Artykuł metodologiczny

Amyloid i architektura krzyżowa beta

DOI:

10.3791/69350

⸱

13 lutego 2026

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Sussex

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błony amyloidowe są formowane przez liczne białka, a powstałe włókna mają strukturę "krzyżowego arkusza β". Opisujemy tutaj, jak próbki włókien amyloidowych mogą być przygotowywane do dyfrakcji rentgenowskiej włókien i jak wzory mogą być analizowane.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibrile amyloidowe składają się z nieprawidłowo złożonego, samouzbrajanego białka zorganizowanego w dobrze określoną, powtarzalną strukturę. Są dobrze znane ze swojej ważnej roli w chorobach nieprawidłowego złożenia białek, w tym chorobie Alzheimera i cukrzycy typu 2, w których nierozpuszczalne fibrile amyloidowe osadzają się w tkankach. Ponadto stwierdzono, że odgrywają ważną funkcjonalną rolę w wielu organizmach, zapewniając wytrzymałość, rusztowanie i ochronę. Pierwsze modele strukturalne amyloidów opierały się na danych z dyfrakcji promieni X z paczek wyrównane fibrili amyloidowych. Wynikiem tego były wczesne modele ogólnej struktury krzyżowej-β, która została zastąpiona przez bardziej szczegółową analizę dyfrakcji z wysoce zorientowanych i półkrystalicznych próbek, co pozwoliło na uzyskanie szczegółów organizacji peptydów w powtarzalną architekturę. Skupiliśmy się na opisywaniu metod określania podstawowej architektury tych fibrili i opisaliśmy wspólne cechy fibrili amyloidowych z różnych źródeł patogennych, funkcjonalnych i syntetycznych. Opisujemy przygotowanie próbek, gromadzenie danych i następującą analizę danych w celu uzyskania modelu struktury, który można porównać z danymi eksperymentalnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibryle amyloidowe zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w grupie chorób znanych jako amyloidozy, w których białkowe fibryle gromadzą się w przestrzeniach pozakomórkowych tkanek1. Każda choroba charakteryzuje się określonym białkiem prekursorowym, które ulega zmianie konformacyjnej tworząc wysoce uporządkowane, stabilne fibryle białkowe2,3. Bardziej współczesna definicja fibryli amyloidowych obejmuje teraz fibryle gromadzące się w środowisku komórkowym. Ostatnio zidentyfikowano wiele układów funkcjonalnych, które wykorzystują strukturę amyloidową w celu zapewnienia stabilności, adhezji, a nawet przechowywania informacji. Pomimo szerokiej gamy struktur białkowych, które mogą samorzutnie łączyć się w fibryle amyloidowe, wszystkie one mają wspólną strukturę krzyżową4. Ta krzyżowa aranżacja została po raz pierwszy opisana przez Astbury dla białka białka kurzego jaja5, a później dalej wyjaśniona przez Geddesa dla jedwabiu krzyżowego6. W tej architekturze białka, fibryle składają się z pasm β, które biegną prostopadle do osi fibryli, a następnie układają się w arkusze β, które łączą się za pośrednictwem łańcuchów bocznych, tworząc to, co później nazwano zaciski steryczne7. To tworzy bardzo stabilną organizację utrzymywaną za pomocą wiązań wodorowych biegnący równolegle do włókna, obok oddziaływań hydrofobowych, elektrostatycznych i polarnych poprzez łańcuchy boczne8.

Wczesne badania strukturalne wykorzystywały dyfrakcję rentgenowską na włóknach do badania struktury fibryli amyloidowych, gdzie fibryle były ustawiane i orientowane w celu utworzenia pakietu fibryli amyloidowych, które mogły być umieszczone w wiązce rentgenowskiej dyfraktometru9,10. Wygenerowano ogólną strukturę fibryli amyloidowych, aby pasowała do wzorców dyfrakcyjnych z kilku fibryli amyloidowych wyodrębnionych z ludzkich tkanek chorobowych lub wyhodowanych in vitro4,, a to dostarczyło podstawy dla dalszych opisów strukturalnych11. W ostatnich latach postępy w rezonansie magnetycznym stanu stałego (ssNMR), mikrokrystalicznej dyfrakcji rentgenowskiej oraz kriogenicznej mikroskopii elektronowej (CryoEM) dostarczyły szczegółowych informacji atomowych dotyczących struktury krzyżowej11. Jednak metoda dyfrakcji rentgenowskiej na włóknach pozostaje ważna i użyteczna, dostarczając informacji dotyczących powtarzającej się organizacji białek. Ponadto, w niektórych przypadkach informacje dotyczące dłuższego zasięgu porządku mogą być dostępne. Podstawowo, dyfrakcja rentgenowska na włóknach jest często stosowana do potwierdzenia obecności fibryli amyloidowych utworzonych z różnych białek, a wzór krzyżowy jest jednym z głównych wymagań dla klasyfikacji złożonego włókna jako amyloidu12.

