Ochrona sercowo-mózgowa za pomocą elektroakupunktury w myszim modelu przewlekłej hipoksji

Podsumowanie

Badanie to ustanowiło 12-tygodniowy model przewlekłej niedotoksji myszas, aby zbadać ochronę kardio-mózgową elektroakupunktury. Wyniki wykazały, że stymulacja elektroakupunkturą w punktach akupunkturowych, powszechnie stosowana w celu poprawy funkcji poznawczych, nie tylko poprawia funkcje poznawcze, ale także łagodzi dysfunkcje serca i zmniejsza patologiczne uszkodzenia tkanek mięśnia sercowego.

Streszczenie

Badanie to ustanowiło 12-tygodniowy model przewlekłej niedotoksji mysiej do badania efektów ochronnych elektroakupunktury na poziomie kardio-mózgowym. Istniejące podejścia terapeutyczne w leczeniu zaburzeń związanych z hipoksją, takie jak terapia tlenem hiperbarycznym i niektóre leki farmaceutyczne, często są ograniczone przez słabą dostępność lub mechanizmy skupione na jednym celu. Aby wypełnić tę lukę, założyliśmy hipotezę, że stymulacja EA w punktach akupunkturowych, tradycyjnie stosowana do poprawy funkcji poznawczych i serca w przewlekłych schorzeniach hipoksyjnych. Trzydziestu samców myszy C57BL/6J zostało losowo przydzielonych do trzech grup: grupa kontrolna (Con), grupa modelowa z przewlekłej hipoksji (CH+EA) oraz grupa leczenia przewlekła i elektroakupunktura (CH+EA). Grupy CH i CH+EA były wystawione na działanie środowiska hipoksycznego (10,0% ± 0,5% O₂) przez 8 godzin dziennie przez 12 tygodni, przy czym grupa CH+EA dodatkowo była codziennie stymulowana w zakresie GV20, GV24 oraz obustronnej ST36 w ciągu ostatnich 2 tygodni. Testy behawioralne, ocena echokardiograficzna i analiza histopatologiczna wykazały, że EA nie tylko znacząco łagodzi zachowania podobne do lęku i poprawia pamięć przestrzenną, ale także poprawia wiele parametrów funkcji serca, jednocześnie zmniejszając uszkodzenia neuronów hipokampa i remodelację mięśnia sercowego. Wyniki te wykazują, że EA zapewnia efekty ochronne dla kardio-mózgu, które są zgodne z "holistyczną" koncepcją tradycyjnej medycyny chińskiej, oferując tym samym nową, niefarmakologiczną strategię interwencji w przypadku współistniejących chorób kardiomózgowych związanych z hipoksją.

Wprowadzenie

Hipoksja stanowi częste wyzwanie patologiczne w różnych schorzeniach, w tym w środowiskach na dużych wysokościach, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP), chorobach sercowo-naczyniowych oraz w specjalistycznych sytuacjach, takich jak operacje lotnicze i nurkowe, co może prowadzić do wielonarządowych upośledzeń funkcjonalnych. Jako narządy o najwyższym zużyciu tlenu w organizmie, mózg i serce są szczególnie podatne na uszkodzenia hipoksyjne. Badania pokazują, że częstość występowania zaburzeń poznawczych u pacjentów z POChP waha się od 32% do 88%^1,2, podczas gdy częstość występowania zaburzeń serca sięga nawet 70%3. Badania wykazały, że przewlekła hipoksja powoduje dysfunkcję mitochondriów mózgu, co następnie prowadzi do stresu oksydacyjnego, przeciążenia wapniem oraz neurozapalenia, które ostatecznie powoduje uszkodzenia neuronów w hipokampie i korze mózgowej oraz upośledza uczenie się i funkcje pamięci ^4,5,6. Jednocześnie hipoksja aktywuje zarówno układ współczulny, jak i układ renin-angiotensyna-aldosteron (RAAS), prowadząc do zwężania naczyń, podwyższonego ciśnienia krwi, zwiększonego obciążenia serca oraz sprzyjającej przerostowi mięśnia sercowego i włóknieniu, ostatecznie prowadzącym do niewydolności serca ^7,8,9. To współistniejące uraz sercowo-mózgowe znacząco zwiększa trudność w leczeniu klinicznym u pacjentów, czyniąc rozwój skutecznych i dostępnych strategii terapeutycznych krytyczną niezaspokojoną potrzebą kliniczną.

