Analiza oparta na danych TCGA i danych pojedynczych komórek, biorąc pod uwagę TRPM4 jako przykład

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół gruntownej analizy roli pojedynczego genu w raku pęcherza moczowego (BLCA) na podstawie analizy transkryptomu i analizy pojedynczych komórek, wraz z wykorzystaniem 101 algorytmów uczenia maszynowego, aby zbudować model prognostyczny dla wspomnianego pojedynczego genu.

Abstract

W tym artykule przedstawiono metodę analizy opartą na publicznych zbiorach danych transkryptomicznych oraz danych jednokomórkowych, która mogłaby posłużyć do kompleksowego opisu roli pojedynczych genów w guzach, w tym kształtowania mikrośrodowiska immunologicznego guza, kształtowania molekularnych podtypów nowotworów oraz przewidywania rokowania pacjentów z nowotworami. Jednocześnie wprowadzenie danych pojedynczych genów może nie tylko uniknąć losowości i heterogeniczności wynikającej z analizy pojedynczego transkryptomu, ale także umożliwić głębsze zbadanie konkretnych klastrów komórek, w których gen jest wyrażany, a także dalsze badania nad rolą, jaką gen odgrywa w tym szlaku. Biorąc pod uwagę, że wielu badaczy może nie być biegłych w analizie pojedynczych komórek, w tym artykule metodycznym wprowadzono stronę internetową o nazwie TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), która pomaga wszystkim ukończyć analizę pojedynczych komórek. Ponadto zastosowanie 101 metod uczenia maszynowego odegrało nieodzoną rolę w tworzeniu najbardziej dokładnego modelu prognostycznego. Podsumowując, uważa się, że ta zintegrowana metoda analizy pojedynczego genu, łącząca analizę bioinformatyczną, uczenie maszynowe i analizę pojedynczych komórek, może odegrać niezbędną i kluczową rolę w badaniu funkcji pojedynczych genów w progresji guza, a także w badaniu funkcji poszczególnych genów w szlakach.

Introduction

Jak wszyscy wiemy, rak pęcherza moczowego (BLCA) jest jednym z najbardziej agresywnych i przerzutowych nowotworów złośliwych na świecie, a obecne biomarkery raka pęcherza nadal mają problemy, takie jak niedokładność i tak dalej¹. Aby zidentyfikować rokowania pacjentów z BLCA i przewidzieć wyniki leczenia pacjentów z BLCA kluczowe jest poszukiwanie biomarkerów raka pęcherza moczowego oraz opracowanie modeli prognostycznych. Chociaż opracowano już pewne metody badawcze dotyczące biomarkerów, większość z nich obecnie ogranicza się do transkryptomiki, co nieuchronnie prowadzi do heterogeniczności próbek². Co więcej, samo badanie danych transkryptomicznych często nie pozwala na zbadanie ról różnych subpopulacji komórek, a także funkcji genów w różnych szlakach na poziomie pojedynczych komórek, co sprawia, że wcześniejsze badania są mniej precyzyjne i skuteczne³. Biorąc pod uwagę, że analiza pojedynczych komórek może być wyzwaniem dla początkujących, wprowadzono internetową platformę do analizy pojedynczych komórek, która pomaga im szybko nauczyć się tych umiejętności⁴. Na koniec, nawet jeśli pojedynczy gen zostanie uznany za odpowiedni za odpowiedni przez analizę transkryptomu i analizę pojedynczych komórek, nie ma gwarancji, że marker będzie stosowalny we wszystkich kohortach, dlatego konieczne jest stworzenie modeli prognostycznych związanych z markerem, aby wnioski były bardziej uniwersalne⁵. Algorytm uczenia maszynowego 101 odnosi się do konstrukcji 101 modeli prognozy z wykorzystaniem kombinacji 10 różnych algorytmów uczenia maszynowego, z celem zidentyfikowania optymalnego modelu prognozowania. Wprowadzenie algorytmów takich jak las losowy, XGBoost i SVM, które lepiej radzą sobie ze złożonymi danymi i wykazują większą stabilność, sprawiło, że ten połączony algorytm wykazuje niezwykłą stabilność. Aby uczynić ten model prognostyczny dokładniejszym i bardziej istotnym dla biomarkera, najpierw przeprowadza się analizę korelacji między wszystkimi genami a biomarkerem, następnie wybiera się około 20-30 genów na podstawie wymagań, a następnie stosuje się algorytm uczenia maszynowego 101 do budowy modelu prognostycznego, a następnie serię analiz w celu ostatecznego ustalenia wyników.

