Kompleksowy workflow dla proteomiki plazmy za pomocą spektrometrii masowej: strategia odkrywania biomarkerów w ogólnoustrojowych chorobach ludzkich

Podsumowanie

Proteomika plazmy umożliwia odkrywanie biomarkerów chorób ogólnoustrojowych poprzez minimalnie inwazyjne pobieranie próbek. Pomimo wyzwań analitycznych związanych ze złożonością plazmy, badanie to prezentuje zoptymalizowany workflow chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS/MS), który zwiększa pokrycie proteomem, redukuje zmienność i poprawia powtarzalność, umożliwiając dokładne porównania próbek chorobowych i kontrolnych.

Streszczenie

Osoczo, bezkomórkowy składnik krwi, stanowi mało inwazyjne i bogate źródło informacji biomolekularnych, co czyni je idealnym do badania chorób ogólnoustrojowych. Pojawienie się technologii proteomicznych o wysokiej przepustowości zrewolucjonizowało analizę osocza, umożliwiając szeroką identyfikację i ilościową identyfikację krążących białek. Te postępy ułatwiły odkrywanie biomarkerów do wczesnej diagnostyki, rokowania oraz terapeutycznego celowania w różne zaburzenia, w tym nowotwory i choroby zapalne. Jednak inherentna złożoność plazmy, wraz z niespójnymi metodami przygotowania i analizy próbek, historycznie ograniczała zasięg i powtarzalność proteomu. Wczesne podejścia oparte na prymitywnej analizie osocza często cierpiały na słabą spójność i istotne efekty partiowe, co utrudniały wiarygodne badania porównawcze w różnych kohortach klinicznych.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, obecne badanie wprowadza solidny i skalowalny workflow proteomiki plazmy. Protokół integruje kluczowe kroki przygotowawcze, takie jak immunodepletyj, filtracja cutoff masy cząsteczkowej, liofilizacja, ilościowa i normalizacja białek, trawienie enzymatyczne oraz profilowanie LC-MS/MS. Ta zoptymalizowana strategia znacząco zwiększa głębokość proteomu i zmniejsza zmienność, umożliwiając dokładniejszą i powtarzalną analizę różnicowej ekspresji białek między przypadkami choroby a zdrowymi kontrolami. Workflow ten stanowi cenną platformę dla badaczy dążących do generowania wysokiej jakości danych proteomicznych z osocza, co ostatecznie przyczynia się do rozwoju diagnostyki opartej na biomarkerach i medycyny spersonalizowanej.

Wprowadzenie

Osoczo, bezkomórkowy składnik krwi, zyskuje coraz większe uznanie jako rezerwuar informacji biologicznych istotnych dla badań chorób. Zawiera mnóstwo różnorodnych krążących biomolekuł, od białek i metabolitów po lipidy i kwasy nukleinowe, co odzwierciedla fizjologiczny i patologiczny stan organizmu. Ta systemowa natura osocza czyni ją idealnym biopreparatem do badań nad patofizjologią chorób, od nowotworów po zaburzenia metaboliczne i zapalne. Główną zaletą wykorzystania osocza jako próbki jest jej minimalnie inwazyjna metoda zbierania, umożliwiająca powtarzane pobieranie próbek w warunkach klinicznych, co jest istotne dla obserwacji postępu choroby lub odpowiedzi terapeutycznej. Jednak osocze wykazuje niezwykle złożoną matrycę proteomiczną, w której białka takie jak albuminy i poziomy immunoglobuliny obejmują ponad dziesięć rzędów wielkości, maskując identyfikację¹.

W ciągu ostatnich dwóch dekad proteomika plazmy umożliwiła identyfikację klinicznie istotnych biomarkerów, takich jak beta-ludzka gonadotropina kosmówkowa (β-hCG) i troponina I, napędzana postępem w technologiach analizy białek na dużą skalę². Narzędzia te przyjmują jako dane wejściowe wysoce wrażliwe informacje i dzięki swojej wysokiej przepustowości umożliwiają wielkoskalowe profilowanie białek osocza. Dzięki pojawieniu się platform do chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS/MS) możliwe jest obecnie analizowanie tysięcy gatunków białek przy użyciu zaledwie 10-50 μL wejściowego osocza, z dynamicznym zakresem detekcji obejmującym kilka rzędów wielkości ^3,4. To zwiększyło wykorzystanie proteomiki plazmy w badaniach translacyjnych: wczesne wykrywanie chorób, ulepszone modele prognostyczne oraz odkrywanie nowych celów terapeutycznych⁵.

