W tym miejscu przedstawiamy protokół do zbadania, w jaki sposób lncPVT1 reguluje stabilność HIF-1α i ekspresję genów glikolitycznych w komórkach raka tarczycy, umożliwiając badanie regulacji metabolicznej i potencjalnych celów terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
W tym miejscu przedstawiamy protokół do zbadania, w jaki sposób lncPVT1 reguluje stabilność HIF-1α i ekspresję genów glikolitycznych w komórkach raka tarczycy, umożliwiając badanie regulacji metabolicznej i potencjalnych celów terapeutycznych.
Rak tarczycy, jako główny nowotwór układu hormonalnego, wykazuje przyspieszający trend epidemiologiczny we wszystkich populacjach. Pomimo postępów w metodach leczenia, nawroty i przerzuty pozostają wyzwaniami. Długi niekodujący RNA PVT1 (lncPVT1) okazał się konserwatywnym regulatorem onkogennym w wielu typach nowotworów, jednak jego specyficzna funkcja w TC wymaga dalszych badań. Nasze badania koncentrowały się na zbadaniu, w jaki sposób lncPVT1 wpływa na glikolizę zarówno w warunkach normoksyjnych, jak i niedotlenionych przy użyciu linii komórkowych TC TPC-1 i K1. Nadekspresja lncPVT1 znacznie zwiększyła zużycie glukozy i produkcję mleczanu w warunkach niedotlenienia, potwierdzając jego zdolność do zwiększania glikolizy. Co więcej, lncPVT1 zwiększył regulację kluczowych genów glikolitycznych, takich jak GLUT1, HK1, HK2 i PGK1, i ułatwił proliferację komórek TC. Mechanicznie lncPVT1 stabilizował czynnik indukowany hipoksją 1α (HIF-1α), hamując jego degradację i prowadząc do jego akumulacji. W ten sposób nagromadzony HIF-1α wiąże się następnie ze specyficznymi sekwencjami regulatorowymi, które kontrolują ekspresję genów zaangażowanych w glikolizę, ostatecznie aktywując te geny i zwiększając aktywność glikolityczną . Nasze odkrycia pokazują, że lncPVT1 reguluje stabilność HIF-1α i ekspresję genów glikolitycznych, pogłębiając naszą wiedzę na temat metabolizmu TC i potencjalnie ujawniając nowe cele terapeutyczne.
Rak tarczycy (TC), bardzo rozpowszechniony nowotwór układu hormonalnego, doświadczył gwałtownego wzrostu zachorowalności1. Pomimo postępów w strategiach terapeutycznych, w tym zabiegach chirurgicznych, radioterapii i terapii supresji hormonów tarczycy, znaczna część pacjentów z TC nadal stoi w obliczu ryzyka nawrotu guza i przerzutów, co podkreśla potrzebę głębszego zrozumienia jego patogenezy molekularnej 2,3. Rozwój TC wiąże się z kilkoma ustalonymi czynnikami ryzyka, w tym narażeniem na promieniowanie jonizujące, kontaktem z chemicznymi czynnikami rakotwórczymi, paleniem tytoniu i otyłością; Jednak skomplikowane mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają nieuchwytne4. Biorąc pod uwagę ograniczoną wiedzę na temat mechanizmów molekularnych TC, coraz więcej uwagi poświęca się niekodującym RNA, zwłaszcza lncRNA, ze względu na ich rolę regulacyjną w raku.
Pojawiające się dowody wskazują, że lncRNA są kluczowymi regulatorami wieloaspektowych procesów biologicznych, szczególnie w rozwoju nowotworu, poprzez mechanizmy takie jak alternatywny splicing, regulacja transkrypcji i gąbczaste mikroRNA (miRNA) 5,6,7. Translokacja wariantu plazmocytomy 1 (PVT1) znajduje się poniżej chromosomu 8q24.21 i onkogenu C-myc8. Wśród nich lncPVT1, lncRNA zlokalizowany poniżej onkogenu C-myc na chromosomie 8q24.21, przyciągnął znaczną uwagę ze względu na swoją onkogenną rolę w kilku nowotworach złośliwych, w tym raku wątroby9i raku nerkowokomórkowym10. Niemniej jednak funkcjonalne implikacje lncPVT1 w TC pozostają w dużej mierze niezbadane.