Obecne strategie terapeutyczne w leczeniu zaburzeń poznawczych i dysfunkcji serca wywołanych hipoksją obejmują głównie terapię tlenową hiperbaryczną, wzmacniacze metabolizmu mózgu (np. piracetam, oksyracetam), terapię czynnikami neurotroficznymi^10,11 oraz blokery β (np. metoprolol)¹². Jednak te podejścia mają istotne ograniczenia: terapia tlenem hiperbarycznym wymaga specjalistycznego sprzętu i jest niedostępna; interwencje farmakologiczne często powodują skutki uboczne i zazwyczaj celują w pojedyncze szlaki patologiczne; natomiast terapia czynnikami neurotroficznymi napotyka wyzwania związane z penetracją i stabilnością bariery krew-mózg. Dlatego identyfikacja skutecznych, dostępnych strategii jednoczesnego leczenia sercowo-mózgowego stała się kluczowym kierunkiem badań.

Akupunktura, będący podstawowym elementem tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), kładzie nacisk na holistyczne podejście terapeutyczne, które odpowiada zapotrzebowaniu na wielocelową regulację. Wykazuje unikalny potencjał terapeutyczny zarówno dla zaburzeń neurologicznych, jak i sercowo-naczyniowych. Elektroakupunktura (EA), nowoczesna ewolucja akupunktury integrująca tradycyjne igłowanie ze stymulacją elektryczną, umożliwia dokładniejszą modulację aktywności elektrofizjologicznej nerwowej^13,14. EA skutecznie poprawia uszkodzenie niedokrwienia mózgu i reperfuzję, zmniejsza uwalnianie enzymów mięśniowych sercowych (GPBB, H-FABP) oraz wywiera znaczącą protekcję kardioprotekcyjną ^15,16. Podsumowując, jako nowoczesna innowacja tradycyjnej akupunktury, elektroakupunktura stosuje wielomechanistyczną i wielocelową regulację, wykazując wyraźną wartość zastosowania i potencjał kliniczny w leczeniu chorób neurologicznych i sercowo-naczyniowych oraz łącząc TCM z nowoczesną medycyną.

Jednak obecne badania nad EA w przypadku hipoksycznych zaburzeń poznawczych i urazów serca ograniczają się głównie do efektów pojedynczych narządów/układów, nie badając jej potencjału w jednoczesnym leczeniu kardio-mózgowym. Opierając się na "holistycznej koncepcji" TCM oraz klinicznej rzeczywistości współistniejących zaburzeń kardiopulmonalno-mózgowych wywołanych długotrwałą przewlekłą hipoksją, celem tego badania są zbadanie wpływu EA w "jednoczesnym leczeniu kardiomózgowym", wyjaśnienie jego roli w synchronicznym poprawianiu uszkodzenia neuronów wywołanych hipoksją, przerostu mięśnia sercowego/włóknienie oraz powiązanych zaburzeń funkcjonalnych oraz zapewnienie holistycznego, ukierunkowanego niefarmakologicznego leczenia chorób kardio-płucno-mózgowych.