Tutaj opisujemy metodologię stosowaną do przygotowania fibryli amyloidowych i ich ustawienia do zbierania danych dyfrakcyjnych rentgenowskich na włóknach. Ponadto, dostarczamy szczegółów, w jaki sposób dane dyfrakcyjne mogą być dalej analizowane w celu wygenerowania modelu strukturalnego, jego przewidywanego wzoru dyfrakcyjnego i porównania z danymi dyfrakcyjnymi z fibryli uzyskanych ex-vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparation of fibrillar samples for X-ray fiber diffraction

  1. Rozpuść białko lub peptyd interesujący w optymalnych warunkach dla formowania fibryli dla wybranego peptydu amyloidogennego i oceń formowanie fibryli za pomocą mikroskopii elektronowej lub mikroskopii sił atomowych. Szczegóły dotyczące przygotowania próbek i przeprowadzania obrazowania są dostępne w innym miejscu13. Upewnij się, że fibryle są długie, proste i nierozgałęzione jak pokazano na Rysunku 1. Na przykład fibryle pokazane na Rysunku 1 zostały przedstawione za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej (TEM). Umieść kroplę zawierającą fibryle na siatce mikroskopu elektronowego, a następnie wykonaj ujemne barwienie za pomocą octanu uranylu14.
    UWAGA: Korzystne jest równomierne pokrycie i rozmieszczenie fibryli na siatce.
  2. Wyrównaj, aby uzyskać pęczek fibryli, których osie włókien są idealnie wszystkie równoległe (Rysunek 2A).
    1. Roztapiaj wosk z świec do stanu ciekłego za pomocą płyty grzewczej. Za pomocą szkła tnącego, takiego jak diamentowe pióro, wytnij 1 mm kapilarki ze szkła borokrzemowego na długość około 2-3 cm i krótko zanurz je w ciekłym wosku. Wyciągnij wosk z świec w górę dzięki działaniu kapilarnemu (około 1-2 mm długości wewnątrz kapilarki). Upewnij się, że powierzchnia wosku jest płaska, aby zawiesina fibryli mogła spoczywać równomiernie.
    2. Za pomocą plastiliny przymocuj uszczelnione kapilarkę poziomo w naczyniu Petriego z odstępem 0,5 mm do 2 mm między zakończeniami wypełnionymi woskiem (Rysunek 2A).
    3. Za pomocą pipety ostrożnie zawieś 10 μL kroplę roztworu między zakończeniami wypełnionymi woskiem dwóch kapilar. Upewnij się, że roztwór styka się z oboma końcami wosku, ale nie rozciąga się na szklany materiał.
    4. Zapobiegnij zanieczyszczeniu próbki kurzem, przykrywając naczynie Petriego. Pozostaw próbkę do odparowywania przez noc, co spowoduje wyrównanie fibryli (zobacz Rysunek 2A).
      UWAGA: Całkowite wyschnięcie próbki może zająć kilka dni, a zależy to od temperatury otoczenia i wilgotności oraz lepkości próbki.
    5. Uszczelń płytkę; inkubuj w niższych temperaturach w lodówce lub inkubuj z użyciem wilgotności w szczelnym pudełku, aby spowolnić schnięcie, co może spowodować lepsze wyrównanie próbki.
  3. Wyrównaj fibryle amyloidowe w szklanej kapilarce (Rysunek 2B).
    1. Przymocuj strzykawkę 1 mL wyposażoną w mały kawałek gumowego węża do szerokiego końca do kapilary ze szkła krzemianowego o średnicy 0,7 mm i wsadzisz 2-3 cm zawiesiny fibryli.
    2. Uszczelnij jedno zakończenie kapilary za pomocą stopionego wosku i pozwól, aby drugi koniec pozostawał otwarty, aby umożliwić odparowanie. Ułóż kapilarkę pionowo i pozwól jej wyschnąć przez kilka dni lub tygodni, aż uformuje się wysuszony dysk w rurze kapilarnej (Rysunek 2B).
  4. Wyrównaj fibryle jako "matę" lub cienką warstwę (​​Rysunek 2C).
    1. Umieść wysokie stężenie (np.>10 mg/mL) próbki fibryli na szklanej szlamie, parafilmie lub kawałku teflonu, przykryj i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 24 godziny. Powinna się wyschnąć, tworząc cienką, płaską warstwę na powierzchni. Ostrożnie podnieś ją skalpem, a następnie przymocuj do rury kapilarnej za pomocą kleju lub plastiliny.