Komórki nowotworowe przechodzą przeprogramowanie metaboliczne, kluczową cechę nowotworzenia, w którym wykazują zwiększoną aktywność glikolityczną w połączeniu ze zmniejszoną fosforylacją oksydacyjną, a mianowicie efekt Warburga11. Niedotlenienie, powszechna cecha mikrośrodowiskowa w guzach litych, głęboko wpływa na zachowanie guza, promując glikolizę i agresywność oraz powodując złe rokowanie12. Czynnik indukowany hipoksją 1 (HIF-1), kluczowy czynnik regulujący reakcję komórki na niski poziom tlenu, koordynuje mnóstwo zmian adaptacyjnych, które wspierają przeżycie i progresję nowotworu13. Wcześniejsze badania wykazały, że lncPVT1 moduluje glikolizę w wielu nowotworach złośliwych, w tym w raku piersi14, gruczolakoraku przewodowym trzustki15 i kostniakomięsaku16. Ponadto wykazano, że lncPVT1 zwiększa proliferację komórek poprzez stabilizację HIF-1α w raku nosogardzieli17. Jednak korelacja między ekspresją lncPVT1 a parametrami klinicznymi nie została zgłoszona w przypadku raka. Ponadto specyficzna funkcja i mechanizmy lub unikalne implikacje kliniczne lncPVT1 pozostają niejasne w TC. Dlatego celem tego badania było zbadanie, w jaki sposób lncPVT1 wpływa na metabolizm glukozy w liniach komórkowych TC TPC-1 i K1 narażonych na normoksję i niedotlenienie. Zbadaliśmy wpływ nadekspresji lncPVT1 na spożycie glukozy, produkcję mleczanu i proliferację komórek. Dalej rozszyfrowaliśmy mechanizmy stabilizacji HIF-1α regulowane przez lncPVT1 i ich wynikający wpływ na programowanie transkrypcyjne związane z glikolizą. To kompleksowe badanie oferuje nowe perspektywy na to, w jaki sposób lncPVT1 przyczynia się do nowotworzenia, szczególnie w kontekście przeprogramowania metabolicznego i adaptacji do hipoksyi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Hodowla komórkowa i transfekcja
Linie komórkowe ludzkiego raka tarczycy (TC) TPC-1 i K1 hodowano w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 4,5 g / l glukozy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 μg / ml penicyliny-streptomycyny. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 . W celu leczenia hipoksji 1 x 105 komórek przeniesiono do szczelnej komory hipoksyjnej zrównoważonej 1% O2 , 5% CO2 i 94% N2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, chyba że określono inaczej. Stabilną nadekspresję lncPVT1 (lncPVT1 OE) i odpowiadającą jej kontrolę ujemną (NC) wygenerowano w komórkach TPC-1 i K1 przy użyciu systemu ekspresji lentiwirusa, zgodnie z instrukcjami producenta.
Ocena poziomu glukozy
W celu oceny zużycia glukozy linie komórkowe raka tarczycy hodowano w warunkach normoksyjnych (21%O2) i niedotlenionych (1%O2) przez 24 godziny. Stężenia glukozy w pożywce hodowlanej mierzono za pomocą zestawu do oznaczania glukozy zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, 2 μl kondycjonowanej pożywki zmieszano ze świeżo przygotowanym odczynnikiem roboczym glukozy i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Absorbancję mierzono przy długości fali 530 nm za pomocą czytnika mikropłytek w celu ilościowego określenia poziomu glukozy.
Ocena poziomu mleczanu
Linie komórkowe raka tarczycy TPC-1 i K1 (2 x 104komórki/dołek) hodowano w warunkach normoksyjnych (21%O2, 5%CO2, 37 °C) i niedotlenionych (1%O2, 5% CO2, 37 °C) przez 24 godziny. Po inkubacji płytki hodowlane odwirowywano przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek i szczątków. Następnie z każdej studzienki pobrano 2 μl oczyszczonego supernatantu i zmieszano z 200 μl odczynnika do oznaczania mleczanu na 96-dołkowej płytce. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 minut, po czym dodano roztwór zatrzymujący w celu zakończenia reakcji. Absorbancję mierzono przy długości fali 530 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Stężenia mleczanu określono przez porównanie wartości absorbancji z krzywą wzorcową wygenerowaną na podstawie znanych wzorców mleczanu (zwykle w zakresie od 0 do 20 nmol). Wszystkie pomiary wykonano w trzech egzemplarzach.
Test proliferacji komórek
Komórki raka tarczycy wysiewano na 96-dołkowe płytki o gęstości 3 x 103 komórek na studzienkę w 100 μl pożywki hodowlanej. Komórki następnie inkubowano w warunkach normoksycznych (21%O2, 5% CO2, 37 °C) lub niedotlenionych (1% O2, 5% CO2, 37 °C) przez 0 godzin, 24 godziny lub 48 godzin. W każdym punkcie czasowym do każdego dołka 96-dołkowej płytki dodawano 10 μl odczynnika do proliferacji komórek. Następnie płytkę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Po inkubacji gęstość optyczną przy długości fali 450 nm (OD450) zmierzono za pomocą czytnika mikropłytek w celu ilościowego określenia proliferacji komórek. Wszystkie pomiary wykonano w co najmniej trzech powtórzeniach technicznych.