Protokół

Trzydziestu samców myszy C57BL/6J, w wieku 7-8 tygodni i ważących 18-22 g (patrz Tabela materiałów), zostało umieszczonych w ośrodku SPF w Nowym Centrum Oceny Leków Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute. Temperatura otoczenia była utrzymywana na poziomie 20-26 °C przy wilgotności względnej 40%-70%, w cyklu światła i ciemności trwającej 12/12 godzin. Myszy miały ad libitum dostęp do standardowej laboratoryjnej karmy dla gryzoni i czystej wody. Po tygodniowym okresie aklimatyzacji myszy zostały losowo podzielone na trzy grupy (n = 10): grupę kontrolną (Con), grupę modelową z przewlekłą hipoksją (CH) oraz grupę leczenia przewlekłą hipoksją i elektroakupunkturą (CH+EA). Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Zwierząt Instytutu Badań Farmaceutycznych Hebei Yiling (nr zatwierdzenia: TTN-2025001) i przeprowadzono je ściśle zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

Ustanowienie modelu myszy z przewlekłą hipoksją (Rysunek 1)

Model myszy z przewlekłą hipoksją został opracowany na podstawie wcześniej opisanej metody z modyfikacjami¹⁷. Do generowania i utrzymania środowiska hipoksyjnego użyto zautomatyzowanego systemu kontroli i dostarczania gazu. System ten został zaprogramowany do precyzyjnej regulacji zaworów elektrozaworowych mieszających czysty tlen i azot w określonych proporcjach, dostarczając mieszaninę do specjalnie wykonanej komory do niedotlenienia ze stali nierdzewnej. Taki system umożliwiał dokładną kontrolę zarówno czasu, jak i stężenia dostarczania gazu. Stężenie tlenu w komorze było nieprzerwanie monitorowane za pomocą cyfrowego analizatora tlenu i utrzymywane na poziomie 10,0% ± 0,5% za pomocą mechanizmu sprzężenia zwrotnego, który odpowiednio dostosowywał przepływ gazu. Myszy z grup CH i CH+EA były współlokowane w komorze hipoksji i poddawane warunkom hipoksyjnym przez 8 godzin dziennie (od 9:00 do 17:00), po czym przez resztę dnia wracano je do normoksycznych warunków. Protokół ten powtarzano codziennie przez 12 tygodni. Podczas ekspozycji hipoksycznej zwierzęta miały ad libitum dostęp do jedzenia i wody. Szczególną ostrożność poświęcono podczas początkowej infuzji azotu, aby zmniejszyć stężenie tlenu; proces ten przeprowadzano stopniowo, aby zapobiec ostrej śmierci zwierząt spowodowanej gwałtownym spadkiem poziomu tlenu. Myszy z grupy Con były trzymane w warunkach normoksycznych w sąsiedniej komorze, przy wszystkich pozostałych warunkach identycznych jak w grupach eksperymentalnych.

Znieczulenie (Rysunek 2)

Aby zapewnić stabilność zwierząt podczas interwencji elektroakupunktury i zminimalizować zakłócenia wynikające z obciążenia fizjologicznego dla wyników, w tym badaniu zastosowano inhalowany izofluran do znieczulenia¹⁷. Znieczulenie było podawane wszystkim myszom w różnych grupach eksperymentalnych podczas procedur, aby zapewnić spójność warunków operacyjnych. Przed znieczuleniem przygotowano aparat do znieczulenia dla małych zwierząt (patrz Tabela materiałów) oraz termostatycznie sterowany termofor, ustawiony na 37 °C, aby zapobiec hipotermii u zwierząt podczas zabiegu. Indukcja znieczulenia przeprowadzono w zamkniętej komorze indukcyjnej z użyciem izofluranu 2%-2,5% (patrz Tabela materiałów) przez około 1 minutę. Po zaobserwowaniu utraty spontanicznego ruchu i znacznego spadku napięcia mięśniowego, każda mysz została przeniesiona na poduszkę grzewczą. Specjalnie zaprojektowana miniaturowa maska została delikatnie założona na pysk, aby utrzymać znieczulenie przy stężeniu izofluranu 0,5%-1,2%. Skuteczna głębokość znieczulenia była określana przez brak odruchu mrugania oraz brak znaczącego odruchu wycofania w odpowiedzi na stymulację podeszwową. Protokół znieczulenia utrzymywał stabilny stan znieczulenia u myszy przez ponad 30 minut, co wystarczało do przeprowadzenia wszystkich kolejnych zabiegów.