W porównaniu z biomarkerami przewidywanymi przez prostą analizę transkryptomiczną z^{ostatnich 6} lat, biomarkery analizy pojedynczej komórki i transkryptomiki pozwalają na bezstronny rozkład tkanek lub próbek na ich podstawowe składniki komórkowe. Umożliwia to wyraźne zróżnicowanie różnych typów komórek (takich jak limfocyty T, limfocyty B i makrofagi) oraz odkrywanie nowych subpopulacji (takich jak wyczerpane limfocyty T i limfocyty regulacyjne), a także wychwytywanie ciągłych procesów dynamicznych (takich jak trajektorie różnicowania komórek)^4. To przypomina układanie owoców i mleka osobno, co pozwala na wyraźną wizualizację każdego składnika i jego ilości. W porównaniu z modelami Coxa⁷ dla pojedynczej kohorty, model prognostyczny skonstruowany za pomocą uczenia maszynowego 101 jest również dokładniejszy i naukowo solidny, ponieważ może automatycznie uczyć się o złożonych, nieliniowych interakcjach między zmiennymi na podstawie danych. Na przykład wpływ konkretnej mutacji genetycznej może być istotny tylko u pacjentów w określonym wieku i o określonych rozmiarach guza. Modele uczenia maszynowego, takie jak losowe lasy i sieci neuronowe, mogą automatycznie przechwytywać te interakcje wyższego rzędu bez konieczności ręcznej specyfikacji⁸. Ograniczenia zastosowania klucza sygnalizacyjnego muszą obejmować zdecydowaną większość genów, przy czym liczba genów nie jest zbyt niska, a liczba genów używanych do budowy modeli prognostycznych nie jest zbyt wysoka, zazwyczaj utrzymuje się na poziomie około 20-30, co jest optymalne. Standard kontroli jakości zestawu pojedynczych komórek powinien przekraczać 1000, liczba UMI na komórkę przekraczać 1000, a liczba genów na komórkę przekraczać 500⁹.

Tutaj przedstawiono podejście krok po kroku do identyfikacji nowych biomarkerów z publicznych zbiorów danych transkryptomicznych oraz zbiorów danych jednokomórkowych, na przykład TRPM4 w BLCA jako przykład. Stosuje się wiele metod badawczych oraz różnorodne zbiory danych — w tym zbiór danych Cancer Genome Atlas-Bladder Cancer (TCGA-BLCA), GSE145281 jednokomórkowych oraz zestawy danych BLCA GSE32894 i GSE31684 — aby zwiększyć precyzję i zastosowanie biomarkerów w onkologii z różnych perspektyw oraz rozwijać badania TRPM4 w BLCA. Zbiór danych TCGA-BLCA został pozyskany ze strony internetowej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz Xena (UCSC Xena). GSE32894 i GSE31684 zostały pobrane z Gene Expression Omnibus (GEO), a dane pojedynczych komórek GSE145281 pochodzą z Tumor Immune Single-Cell Hub 2 (TISCH2). Dodatkowo dane dotyczące podtypów cząsteczek BLCA i odpowiedzi na leczenie zostały wyodrębnione z dodatkowych plików kalkulacyjnych odpowiedniego artykułu. Następnie przeprowadzane są analizy bioinformatyczne, analizy pojedynczych komórek oraz uczenie maszynowe, ustanawiając zintegrowaną metodologię badań pojedynczych genów.

Protocol

UWAGA: Wszystkie kody użyte w tym artykule można znaleźć na stronie https://github.com/YaoGeng-nmu/Analysis-of-TRPM4-based-on-TCGA-data-and-single-cell-data-in-BLCA/blob/main/code.