Analiza qRT-PCR
Całkowity RNA wyekstrahowano z 1 x 106 komórek raka tarczycy w warunkach normoksyjnych (21%O2, 5% CO2, 37 °C) i hipoksyjnych (1% O2, 5% CO2, 37 °C) przy użyciu odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianianu guanidyny, fenolu i chloroformu zgodnie z protokołem producenta. Czystość i stężenie RNA oceniano spektrofotometrycznie, mierząc współczynniki absorbancji przy 260/280 nm. W przypadku komplementarnej syntezy DNA (cDNA) 500 ng całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji w objętości reakcyjnej 20 μl zawierającej odwrotną transkryptazę, losowe startery heksameru, dNTP, inhibitor RNazy i bufor reakcji. Odwrotną transkrypcję prowadzono w temperaturze 25 °C przez 10 minut, następnie w temperaturze 42 °C przez 50 minut, a zakończono ogrzewaniem w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
Ilościowy PCR przeprowadzono przy użyciu systemu detekcji opartego na SYBR Green, w całkowitej objętości reakcji 20 μl, zawierającej matrycę cDNA (rozcieńczenie 1:5 do 1:20 oryginalnej syntezy cDNA), mieszaninę główną SYBR Green PCR, startery do przodu i do tyłu (każdy po 0,2 μM) oraz wodę wolną od nukleaz. Amplifikację PCR przeprowadzono na termocyklerze w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 30 s i przedłużania w temperaturze 72 °C przez 30 s; po którym następuje analiza krzywej topnienia w celu sprawdzenia swoistości amplifikacji.
Sekwencje starterów dla GLUT1, HK1, HK2, PGK1 i GAPDH (Tabela 1) zaprojektowano na podstawie opublikowanych sekwencji18 i zsyntetyzowano komercyjnie. Poziomy ekspresji genów docelowych znormalizowano do GAPDH i obliczono przy użyciu metody 2-ΔΔCt 19.
Plama zachodnia
Po leczeniu komórki raka tarczycy przemyto 2x zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i poddano lizie za pomocą buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy. Lizaty komórkowe inkubowano na lodzie przez 30 minut z przerywanym mieszaniem, a następnie odwirowywano przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Stężenie białka w supernatance oznaczono za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Równe ilości białka (30 μg na próbkę) zmieszano z 5-krotnym buforem ładującym, gotowano w temperaturze 95 °C przez 5 minut i załadowano do 10% żeli poliakrylamidowych SDS w celu separacji elektroforetycznej. Białka rozdzielano metodą elektroforezy przy napięciu 120 V przez około 90 minut, a następnie przenoszono na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą mokrego systemu transferowego przy napięciu 100 V przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Błony blokowano 5% beztłuszczowym mlekiem w roztworze soli fizjologicznej buforowanym trisem zawierającym 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie błony inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w buforze blokującym: przeciwciałem anty-HIF-1α (1:3 000) i przeciwciałem anty-beta-aktyny (1:8 000). Po przemyciu 3x TBST (każdy przez 10 min), błony inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową rozcieńczonymi w stosunku 1:5 000 w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech dodatkowych płukaniach TBST prążki białkowe zostały zobrazowane za pomocą systemu wykrywania ulepszonej chemiluminescencji (ECL) i zobrazowane za pomocą systemu dokumentacji żelu.
Podwójny test lucyferazy
Aby zbadać regulację transkrypcji genów związanych z glikolizą przez lncPVT1, komórki TPC-1 wysiano na 24-dołkowych płytkach o gęstości 1 x 105 komórek na dołek i hodowano w DMEM zawierającym 4,5 g / l glukozy, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 μg / ml penicyliny-streptomycyny na noc. Komórki poddano jednoczesnej transfekcji 500 ng plazmidu reporterowego lucyferazy świetlika napędzanego elementem odpowiedzi na niedotlenienie (HRE) i 50 ng plazmidu kontrolnego lucyferazy Renilla przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w końcowym stężeniu 2 μl na studzienkę, zgodnie z instrukcjami producenta. Skuteczność transfekcji potwierdzono poprzez włączenie równoległej transfekcji plazmidem eksprymującym GFP i ocenę ekspresji GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym 24 godziny po transfekcji. Po 24-godzinnej inkubacji w warunkach normoksycznych (21%O2) lub hipoksyjnych (1%O2) aktywności lucyferazy mierzono za pomocą systemu testów reporterowych z podwójnym lucyferazy. Aktywność lucyferazy świetlika znormalizowano do aktywności lucyferazy Renilla, a stosunek ten wykorzystano do analizy porównawczej między próbkami.