    2. Mata będzie miała losowe ułożenie fibryli (zobacz Rysunek 2C). Ostrożnie zamontuj próbkę na głowicy goniometru, aby wiązka rentgenowska przechodziła przez krawędź próbki i równolegle do płaszczyzny folii (Rysunek 2C).
      UWAGA: Diffrakcja przez powierzchnię folii da efekt dyfrakcyjnych pierścieni z powodu losowego ułożenia (zobacz Rysunek 2C).
  5. Zbadaj próbkę.
    1. Zbadaj, jak dobrze jest wyrównany, badając go przez krzyżową polaryzację pod mikroskopem świetlnym. Jeśli obecne jest dwójłomność, może to sugerować dobre wyrównanie w paśmie fibryli.
    2. Przymocuj próbkę kapilarki do głowicy goniometru za pomocą plastiliny. Weź pod uwagę, czy próbka jest pakietem włókien, matą czy dyskiem, umieszczając ją w wiązce promieniowania rentgenowskiego.
      1. Zwróć uwagę, że oś obrotu próbki będzie wokół osi włókna dla pakietu włókien (Rysunek 2A), podczas gdy w dyskach włókna mają tendencję do wyrównania na średnicy rury (Rysunek 2B). Mata będzie miała dwa odrębne kierunki (równolegle do płaszczyzny folii i prostopadle do niej) (Rysunek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład CcbMet24: Rysunek 1 przedstawia mikroskopowe zdjęcia elektronowe, na których widać wysoką gęstość fibril amyloidowych na siatce odpowiedniej do przygotowania próbki do badań rentgenowskich. Rysunek 2 opisuje różne tekstury, które można uzyskać z włóknistych próbek, takich jak pęczek włókien (Rysunek 2A), dysk (Rysunek 2B), mat/folia (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozpraszanie rentgenowskie na włóknach może być wykorzystywane do oceny, czy próbka tworzy strukturę amyloidową oraz do uzyskania dalszych informacji na temat organizacji molekularnej białka lub peptydu prekursora wewnątrz włókien. Tutaj opisano metody, którymi można przygotować włókniste próbki do rozpraszania rentgenowskiego na włóknach, uzyskać dane i następnie je przeanalizować. Krytycznie, jakość uzyskanych danych zależy zarówno od uporządkowania wewnątrz pojedynczych włókien. Dlatego początkowa przygotowanie próbki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Pawłowi Sikorskiemu i profesorowi Edwardowi Atkinsowi za pomoc w opracowaniu programu CLEARER i analizie wzorców. Program został napisany przez dr O Sumner Makin. Praca ta została wsparta finansowaniem z Alzheimer's Research Trust i BBSRC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.7 mm diameter X-ray  kwarcowych kapilar szkła GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, GermanyQ-07-001-80
Szklane kapilark 1,5 mm borosilicateHarvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)BS4 30-0074przykład, dostępny u innych producentów
Protein crystallography X-ray diffractometerRóżneRóżne producentów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shirahama, T., Cohen, A. S. High resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril. J Cell Biol. 33, 679-706 (1967).
  2. Buxbaum, J. N., et al. Amyloid nomenclature 2024: Update, novel proteins, and recommendations by the International Society of Amyloidosis (ISA) Nomenclature Committee. Amyloid. 31 (4), 249-256 (2024).
  3. Dobson, C. M. The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1406), 133-145 (2001).
  4. Sunde, M., et al. Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. J. Mol. Biol. 273, 729-739 (1997).