1. Przygotowanie danych transkryptomicznych

1. Przygotowanie zbioru danych TCGA-BLCA
   1. Pobierz wszystkie zbiory danych TCGA ze strony UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/)¹⁰. Pobrane zbiory danych są wstępnie przetwarzane, co eliminuje potrzebę dodatkowych prac, takich jak adnotacja genu¹¹.
   2. Wybierz zbiór danych TCGA , a następnie kliknij na TCGA-BLCA dataset. Następnie przejdź na stronę zbioru danych TCGA-BLCA, kliknij na Gene Expression RNA-seq i pobierz dane kliniczne oraz profile ekspresji genów z zbioru TCGA-BLCA. W tym zbiorze danych należy upewnić się, że znajduje się 400 danych o ekspresji mRNA pacjentów z BLCA.
   3. Aby odróżnić próbki nowotworów od sąsiednich próbek tkanek normalnych, rozdziel próbki końcówkami 01 i 11, ponieważ próbki 01 wskazują na próbki nowotworów, natomiast próbki z 11 wskazują na tkanki sąsiadujące z nowotworem (próbki normalne).
2. Przygotowanie GSE32894 i GSE31684
   1. Kliknij na stronę GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), aby pobrać zestaw danych BLCA GSE32894 oraz GSE31684^12,13.
   2. Po kliknięciu odpowiednich wpisów w prawym górnym rogu, upewnij się, że przejdź do stron zestawów danych GSE32894 i GSE31684.
   3. Następnie pobierz odpowiednie dane mRNA, dane kliniczne oraz dane o przeżyciu do GSE32894. Kliknij przycisk http w zbiorze danych GSE32894. Pobierz także dane GPL6947 platformy za pomocą przycisku platformy. Kliknij przycisk Plik( y) Serii Macierzy i pobierz GSE32894 po kliknięciu przycisku GSE32894_series_matrix.txt.gz podczas pobierania danych mRNA, danych klinicznych i danych o przeżyciu dla GSE32894.
   4. Pobierz odpowiednie dane mRNA, dane kliniczne oraz dane o przeżyciu, aby GSE31684. Kliknij przycisk http w zbiorze danych GSE31684. Pobierz także dane platformy GPL570 za pomocą przycisku platformy. Kliknij przycisk Pliku Macierzy Serii i pobierz GSE31684 po kliknięciu przycisku GSE31684_series_matrix.txt.gz podczas pobierania danych mRNA, danych klinicznych i danych o przeżyciu GSE31684.
   5. W etapie filtrowania usuń bezsensowne geny, takie jak te o poziomie ekspresji zerowym lub bliskim zeru. Do korekcji wsadowej stosuj metodę ComBat, opartą na pakiecie SVA¹⁴.

2. Przygotowanie analizy pojedynczej komórki

1. Przygotowanie GSE145281
   1. Aby prowadzić badania na poziomie pojedynczych komórek, należy znaleźć zbiór danych BLCA o pojedynczych komórkach, biorąc pod uwagę, że same dane transkryptomowe nie wystarczają do określenia, który klaster komórek wyraża TRPM4 najistotniej.
   2. Tutaj odwiedź TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), internetową stronę internetową do analizy guzów pojedynczych komórek.
   3. W zależności od potrzeb eksperymentalnych wybierz potrzebny typ nowotworu , używając BLCA jako przykładu w tym przypadku.
   4. Kliknij przycisk BLCA , wybierając zbiór danych o nazwie GSE145281.

3. Przygotowanie molekularnych podtypów BLCA i odpowiedzi na dane dotyczące wyborów terapeutycznych

1. Pobierz dane dotyczące molekularnych podtypów BLCA i odpowiedzi na wybory terapeutyczne z artykułu cytowanego tutaj¹⁵.
2. Otwórz stronę internetową PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Wyszukaj artykuł i kliknij Tabele uzupełniające. W tym skompresowanym pakiecie znajduje się łącznie 18 plików.