Analiza danych
Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SD. Oceny statystyczne przeprowadzono w oprogramowaniu do analizy statystycznej. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą niezależnych testów t, a istotność statystyczną określono na podstawie progu wartości p poniżej 0,05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zwiększona glikoliza w liniach komórkowych TC za pośrednictwem lncPVT1
Początkowo ustaliliśmy lncPVT1 OE i NC w komórkach TPC-1 i K1 przy użyciu systemu ekspresji lentiwirusa. Udana nadekspresja lncPVT1 została potwierdzona przez qRT-PCR (Figura 1A-B). Aby ocenić wpływ na glikolizę, komórki hodowano w normoksji i niedotlenieniu przez 24 godziny. Nasze odkrycia wskaz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Jako najczęstszy nowotwór złośliwy układu hormonalnego, TC stanowi poważne wyzwanie pod względem jego nawrotów i przerzutów22. Mechanistyczny krajobraz karcynogenezy tarczycy pozostaje nie do końca zdefiniowany, zwłaszcza w odniesieniu do regulacji onkogennego przeprogramowania metabolicznego i podstawowych zachowań komórkowych za pośrednictwem lncRNA23. W tym badaniu skupiliśmy się na onkogennym lncPVT1 i jego wpływie na glikolizę i stabilność HIF-1α w komórkach TC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy twierdzą, że nie ma konfliktu interesów, ani finansowego, ani niefinansowego.
Finansowanie badań zapewniono w ramach projektu Fujian Science and Technology Plan (2022J01784).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do oznaczania białek BCA | meilunbio powiedział: | MA0082-2 powiedział: | Test kwantyfikacyjny białka WB |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Lishen powiedział: | HFsafe-1200LC | Pasaż komórkowy i ekspansja |
| Wirówka | Bajjang | Zobacz materiał B320A | Komórki wirówkowe |
| System obrazowania chemiluminescencyjnego | BIO-RAD (STANY ZJEDNOCZONE) | ChemiDoc Dotyk | Rozwój WB |
| Inkubator CO2 | Thermo (Stany Zjednoczone) | 311 | Hodowla komórkowa |
| Zestaw do detekcji chemiluminescencji ECL | meilunbio powiedział: | MA0186-1 powiedział: | Rozwój WB |
| Cytometr przepływowy | BD | FACSCalbur powiedział: | Test apoptozy cytometrii przepływowej |
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | NIKON(Japonia) | TS2-FL | Obserwacja komórek |
| Fluorescencyjny ilościowy instrument PCR | ABI (Stany Zjednoczone) | 7300 | Eksperyment PCR |
| GAPDH | Technologia białkowa | 60004-1-IG | Przeciwciało wewnętrzne WB |
| Zestaw do oznaczania glukozy | Jiancheng powiedział: | A154-1-1 | Test biochemiczny |
| Zobacz materiał HIF1A | BOSTER | A00013 | Przeciwciało WB |
| IgG przeciw mysim IgG (H+L) sprzężonym z HRP Affinipure Goat (H+L) | Technologia białkowa | SA00001-1 | Eksperyment immunohistochemiczny (IHC) |
| IgG (H+L) sprzężone z HRP Affinipure Goat Anti-Rabbit (H+L) | Technologia białkowa | SA00001-2 | Eksperyment immunohistochemiczny (IHC) |
| Linia komórkowa K1 | Bank Komórek Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny) | NIE | Linia komórkowa ludzkiego raka brodawkowatego tarczycy |
| Zestaw do oznaczania kwasu mlekowego | Jiancheng powiedział: | A019-2-1 | Test biochemiczny |
| Czytnik mikropłytek | Thermo (Stany Zjednoczone) | Zobacz materiał K3 | Wykrywanie testu ELISA |
| PAGE Żel Ultraszybki zestaw do przygotowania (15%) | meilunbio powiedział: | MA0384 powiedział: | Elektroforeza WB |
| Aparat do PCR | BIO-RAD (STANY ZJEDNOCZONE) | Zobacz materiał PTC100 | Eksperyment PCR |
| Wstępnie wybarwiony tęczowy marker białkowy | meilunbio powiedział: | MA0342 powiedział: | Elektroforeza WB |
| Pionowy system elektroforezy białek | BIO-RAD (STANY ZJEDNOCZONE) | POWER PAC 200 | Elektroforeza WB |
| Bufor ładowania białek SDS-PAGE (5X) | Beyotime | Zobacz materiał P0015L | Elektroforeza WB |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma | 151-21-3 | Elektroforeza WB |
| Linia komórkowa TPC-1 | Bank Komórek Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny) | NIE | Linia komórkowa ludzkiego raka tarczycy |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.