Leczenie elektroakupunkturą

Interwencja elektroakupunktury rozpoczęła się u grupy myszy CH+EA w 11. tygodniu przewlekłej ekspozycji na hipoksję. Wybrane punkty akupunkturowe to Baihui (GV20) i Shenting (GV24) na głowie oraz obustronne Zusanli (ST36). GV20 znajduje się na linii środkowej wierzchołka czaszki, mniej więcej w środku między dwoma wierzchołkami uszu¹⁸. GV24 znajduje się na linii środkowej czoła, około 1-2 mm powyżej środka linii łączącej wewnętrzne kanty oczu¹⁹. ST36 znajduje się na kończynie tylnej, dolnej i bocznej od stawu kolanowego, w zagłębieniu około 2 mm poniżej dolnej krawędzi głowy strzałki^20,21. Po osiągnięciu stabilnego stanu znieczulenia u myszy operator trzymał jednorazową sterylną igłę akupunkturową ze stali nierdzewnej (specyfikacja: 0,18 × 7 mm; patrz Tabela materiałów) w prawej ręce. W punktach akupunkturowych głowy (GV24 i GV20) skóra głowy była delikatnie podnoszona lewą ręką, a igła była wprowadzana podskórnie pod kątem 15-30°, przesuwając się do tyłu na głębokość około 2 mm. Dla punktu akupunktowego ST36 na kończynie dolnej igła była wprowadzana prostopadle na głębokość około 3-4 mm. Elektrody wyjściowe urządzenia elektroakupunkturowego (patrz Tabela materiałów) były następnie łączone z uchwytami igieł: jeden zestaw przewodów łączył GV20 i lewy ST36, a drugi łączył GV24 i prawy ST36. Równoczesna stymulacja elektroakupunkturą była stosowana za pomocą dwóch zestawów drutów. Parametry EA ustawiono następująco: fala ciągła, częstotliwość ^22,23. Intensywność prądu stopniowo zwiększano od 0,1 mA, aż zaobserwowano lekkie rytmiczne drganie kończyny (zazwyczaj utrzymywane na poziomie około 2 mA). Elektroakupunkturę wykonywano raz dziennie przez 30 minut, ciągłie przez 6 dni z jednym dniem odpoczynku, co daje łącznie 2-tygodniowy cykl. Tymczasem myszy z grup Con i CH przechodziły znieczulenie i unieruchamianie o identycznym czasie trwania i w stanie, ale bez włożenia igły lub aktywacji urządzenia elektroakupunkturowego.

Test na otwartym polu

Test na otwartym polu (OFT) przeprowadzono w celu oceny spontanicznej aktywności lokomotorycznej, zachowań eksploracyjnych oraz reakcji lękowych myszy w nowym środowisku²⁴. Aparat OFT był białym boksem (50 cm, 50 cm, 30 cm), którego podłoga była praktycznie podzielona na siatkę 25 kwadratów (każdy o wymiarach 10 cm 10 cm) do analizy behawioralnej. Przed formalnym testem wszystkie myszy były przyzwyczajane do pomieszczenia testowego na godzinę, aby zminimalizować wpływ stresu wywołanego zmianą środowiskową na wyniki zachowań. Podczas testów każda mysz była delikatnie umieszczana na środku aparatu. Po 2-minutowym okresie habituacji jej zachowanie było formalnie rejestrowane przez 10 minut. Cała sesja była nagrywana za pomocą systemu śledzenia wideo (patrz Tabela materiałów), aby automatycznie śledzić trajektorię ruchu. Analizowane parametry obejmowały całkowitą przebytą odległość, czas spędzony w strefie centralnej, prędkość w strefie centralnej oraz liczbę wejść do strefy centralnej. Wszystkie myszy rozpoczęły eksplorację z identycznego miejsca centralnego, a każda mysz była testowana tylko raz. Aby zapobiec zakłóceniom węchowym, urządzenie zostało dokładnie oczyszczone 75% etanolem po testach każdej myszy