4. Analiza mikrośrodowiska odpornościowego BLCA dla TRPM4

1. Wykres heatmap ekspresji 133 immunomodulatorów w różnych grupach TRPM4
   1. Zgodnie z ekspresją TRPM4, wszystkie próbki BLCA dzieli na grupę o wysokim TRPM4 i niskiej TRPM4 .
   2. Skopiuj wszystkie nazwy próbek i dane wyrażeń TRPM4 osobno, następnie posortuj je w kolejności malejącej względem wyrażenia TRPM4 i kategoryzuj pierwszą połowę próbek do grupy o wysokim TRPM4 , a drugą połowę do grupy Niskiego TRPM4 w kolumnie Grupy zgodnie z wyrażeniem TRPM4 . Wszystkie identyfikatory pacjentów TCGA-BLCA są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1.
   3. Zainstaluj pakiety R wymagane do analizy danych transkrypomicznych. Wprowadź drobne modyfikacje w dostarczonym kodzie, na przykład zmieniając lokalizację pliku, a następnie uruchom kod. Dokładnie sprawdź, czy identyfikatory genów i identyfikatory immunomodulatorów są prawidłowo dopasowane, zapewniając, że po identyfikatorach genów nie ma żadnych przerw ani innych niepozornych czynników, ponieważ są one głównymi przyczynami nieudanych generowania map cieplnych.
2. Analiza stromalna i immunologiczna próbek nowotworów z wykorzystaniem pakietu ESTIMATE R
   1. Upewnij się, że wszystkie pakiety R wymagane do analizy danych transkrypomicznych są zainstalowane. Zgodnie z wymaganiami kodu, nadaj wymaganym danym nazwy i kliknij przycisk Uruchom.
      UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że ta strona oferuje również możliwości analizy online. Chociaż można uzyskać pożądane rezultaty, odwiedzając stronę internetową (https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/rpackage.html), ta metoda nie nadaje się do analizy danych zebranych samodzielnie.
   2. Kliknij przycisk Choroba i wybierz opcję raka urotelialnego pęcherza . Następnie wybierz przycisk platformy RNA-seq-V2 . Pobierz wszystkie wyniki stromalne, immunologiczne i oceny szacunkowe wszystkich próbek.
3. Wykres skrzypiec wyrażający wyrażenie między różnymi grupami TRPM4
   1. Zainstaluj wszystkie pakiety R potrzebne do analizy danych transkrypomicznych. Wszystkie potrzebne pakiety R są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 2. Zgodnie z wymaganiami kodu, nadaj wymaganym danym nazwy i kliknij przycisk Uruchom.
   2. Upewnij się, że dokładnie sprawdzasz, czy identyfikatory genów są prawidłowo wprowadzane, zapewniając, że na końcu identyfikatorów genów nie ma spacji ani innych niepozornych czynników, ponieważ są one głównymi przyczynami niepowodzeń w tworzeniu wykresów skrzypiec.
4. Wykres trójkątnej mapy ciepła między różnymi grupami TRPM4
   1. Zainstaluj wszystkie pakiety R wymagane do analizy danych transkryptomicznych. Upewnij się, że przygotujesz dane ekspresji kilku genów punktów kontrolnych immunologicznych, takich jak TIGIT i CD80. Otwórz dane transkryptomu TCGA-BLCA i przeszukaj każdy wpis osobno, ponieważ liczba genów punktów kontrolnych układu odpornościowego nie jest duża.
   2. Zgodnie z wymaganiami kodu, nadaj wymaganym danym nazwy i kliknij przycisk Uruchom.
5. Wykres korelacji między różnymi genami a TRPM4
   1. Zainstaluj wszystkie pakiety R wymagane do analizy danych transkryptomicznych. Wypełnij TRPM4 jako pierwszy gen i dodaj gen badany jako drugi, którym w tym przypadku jest CD3E .
   2. Po kliknięciu przycisku Run upewnij się, że zmieniłeś CD3E na inne geny wymagające analizy, takie jak CTLA4.