Ważnym kamieniem milowym w tej dziedzinie było utworzenie Projektu Proteomu Plazmy Człowieka (HUPO-HPPP), który systemowo katalogował białka osocza i wykazał wykonalność proteomiki osocza jako ugruntowanej dziedziny⁶. Następnie Konsorcjum Analizy Klinicznych Proteomicznych Nowotworów (CPTAC) przyjęło rygorystyczne zweryfikowane protokoły i badania międzylaboratoryjne, aby rozwiązać kwestie powtarzalności, które wcześniej utrudniały badania proteomiczne⁷. Inicjatywy te podkreśliły potrzebę standaryzacji i podkreśliły kluczowe procedury, w tym jednolite traktowanie plazmy, wyczerpanie obfitości białek, trawienie enzymatyczne oraz spójne parametry LC-MS/MS. Najnowsze badania Geyera i współpracowników wykazały, że sygnatury proteomiczne plazmy mogą być niezawodnie generowane u wielu osób, gdy stosuje się standaryzowane metody, co stanowi podstawę do badań na poziomie populacji i procesów walidacji biomarkerów⁸.

Rozwój proteomiki plazmy został w dużym stopniu ukształtowany przez uznanie kontroli jakości (QC) i wskaźników wydajności jako kluczowych elementów projektowania eksperymentów. Konwencjonalnie różnice w wydajności trawienia, szybkości identyfikacji peptydów i osiągach instrumentów prowadziły do niespójności w badaniach, co wpływa na powtarzalność. Przeprowadzono wiele badań mających na celu rozwiązanie tych problemów. Gawor i in. przedstawili mierzalne wskaźniki jakości przygotowania próbki i wydajności spektrometrii mas, zapewniając tym samym systematyczną metodę oceny odporności pipeline'u profilowania białek⁹. Tsantilas i in. zaprezentowali narzędzia do komputerowego benchmarkingu, które pozwalają badaczom porównywać zbiory danych na różnych platformach i w laboratoriach, zwiększając tym samym przejrzystość w prezentacji danych proteomicznych¹⁰. Ponadto postępy w metodologii, takie jak immunodepletyj, frakcjonowanie z wykluczeniem wielkości oraz niezależne od danych pozyskiwanie (DIA), zwiększyły pokrycie proteomu i zmniejszyły błąd techniczny^11,12. Takie środki zapewnienia jakości zapewniają, że dane proteomiczne z osocza są powtarzalne i stanowią fundament dla przyszłych badań translacyjnych klinicznych.

Pomimo tych istotnych postępów, złożoność plazmy wciąż nawiązuje do wyzwań. Często bezpośrednia analiza surowego osocza daje suboptymalne pokrycie proteomem, ponieważ bardzo obfite białka przeważają nad analizami o niskiej ilości, z których wiele jest najbardziej obiecującymi kandydatami na biomarkery. Ponadto zmienność techniczna wynikająca ze zmiennej ilości białek, niepełnego trawienia i niewystarczającego oczyszczenia może przyczyniać się do powstawania artefaktów partii i zmniejszenia porównywalności kohorty¹³. Te ograniczenia podkreślają potrzebę wysoko zoptymalizowanych przepływów pracy, które równoważą głębię proteomu, powtarzalność i skalowalność. Protokół badania odpowiada na tę potrzebę, demonstrując zoptymalizowany workflow proteomiki plazmy, który łączy immunodepletyję, filtrację z ograniczeniem masy molekularnej, liofilizację, normalizację i ilościowanie białek, trawienie enzymatyczne oraz profilowanie LC-MS/MS. Poprzez zwiększenie zasięgu proteomów i zmniejszenie zmienności technicznej, ramy metodologiczne umożliwiają spójną względną ilościową liczbę między grupami dotkniętymi chorobą a grupami kontrolnymi. Dzięki wprowadzeniu skalowalności i dostosowaniu do analiz dalszych etapów, workflow zapewnia użyteczną, powtarzalną metodę wydobycia klinicznie istotnych informacji z proteomiki plazmy.

