Method Article

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

DOI:

10.3791/69258

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa kompleksową, wolną od oznakowania platformę, która integruje spektroskopię Ramana wspomaganą powierzchnią (SERS) z uczeniem maszynowym (ML) w celu wykrywania i molekularnego profilowania pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) w zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych. Metoda rozpoczyna się od izolacji sEV za pomocą chromatografii wykluczenia rozmiaru lub ultrawirowania. Następnie izolowane pęcherzyki są analizowane na inżynieryjnie zaprojektowanych podłożach 2D z plazmoniczną nanopiramidą złota, zdolnych do czułości pojedynczych pęcherzyków. Wykorzystując wewnętrzne biochemiczne odciski palców Ramana, protokół umożliwia wykrywanie wysokiej swoistości bez zewnętrznych etykiet. Po akwizycji widmowej dane przechodzą wstępne przetwarzanie i są analizowane za pomocą wytrenowanych algorytmów uczenia maszynowego (np. LDA, SVC) w celu klasyfikacji stanów chorobowych, skutecznie odróżniając raka żołądka od zdrowych kontrolnych za pomocą EV z tkanek, osocza i śliny o odpowiedniej dokładności klasyfikacji 90,1%, 70,9% i 60,7%. Dodatkowo jego zastosowanie terapeutyczne wykazuje ilościowe określenie obciążenia doksorubicyną w pojedynczych sEV, co jest rozszerzone o zastosowanie podłoża pokrytych grafenem jako standardu wewnętrznego. Takie podejście umożliwia analizę wysokoprzepustową, która obejmuje heterogeniczność populacji niezbędną do wczesnego wykrywania chorób i zrozumienia efektywności ładowania leków na poziomie pojedynczych pęcherzyków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV), zwykle o średnicy od 30 do 200 nm, są naturalnie wydzielane przez komórki do płynów biologicznych i przenoszą białka, lipidy oraz kwasy nukleinowe wskazujące na ich komórkę pochodzenia 1,2,3. Ponieważ nieinwazyjne biomarkery obecne w ślinie, moczu i innych płynach ustrojowych4, mają nadzieję na wczesną diagnozę, rokowanie i monitorowanie terapeutyczne, zwłaszcza w onkologii 5,6,7. Jednak ich tłumaczenie kliniczne jest u....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbieranie próbek ludzkich przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) UCLA. Wszyscy dawcy udzielili pisemnej świadomej zgody przed udziałem w badaniu.

UWAGA: W tym badaniu użyto łącznie 4 linii komórkowych: AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), wszystkie zakupione od komercyjnego dostawcy. Linie te były hodowane i przekazywane ściśle zgodnie z instrukcjami i odczynnikami dostawcy. Przygotowane media były zbierane i przechowywane w temperaturze -20 °C przed przetworzeniem. W Samsung Medical Center w Korei dawcy dobrowolnie przekazali....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślna implementacja protokołu SERS dla pojedynczych pęcherzyków daje odrębne widma Ramana od poszczególnych sEV, co pozwala na dalszą diagnostyczną klasyfikację i monitorowanie obciążenia leków terapeutycznych. Rysunek 1 przedstawia sposób przeprowadzenia badania diagnostycznego raka żołądka oraz aplikacji monitorującej EV z użyciem leków z wykorzystaniem naszego protokołu opisanego tutaj, odpowiednio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym elementem tego protokołu jest przygotowanie podłoża i oczyszczanie sEV. Wydajność SERS bez oznakowania zależy w dużej mierze od produkcji jednolitych, wysokokonforemnych podłoży plazmonicznych z silnym "gorącym punktem" wzmacniającym. Podobnie, izolacja sEV o wysokiej czystości za pomocą chromatografii z wykluczeniem rozmiaru jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych widm SERS. Zanieczyszczenia, takie jak agregaty białkowe czy lipoproteiny, nie tylko osłabiają sygnał pęcherzyka, ale takż.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów związanych z tą pracą.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez National Center for Advancing Translational Sciences przy National Institutes of Health w ramach grantów 4UH3TR002978-03 i 1U18TR003778-01 oraz grantu od California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (grant numer TRAN1-14649).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
Siatka miedziana o rozmiarze 300 siatekNauki o mikroskopii elektronowejEMS200-Cu
4% roztwór paraformaldehyduSigma Aldrich1004960700
4″ Si wafle Zaopatrzenie MSEWA0810(100) zorientowany 
Linia komórkowa A549ATCCCCL-185 
Linia komórkowa AGSATCCCRL-1739
Wirnik wirówki F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/Parowanie wiązki elektrycznej
Roztwór trawiciela CrSigma Aldrich651826-500ML
Doksorubicyna  D-4000LC LaboratoriesD-4000_3g
System ExoView R100 i zestaw ExoView Human TetraspaninNanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
Rozwiązanie FeCl3Sigma Aldrich451649
Rozwiązanie HFSigma Aldrich695068-500ML
Linia komórkowa 738.St/Int HsATCCCRL-7869
wZa pomocą konfokalnego mikroskopu RamanaRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Rozwiązanie KOHSigma Aldrich417661
Shakery MaxQ 4000 Stołowe do inkubacji/chłodzeniaThermo ScientificSHKA4000 (4320)
Inkubator MCO-19AICSANYO8380-30-0035
Filtr Millex-GPMilliporeSigmaSLGPM33RS  0,22 & mikro; m
Mikroskop NanoSEM 230FEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/product-support
/nanosight-range/nanosight-ns300
Linia komórkowa NCI-N87ATCCCRL-5822
Optima TLX UltracentrifugaBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
products/rie/plasmapro-800-rie
Kule polistyrenoweAlfa AesarAA42711AB500 nm
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
Grafen jednowarstwowyZaopatrzenie MSEME0408
Kolba T-75VWR156800
TF20 EM o wysokiej rozdzielczościFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Roztwór octanu uraniluNauki o mikroskopii elektronowej22400-1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (5), 369-382 (2022).
  2. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Surface Enhanced RamanRaman SpectroscopySmall Extracellular VesiclessEV IsolationMachine Learning ClassificationPlasmonic SubstrateGold Nanopyramid ArrayGraphene SubstrateDisease DiagnosisDoxorubicin Loading

Related Articles