5. Analiza TRPM4 w pojedynczych komórkach w zbiorze danych GSE145281

1. BLCA GSE145281 analizę zbioru danych z wykorzystaniem analizy pojedynczych komórek
   1. Wejdź na stronę internetową i kliknij BLCA. Analiza pojedynczych komórek pozwala na głębsze zbadanie, które klastry komórek wykazują wysoką ekspresję TRPM4 w porównaniu z analizą transkryptomiczną. Upewnij się, że dane analizy pojedynczych komórek są zbierane z GSE130001 i sprawdź zgodnie ze standardem kontroli jakości, że liczba komórek na zbiór danych powinna przekraczać 1000, liczba UMI na komórkę przekraczać 1000, a liczba genów na komórkę przekraczać 500. Geny różnicowo ekspresyjne każdego klastra w porównaniu do wszystkich innych komórek są identyfikowane na podstawie logarytmicznie przekształconej zmiany fałdów (|logFC| >= 0,25), a rozdzielczość klasteryzacji powinna wynosić 0,5.
2. Adnotacja komórek dla różnych klastrów komórek
   1. Upewnij się, że wszystkie skupiska komórek są oznaczone adnotacjami. Na przykład komórki B można anotować jako CD19, MS4A1, CD27, IGHD, IGHM, TCL1A i FCRL5. Wszystkie geny używane do adnotacji komórek można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 3.
   2. Następnie wybierz GSE145281 i pobierz wszystkie wyniki TRPM4. Kliknij przycisk Ogólne i pobierz wykres UMAP GSE145281 różnych klastrów i typów komórek.
   3. Kliknij przycisk Genu i wybierz pojedynczy gen, który będzie analizowany. Kliknij przycisk GSEA i obserwuj funkcje tego pojedynczego genu w różnych szlakach, takich jak szlak KEGG i szlak Hallmark^16,17.
   4. Kliknij przycisk CCI i znajdź wykres czatu komórkowego oraz wykres dymków czatu komórkowego klastra wysoko ekspresującego pojedynczy gen.
   5. Kliknij przycisk wzbogacania TF, aby zobaczyć wzbogacony Współczynnik Transkrypcji dla każdego klastra.

6. 101 Uczenie maszynowe do konstrukcji prognostycznego modelu związanego z TRPM4

1. Zainstaluj wszystkie pakiety R potrzebne do analizy danych transkrypomicznych. Biorąc pod uwagę, że jedno podejście do uczenia maszynowego nie zawsze jest optymalną metodą przewidywania prognoz, model prognozy można skonstruować przy użyciu 101 technik uczenia maszynowego. Przeprowadzić analizę korelacji między wszystkimi genami w kohorcie TCGA-BLCA oraz GSE32894 i GSE31684 kohortami oraz TRPM4.
2. Na podstawie liczby genów silnie związanych z TRPM4, wybierz wszystkie geny o korelacji większej lub równej 0,6, mniejszej lub równej -0,6 z TRPM4. Wybieraj wszystkie geny silnie związane z TRPM4 we wszystkich kohortach.
3. Połącz wszystkie dane z GSE32894 i GSE31684 kohorty, tworząc zbiór walidacyjny i używając TCGA-BLCA jako zbioru treningowego.
4. Zgodnie z wymaganiami kodu, nadaj wymaganym danym nazwy i kliknij przycisk Uruchom.

Results

Powszechnie wiadomo, że podstawową korzyścią z wykorzystania transkryptomiki do analizy mikrośrodowiska immunologicznego dla poszczególnych genów jest umożliwienie bezpośredniej korelacji między poszczególnymi genami a dynamicznymi interakcjami z komórkami i cząsteczkami odpornościowymi na poziomie ekspresji genów, umożliwiając bezpośrednią obserwację cech immunologicznych oraz identyfikację różnic w proporcji komórek odpornościowych infiltrujących się między grupami o wysokiej lub niskiej ekspresji poszczególnych genów ...

Discussion

W poprzednich badaniach analiza bioinformatyczna pojedynczych genów często napotykała na takie problemy jak powierzchowność, niedokładność i ograniczoną stosowalność¹⁹. Co więcej, wcześniejsze badania nad pojedynczymi genami zazwyczaj ograniczały się do danych transkryptomowych. Co więcej, skupiając się wyłącznie na danych transkryptomowych, mogą pojawić się problemy takie jak heterogeniczność próby i losowość, co utrudnia identyfikację uniwersalnych wzorców²⁰. Dlatego, aby...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
R 4.3.3	Brak	Brak	Brak