Protokół

Protokół ten określa uproszczony przepływ pracy zaprojektowany w celu ulepszenia proteomiki plazmy w odkrywaniu biomarkerów w ogólnoustrojowych chorobach zapalnych^14,15. Badanie przeprowadzono zgodnie z Komitetem Etyki Instytucjonalnej oraz Deklaracją Helsińską z 1975 roku, zrewidowaną w 2000 roku. Uczestnicy uzyskali świadomą zgodę. Początkowo próbki osocza poddawane są immunodepletyjnie w celu usunięcia białek o wysokiej ilości, a następnie przechodzą filtrację opartą na masie cząsteczkowej, aby zmniejszyć złożoność próbki. Następnie próbki są liofilizowane i ilościowo określane, aby zapewnić odpowiednie stężenie białka do dalszego przetwarzania. Po normalizacji białka poddawane są trawieniu tryptycznym, aby uzyskać peptydy odpowiednie do analizy. Wreszcie, spektrometria mas jest stosowana do wykrywania i ilościowego określenia białek o niskiej obfitości, co ułatwia wiarygodne porównania zdrowych i chorobowych (rysunek 1) pokazuje pipeline proteomiki krwi.

1. Zbieranie próbek:

1. Pobierz 3 mL krwi od uczestników rurek z kwasem etylendiaminetetraoctowym (EDTA) Vacutainer poprzez nakłucie żyły z żyły przedkubitalnej w warunkach aseptycznych. Wykonuje to wykwalifikowany flebotomista.
2. Aby oddzielić plazmę, wirówkuj próbki (rotor o stałym kącie z 12 × 15 mL) przez 10 minut przy 704 g. Przechowywać próbki osocza w temperaturze -80 °C do czasu dalszego badania.

2. Immunodepletyja

UWAGA: Immunodepletyja to metoda oparta na chromatografii powinowactwowej, stosowana do selektywnego usuwania białek o wysokiej obserwacji z płynów biologicznych, takich jak surowica, osocze i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Wkład spinowy zawierający unieruchomione przeciwciała celuje i wychwytuje 14 powszechnych białek o wysokiej obserwacji, w tym albuminę, immunoglobuliny (IgG, IgA, IgM), transferrinę oraz dopełnienie C3. Białka te są zatrzymywane w wkładce, podczas gdy białka o niskiej obfitości przechodzą do dalszej analizy. Technika ta wzmacnia profilowanie proteomiczne poprzez zmniejszenie złożoności próbek i poprawę wykrywania potencjalnych biomarkerów. Podejście to jest szeroko stosowane w proteomice plazmy w celu poprawy czułości i powtarzalności^16,17.