  5. Astbury, W. T., Woods, H. J., Bragg, W. L. X-ray studies of the structure of hair, wool, and related fibers. II. The molecular structure and elastic properties of hair keratin. Philos Trans R Soc Lond A. 232, 333-394 (1934).
  6. Geddes, A. J., Parker, K. D., Atkins, E. D., Beighton, E. "Cross-beta" conformation in proteins. J Mol Biol. 32 (2), 343-358 (1968).
  7. Sawaya, M. R., et al. Atomic structures of amyloid cross-beta spines reveal varied steric zippers. Nature. 447 (7143), 453-457 (2007).
  8. Makin, O. S., Atkins, E., Sikorski, P., Johansson, J., Serpell, L. C. Molecular basis for amyloid fibril formation and stability. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (2), 315-320 (2005).
  9. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. J Histochem Cytochem. 16 (11), 673-677 (1968).
  10. Kirschner, D. A., Abraham, C., Selkoe, D. J. X-ray diffraction from intraneuronal paired helical filaments and extraneuronal amyloid fibers in Alzheimer disease indicates cross-beta conformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (2), 503-507 (1986).
  11. Ke, P. C., et al. Half a century of amyloids: Past, present and future. Chem Soc Rev. 49 (15), 5473-5509 (2020).
  12. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid. 21 (4), 221-224 (2014).
  13. Morris, K. L., Serpell, L. C. X-ray fiber diffraction studies of amyloid fibrils. Methods Mol Biol. 849, 121-135 (2012).
  14. Al-Hilaly, Y. K., et al. Tau (297-391) forms filaments that structurally mimic the core of paired helical filaments in alzheimer's disease brain. FEBS Lett. 594 (5), 944-950 (2020).
  15. Makin, O. S., Sikorski, P., Serpell, L. C. Clearer: A new tool for the analysis of X-ray fiber diffraction patterns and diffraction simulation from atomic structural models. Appl Cryst. 40 (5), 966-972 (2007).
  16. Winn, M. D. An overview of the CCP4 project in protein crystallography: An example of a collaborative project. J Synchrotron Radiat. 10 (Pt 1), 23-25 (2003).
  17. Squire, J., et al. New CCP13 software and the strategy behind further developments: Stripping and modelling of fiber diffraction data. Fibre Diffr Rev. 11, 7-19 (2003).
  18. Makin, O. S., Serpell, L. C. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2005).
  19. The pymol molecular graphics system. , DeLano Scientific. San Carlos, USA. (2002).
  20. Jahn, T. R., et al. The common architecture of cross-beta amyloid. J Mol Biol. 395 (4), 717-727 (2009).
  21. Madine, J., et al. Structural insights into the polymorphism of amyloid-like fibrils formed by region 20-29 of amylin revealed by solid-state NMR and X-ray fiber diffraction. J Am Chem Soc. 130 (45), 14990-15001 (2008).
  22. Madine, J., Copland, A., Serpell, L. C., Middleton, D. A. Cross-β spine architecture of fibrils formed by the amyloidogenic segment nfgsvqfv of medin from solid-state NMR and X-ray fiber diffraction measurements. Biochemistry. 48 (14), 3089-3099 (2009).
  23. Papapostolou, D., et al. Engineering nanoscale order into a designed protein fiber. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (26), 10853-10858 (2007).
  24. Steinmetz, M. O., et al. Atomic models of de novo designed ccβ-met amyloid-like fibrils. J Mol Biol. 376 (3), 898-912 (2008).
  25. Blake, C., Serpell, L. Synchrotron x-ray studies suggest that the core of the transthyretin amyloid fibril is a continuous β-helix. Structure. 4, 989-998 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

W kna amyloidoweb dne zwijanie bia ekdyfrakcja rentgenowskachoroba Alzheimeracukrzyca typu 2struktura w kienprzygotowanie pr bekanaliza danychorganizacja peptyd w

Powiązane artykuły