Morris Water Mase (MWM)

Test labiryntu wodnego Morrisa (MWM), standardowa metoda oceny funkcji pamięci, był stosowany głównie do oceny zdolności uczenia się przestrzennego i pamięci u myszy²⁵. Urządzenie składało się z okrągłego basenu o średnicy 120 cm i głębokości 30 cm, który koncepcyjnie podzielono na cztery równe ćwiartki (I, II, III, IV). Aby zminimalizować zewnętrzne rozpraszacze, wokół basenu zawieszono zasłony zaciemniające, a na ścianach nad nim umieszczono wyraźne wskazówki wizualne, które pozostawały stałe przez cały eksperyment. Basen był wypełniany wodą utrzymywaną w temperaturze 22-24 °C, a poziom wody utrzymywano około 1 cm powyżej powierzchni platformy. Do wody dodano nietoksyczny proszek dwutlenku tytanu w stężeniu 20%, aby uczynić ją nieprzezroczystą, co poprawiło kontrast między myszą a tłem dla dokładniejszego śledzenia wideo. Procedura eksperymentalna trwała 6 kolejnych dni, obejmując 5-dniową fazę treningu przestrzennego akwizycji, a następnie jednodniowe próby sondy przestrzennej. Podczas fazy treningowej w kwadrancie III umieszczono okrągłą platformę o średnicy 10 cm, służącą jako cel. Pierwszego dnia platforma była umieszczona nieco powyżej powierzchni wody (~1 cm), aby zapoznać myszy z celem ucieczki. Od 2 do 5 dni platforma była zanurzona około 1 cm pod powierzchnią wody, aby ocenić uczenie się przestrzenne. Każdego dnia każda mysz była kolejno umieszczana w wodzie naprzeciw ściany basenu w ustalonej kolejności. Eksperymentator natychmiast opuszczał pomieszczenie po umieszczeniu zwierzęcia, aby nie stać się niezamierzonym sygnałem przestrzennym. Czas potrzebny na zlokalizowanie ukrytej platformy (opóźnienie ucieczki) był rejestrowany dla każdej próby. Jeśli mysz nie znalazła platformy w czasie granicznym 90 sekund, delikatnie prowadziła ją i pozwalano pozostać tam przez 30 sekund, aby wzmocnić uczenie przestrzenne, a jej opóźnienie rejestrowano jako 90 sekund. Jeśli mysz znalazła platformę w ciągu 90 sekund, pozwalano jej pozostać na niej przez 10 sekund. Po każdej sesji treningowej mysz była suszona ręcznikiem i wracana do swojej domowej klatki. Sekwencja początkowego kwadrantu była systematycznie zmieniana, z interwałem prób około 20 minut dla każdej myszy. System śledzenia wideo (patrz Tabela materiałów) automatycznie rejestrował parametry takie jak odległość pływania, prędkość i opóźnienie ucieczki. Szóstego dnia przeprowadzono próbę sondową w celu oceny pamięci przestrzennej. Platforma została usunięta z kwadrantu docelowego (kwadrant III), a każda mysz została uwolniona z kwadrantu naprzeciwko poprzedniego miejsca docelowego (kwadrant I) i pozwalano pływać swobodnie przez 90 sekund. Czas spędzony w kwadrancie docelowym (gdzie wcześniej znajdowała się platforma), liczba przejść nad dokładną dawną lokalizacją platformy oraz trajektoria pływania zostały zarejestrowane. Bezpośrednio po próbie sondy mysz została dokładnie wysuszona i odesłana do swojej klatki pod źródłem ciepła, aby zapobiec hipotermii. Przez cały eksperyment pozycje wszystkich wskazówek wzrokowych wokół labiryntu pozostały niezmienione, aby zapewnić spójność w warunkach eksperymentalnych.

