poszczególnych sEV, co pozwala na dalszą diagnostyczną klasyfikację i monitorowanie obciążenia leków terapeutycznych. Rysunek 1 przedstawia sposób przeprowadzenia badania diagnostycznego raka żołądka oraz aplikacji monitorującej EV z użyciem leków z wykorzystaniem naszego protokołu opisanego tutaj, odpowiednio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowym elementem tego protokołu jest przygotowanie podłoża i oczyszczanie sEV. Wydajność SERS bez oznakowania zależy w dużej mierze od produkcji jednolitych, wysokokonforemnych podłoży plazmonicznych z silnym "gorącym punktem" wzmacniającym. Podobnie, izolacja sEV o wysokiej czystości za pomocą chromatografii z wykluczeniem rozmiaru jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych widm SERS. Zanieczyszczenia, takie jak agregaty białkowe czy lipoproteiny, nie tylko osłabiają sygnał pęcherzyka, ale takż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów związanych z tą pracą.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez National Center for Advancing Translational Sciences przy National Institutes of Health w ramach grantów 4UH3TR002978-03 i 1U18TR003778-01 oraz grantu od California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (grant numer TRAN1-14649).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
Siatka miedziana o rozmiarze 300 siatekNauki o mikroskopii elektronowejEMS200-Cu
4% roztwór paraformaldehyduSigma Aldrich1004960700
4″ Si wafle Zaopatrzenie MSEWA0810(100) zorientowany 
Linia komórkowa A549ATCCCCL-185 
Linia komórkowa AGSATCCCRL-1739
Wirnik wirówki F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/Parowanie wiązki elektrycznej
Roztwór trawiciela CrSigma Aldrich651826-500ML
Doksorubicyna  D-4000LC LaboratoriesD-4000_3g
System ExoView R100 i zestaw ExoView Human TetraspaninNanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
Rozwiązanie FeCl3Sigma Aldrich451649
Rozwiązanie HFSigma Aldrich695068-500ML
Linia komórkowa 738.St/Int HsATCCCRL-7869
wZa pomocą konfokalnego mikroskopu RamanaRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Rozwiązanie KOHSigma Aldrich417661
Shakery MaxQ 4000 Stołowe do inkubacji/chłodzeniaThermo ScientificSHKA4000 (4320)
Inkubator MCO-19AICSANYO8380-30-0035
Filtr Millex-GPMilliporeSigmaSLGPM33RS  0,22 & mikro; m
Mikroskop NanoSEM 230FEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/product-support
/nanosight-range/nanosight-ns300
Linia komórkowa NCI-N87ATCCCRL-5822
Optima TLX UltracentrifugaBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
products/rie/plasmapro-800-rie
Kule polistyrenoweAlfa AesarAA42711AB500 nm
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
Grafen jednowarstwowyZaopatrzenie MSEME0408
Kolba T-75VWR156800
TF20 EM o wysokiej rozdzielczościFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Roztwór octanu uraniluNauki o mikroskopii elektronowej22400-1

Bibliografia

  1. Van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (5), 369-382 (2022).
  2. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Möller, A., Lobb, R. J. The evolving translational potential of small extracellular vesicles in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (12), 697-709 (2020).
  5. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  6. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-347 (2011).
  7. Kahroba, H., Hejazi, M. S., Samadi, N. Exosomes: From carcinogenesis and metastasis to diagnosis and treatment of gastric cancer. Cell Mol Life Sci. 76 (9), 1747-1758 (2019).
  8. Ferguson, S. W., Nguyen, J. Exosomes as therapeutics: The implications of molecular composition and exosomal heterogeneity. J Control Release. 228, 179-190 (2016).
  9. Stiles, P. L., Dieringer, J. A., Shah, N. C., Van Duyne, R. R. Surface-enhanced Raman spectroscopy. Annu Rev Anal Chem. 1, 601-626 (2008).
  10. Jeon, T. Y., Kim, D. J., Park, S. G., Kim, S. H., Kim, D. H. Nanostructured plasmonic substrates for use as SERS sensors. Nano Converg. 3, 1-10 (2016).
  11. Nie, S., Emery, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  12. Wang, P., et al. Ultra-sensitive graphene-plasmonic hybrid platform for label-free detection. Adv Mater. 25 (35), 4918-4924 (2013).
  13. Liu, Z. R., et al. Gold nanopyramid arrays for non-invasive surface-enhanced Raman spectroscopy-based gastric cancer detection via sEVs. ACS Appl Nano Mater. 5 (9), 12506-12517 (2022).
  14. Jonak, S. T., et al. Analyzing bronchoalveolar fluid derived small extracellular vesicles using single-vesicle SERS for non-small cell lung cancer detection. Sens Diagn. 2 (1), 90-99 (2023).
  15. Liu, Z. R., et al. Label-free single-vesicle based surface enhanced Raman spectroscopy: A robust approach for investigating the biomolecular composition of small extracellular vesicles. PLoS One. 19 (6), e0304287(2024).
  16. Liu, J., et al. On the feasibility of SERS-based monitoring of drug loading efficiency in exosomes for targeted delivery. Biosensors (Basel). 15 (3), 198(2025).
  17. Ling, X., et al. Can graphene be used as a substrate for Raman enhancement. Nano Lett. 10 (2), 553-561 (2010).
  18. Wang, P., et al. Giant optical response from graphene-plasmonic system. ACS Nano. 6 (7), 6244-6249 (2012).
  19. Wang, P., et al. Label-free SERS selective detection of dopamine and serotonin using graphene-Au nanopyramid heterostructure. Anal Chem. 87 (20), 10255-10261 (2015).
  20. Qiu, L., et al. Current advances in technologies for single extracellular vesicle analysis and its clinical applications in cancer diagnosis. Biosensors (Basel). 13 (1), 60(2023).
  21. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. J Vis Exp. (170), e64102(2021).
  22. Li, T., et al. Label-free SARS-CoV-2 detection platform based on surface-enhanced Raman spectroscopy with support vector machine spectral pattern recognition. Eng Sci. 23, 862-870 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektroskopia ramanamałe pęcherzyki zewątkomórkoweizolacja sEVklasyfikacja uczeniem maszynowympodłoże plazmonicznemacierz nanopiramid złotapodłoże grafenoweładowanie doksorubicyną
Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.