Echokardiografia

Echokardiografia u myszy to nieinwazyjna technika obrazowania w czasie rzeczywistym, kluczowa do oceny struktury i funkcji serca, szeroko stosowana w badaniach nad modelami chorób sercowo-naczyniowych. Badanie przeprowadzane jest w znieczuleniu ogólnym, utrzymując stan znieczulenia przez cały zabieg według opisanego wcześniej protokołu. Mysz jest ustawiona na plecach na platformie kontrolowanej termostatycznie utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Po delikatnym zabezpieczeniu kończyn równomiernie nakłada się krem depilacyjny na okolice piersiowe i brzucha. Wszystkie włosy i krem z resztkami są dokładnie usuwane po 1-2 minutach, aby zapewnić optymalną jakość transmisji ultradźwięków. Do monitorowania fizjologicznego w czasie rzeczywistym używa się plastrów elektrod połączonych z kończynami za pomocą przewodzącego żelu, które nieprzerwanie rejestrują elektrokardiogram i częstość oddechu. Aby uzyskać standardowe obrazy ultrasonograficzne, pozycja myszy jest regulowana tak, by jej głowa była nieco wyżej niż ogon, zapewniając, że długa oś serca jest równoległa do platformy. Szczególną ostrożność należy poświęcić sondzie unikania nadmiernego nacisku na ścianę klatki piersiowej, ponieważ może to zmienić geometrię serca i wpłynąć na dokładność pomiarów. Na ogolony obszar nakłada się dużą ilość bezbąbelkowego żelu ultradźwiękowego (2-5 mm). Stosuje się wysokoczęstotliwościową liniową sondę (30-50 MHz), przy której marker orientacji sondy jest konsekwentnie skierowany w stronę głowy myszy. Sonda jest początkowo ustawiona równolegle do długiej osi ciała myszy, a następnie obracana przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o około 30°-45°. Wprowadzane są drobne korekty, aby uzyskać wyraźny widok lewej komory przybrzusznej na lewą komorę. Dynamiczne akwizycje obrazów rozpoczyna się, gdy obraz ultradźwiękowy wyraźnie pokazuje komorę lewej komory, zastawkę aorty i mitralną oraz pokazuje poziome wyrównanie wierzchołka serca z drogą wypływową aorty. Wszystkie obrazy są rejestrowane przez doświadczonego operatora, stosując stałe parametry w celu zapewnienia porównywalności danych. Po badaniu sonda ultrasonograficzna jest czyszczona zgodnie ze standardowymi procedurami, a wszelkie pozostałości żelu są usuwane z ciała myszy. Mysz jest następnie przenoszona do ciepłej klatki do ścisłego monitoringu, aż całkowicie wyjdzie z znieczulenia i odzyska normalny ruch.

Przygotowanie sekcji parafinowych

Po zakończeniu testów behawioralnych myszy zostały znieczulone za pomocą intraperitonealnego zastrzyku pentobarbitalu sodu (20 mg/kg). Następnie ustabilizowanie systemowe osiągano poprzez przekrążenie przezsercyjne solą fizjologiczną, a następnie 10% paraformaldehydu (patrz Tabela materiałów). Po dokładnym wyodrębnieniu tkanek mózgowych zanurzano je w 10% paradehydzie przez 72 godziny fiksacji w temperaturze pokojowej. Ważne jest, aby zauważyć, że ponieważ perfuzja serca zmienia mikrostrukturę mięśnia sercowego, próbki serca użyte do analizy histologicznej w tym badaniu zostały pobrane specjalnie od myszy, które nie przeszły procedury perfuzji, podczas gdy wszystkie inne warunki manipulacji pozostały identyczne. Po zakończeniu fiksacji tkanki były płukane pod bieżącą wodą przez 6 godzin. Kolejne odwodnienie gradientowe przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanego procesora tkanek (patrz Tabela materiałów), obejmującego sekwencyjne zanurzenie w 60%, 70% i 90% etanolu przez 1 godzinę każda, a następnie 95% i 100% etanolu przez 2 godziny każda. Następnie odwodnione próbki były oczyszczane w ksylenie przez 2 godziny i infiltrowane parafiną w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Na koniec tkanki osadzano w parafinie za pomocą maszyny do osadzania, zapewniając standardową orientację anatomiczną. Po całkowitym zastygnięciu bloków w tle, sekcje o grubości 4 μm były cięte rotacyjnym mikrotomem, montowane na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną, suszone na powietrzu i przechowywane do dalszego barwienia i analizy.

Barwienie hematoksylinowo-eozynowe

Histologiczne badanie tkanek mózgu i serca przeprowadzono z użyciem barwienia hematoksyliny i eozyny (HE) w celu oceny urazu hipoksycznego i oceny terapeutycznych efektów interwencji elektroakupunktury. Przekroje tkanek o grubości 4 μm najpierw deparafinizowano w ksylenie I i ksylene II (po 10 minut każdy), a następnie rehydratowano przez serię stopniowego etanolu (100%, 95% i 80% każda, po 2 minuty), a następnie ostatnie płukanie wodą destylowaną. W celu barwienia przekroje zanurzano w roztworze hematoksyliny na 3-8 minut aż do uzyskania wyraźnego barwienia jądrowego, płukano pod bieżącą wodą w celu wywołania niebiesko, a następnie przez 1-3 minuty kontruminowano eozyną, aby uzyskać odpowiednie różowe zabarwienie cytoplazmy. Na koniec zabarwione fragmenty odwodniono w alkoholu absolutnym, oczyściono ksylenem i zamontowano balsamem neutralnym.

Barwienie Nissl

Aby ocenić stan przeżywalności neuronów w regionie hipokampa, zastosowano barwienie Nissl do obserwacji rozkładu ciał Nissl i morfologii komórkowej w neuronach. Po deparafinizacji i rehydratacji fragmentów parafiny tkanki mózgowej plasterki zanurzano w rozgrzewanym roztworze barwienia na błękit toluidynowy i inkubowano w temperaturze 56 °C w inkubatorze o stałej temperaturze przez 1 godzinę. Po barwieniu fragmenty delikatnie spłukiwano wodą destylowaną, a następnie przelano do roztworu różnicowania Nissl na kilka sekund do 2 minut. Proces różnicowania był dokładnie monitorowany pod mikroskopem, aż tło stało się niemal bezbarwne. Następnie zróżnicowane fragmenty były szybko odwodnione przez absolutną serię etanolową, czyszczone ksylenem i ostatecznie mocowane żywicą neutralną do trwałej konserwacji i obserwacji.

Trójbarwne barwienie masona

Barwienie trichromowe Masson, klasyczna technika barwienia tkanki łącznej, było stosowane głównie do odróżniania włókien kolagenowych od włókien mięśniowych tkanki serca. Po deparafinizacji i ponownym nawodnieniu sekcji parafiny serca, procedura barwienia została przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do zestawu barwienia Masson trichrom (patrz Tabela materiałów). Protokół barwienia przebiegał następująco. Początkowo przekroje zanurzano w świeżo przygotowanym roztworze enzymatycznej hematoksyliny Weigerta przez 4 minuty, aby barwić jądra, z delikatnym mieszaniem dla zapewnienia jednolitego barwienia. Następnie przekroje były płukane pod bieżącą wodą, różnicowane w 1% alkoholu kwasowym przez 5-10 sekund, a następnie traktowane roztworem niebiesko-fioletowym przez 4 minuty, aby uzyskać przezroczyste niebiesko-fioletowe barwienie jądrowe. Następnie przekroje były barwione roztworem fuchsyny kwasu Ponceau przez 5 minut, a następnie różnicowano w roztworze kwasu fosfolomibdykowego 0,2% przez 1 minutę. Po krótkim płukaniu w słabym roztworze roboczym przez 1 minutę, przekroje były przez 2 minuty kontrastowane roztworem błękitu anilinowego (pH 6,8), aby podkreślić włókna kolagenowe. Po zakończeniu etapów barwienia przekroje były odwodnione przez serię stopniowego etanolu, czyrowane w ksylenie, a następnie montowane neutralnym balsamiem. Wszystkie zamontowane sekcje były cyfrowo rejestrowane za pomocą w pełni zautomatyzowanego systemu skanowania szkiełek (patrz Tabela materiałów) do dalszej analizy.

Analiza statystyczna

Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. Dane zostały przeanalizowane za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu LSD post hoc lub t-testu. Do analizy danych z OFT i MWM użyto dwukierunkowej ANOVA. P < 0,05 uznano za poziom istotności. Analiza statystyczna i wykresy zostały stworzone przez oprogramowanie GraphPad Prism 9.0.

Wyniki

Elektroakupunktura łagodzi zachowania podobne do lęku oraz zaburzenia poznawcze wywołane przewlekłą, długotrwałą hipoksją u myszy.

Zachowania podobne do lęku u myszy poddanych CH po raz pierwszy oceniono za pomocą OFT (Rysunek 3A). Wykresy trajektorii wykazały wyraźne wzorce zachowań: myszy kontrolne wykazywały silne tendencje eksploracyjne w nowym środowisku, z wzorcami ruchu obejmującymi całą arenę, koncentrując się głównie w strefach narożnych ...

Dyskusja

Badanie potwierdza, że długotrwała przewlekła hipoksja może wywoływać zachowania podobne do lęku oraz zaburzenia pamięci przestrzennej u myszy, co jest zgodne z wcześniejszymi wynikami badań^26,27. Tymczasem stwierdziliśmy, że długotrwała przewlekła hipoksja może również powodować zaburzenia serca i uszkodzenia strukturalne mięśnia sercowego. Obecnie jednak brakuje strategii terapeutycznych, które mogłyby jednocześnie złagodzić zaburzenia poznawcze i sercowe wywoł...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór paraformaldehydu 10%	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Nauka	SA201	System śledzenia wideo
Myszy C75BL/6J	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	Nr 110322220103041767	Płeć: mężczyzna, Waga: 18  22 g
Jednorazowe igły akupunktury	Huatuo	246076	Sterylne igły akupunkturowe do jednorazowego użytku (0,25 mm i ostre; 13 mm)
Urządzenie elektroakupunktury	Wielki Mur	KWD-808 I
HistoCore MULTICUT - Półautomatyczny mikrotom obrotowy	Niemcy, Leica	RM2245	Krojnik do parafiny
Hwato akupunktura  igła	Fabryka Sprzętu Medycznego w Suzhou	2655519
Izofluran	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22
Masson’ [eos]s Trichrome Stain Kit	solarbio	G1340	Zestaw do barwienia Masson
Labirynt wodny Morris	Sansbio	SA201	Urządzenie Morris Water Mae
NanoZoomer Patologia Cyfrowa	Fotonika Hamamatsu K. K	C9600-01
NDP. Widok 2	Japonia, Sakura		Oprogramowanie do skanowania slajdów
Aparat do znieczulenia dla małych zwierząt	Napęd na tylne koła	YL-LE-A106
Tissue Tech Prisma Plus	Japonia, Sakura	20B2X00014000034	W pełni zautomatyzowane urządzenie zaprojektowane do barwienia próbek takich jak przekroje tkanek osadzonych w parafinie, mrożone fragmenty oraz komórki montowane na szkiełkach.
Moduł osadzania Tissue-Tek TEC 6	Japonia, Sakura	M01-021E-02	Maszyna do osadzania parafiny