1. Przygotowanie naboju
   1. Wyjmij wkład 0,45 mL z lodówki. Zostaw ją do wyrównania temperatury otoczenia.
   2. Przygotuj bufor A równoważnie/załadowanie/mycie i elucię bufora B zgodnie z liczbą przetworzonych próbek. Należy nałożyć około 5 mL Buforu A i 2 mL Buforu B na każdą próbkę plazmy o pojemności 10 μL. Przelew do 50 mL sterylnych rurek wirówek.
   3. Oznacz dwie sterylne strzykawki Luer-Lok 5 mL jako A dla Buforu A i B dla Buforu B.
2. Przygotowanie próbki plazmy
   1. Rozcieńcz każdą próbkę plazmy o pojemności 10 μL 190 μL Buforu A do końcowej objętości 200 μL.
      UWAGA: Dodaj inhibitory proteaz do buforu A, aby uniknąć degradacji białek osocza podczas przetwarzania.
   2. Próbka plazmy może zawierać cząstki stałe. Może to zatkać wkład. Aby zapobiec zatkaniu i poprawić klarowność próbki, rozcieńczoną próbkę wiruj przez filtr spinowy o pojemności 0,22 μm przez 1 minutę w temperaturze 16 000 ×g przy 4 °C.
3. Układ naboju
   1. Zdejmij nakrętkę i dolną nakrętkę i przechowuj je do późniejszego użytku.
   2. Załóż adapter Luer-Lok na kartridżu obrotowym.
   3. Włóż 4 mL Bufora A do strzykawki oznaczonej "A" i podłącz ją do adaptera Luer-Lok.
   4. Stopniowo przepuszczaj Buffer A przez wkład, aby umożliwić żywicy wyrównanie się i wyparcie uwięzionego powietrza.
   5. Aspiruj nadmiar buforu z góry wkładu sterylną mikropipetą.
   6. Wyjmij adapter Luer-Lok i włóż wkład wirunkowego do rurki zbierającej z nakrętką oznaczoną F1.
4. Ładowanie próbek i zbieranie frakcji
   1. Dodaj 200 μL filtrowanej, rozcieńczonej plazmy bezpośrednio na warstwę żywicy.
   2. Wiruj wkład w 100 × g przez 1 minutę w 4 °C. Pozostaw wkład bez zakrętki lub luźno zakręcony, aby zapewnić płynny przepływ.
   3. Zbierz frakcję przepływową F1 w oznaczonej probówce zbierającej. Upewnij się, że po wirowaniu łóżko żywicy i frit pozostają wilgotne.
   4. Pozwól wkładowi stać w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
5. Płukanie i odzysk frakcji przepływu
   1. Dodaj 400 μL buforu A na łoże żywicy i wiruj w 100 × g przez 2,5 minuty w temperaturze 4 °C. Dodaj ten eluat do probówki zbiorczej F1.
   2. Przełóż wkład do nowej probówki oznaczonej F2.
   3. Dodaj kolejne 400 μL buforu A i wiruj w 100 × g przez 2,5 minuty w 4 °C. Zbieraj eluat w probówce F2.
6. Eluacja białek związanych
   1. Wyjmij wkład z rurki F2 i podłącz adapter Luer-Lok.
   2. Napełnij strzykawkę oznaczoną "B" 2,5 mL Buforu B i podłącz ją do wkładu.
   3. Powoli przepychaj Bufor B przez wkład, aby wyluć związane białka o wysokiej obfitości do świeżej probówki zbiorczej.
      UWAGA: Zachowaj ułamek wiązany, jeśli wymagana jest dalsza analiza; w przeciwnym razie odrzucaj odpowiednio.
7. Ponowne wyważenie naboju
   1. Wyjmij strzykawkę z buforem B z wkładu i podłącz strzykawkę oznaczoną "A" zawierającą 5 ml buforu A.
   2. Powoli przepychaj Buffer A przez stół żywicy, aby wyrównać wkład z przepływem 0,5 mL na minutę.
      UWAGA: Nie pozwól, by żywiczne łoże ani frit wyschły. Podczas przechowywania zostaw niewielką ilość bufora na szczycie fritu.
   3. Po wyważeniu wkład jest gotowy do kolejnej próbki.
8. Zastosowanie w dalszej części
   1. Aby uzyskać maksymalną regenerację białek o niskiej ilości, połącz frakcje przepływu F1 i F2.
      UWAGA: F1 i F2 mogą być również analizowane oddzielnie, jeśli wymagana jest analiza różniczkowa. Dodany bufor wynosi 1 mL, więc łączna frakcja F1 może wynosić ~850 μL, aby zapewnić dobrą regenerację. Przeanalizuj surowe osocze, przepływ i eluat za pomocą elektroforezy żelowej sodu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowej (SDS-PAGE), aby potwierdzić usunięcie 14 największych białek o wysokiej obserwacji z przepływu. 12,5 μL przepływu przez F1, surową plazmę i eluat zostanie użyte do załadunku w żelu, aby uzyskać objętość odwiertu 25 μL (bufor próbki Laemmli: stosunek próbki 2:1)

3. Stężenie białka przy użyciu koncentratora spinowego o mocy 5 kDa

UWAGA: Koncentracja próbki za pomocą koncentratora spinowego o mocy 5 kDa opiera się na zasadzie wykluczania rozmiaru i filtracji molekularnej, aby osiągnąć szybkie stężenie i wysoki odzysk docelowych biomolekuł w jednej probówce. Umożliwia to stężenie białek poprzez usunięcie wymiany rozpuszczalnika i buforu lub odsolanie roztworu białkowego.

1. Napełnij koncentrator spinu do 4 mL próbki białka.
2. Włóż koncentrator wiru do chłodniczej wirówki.
3. Wirować w 5 000 × g w 10 °C przez 30 minut lub do osiągnięcia pożądanego zmniejszenia objętości (np. 30× stężenia).
4. Wyjmij koncentrator spinu z wirówki i odzyskaj skoncentrowaną próbkę z dna komory retencyjnej za pomocą mikropipety. Aby zapewnić dobrą regenerację, spodziewaj się pobrania koncentratu ~150 μL z łącznej próbki białka 850 μL.
   UWAGA: Upewnij się, że błona nie wysycha podczas wirowania, aby zachować integralność białek i efektywność odzysku.

4. Odsolanie i wymiana buforu

1. Usuń filtrat z dolnej komory koncentratora.
2. Napełnij rurkę wirówki równą objętością buforu wodorowęglanu amonu o pojemności 50 mM (pH 7,2-7,4). (Na przykład, jeśli retencja wynosi 150 μL, dodaj 150 μL buforu)
3. Ponownie wirować w 5 000 × g w temperaturze 10 °C, aż do osiągnięcia pierwotnego stężenia.
4. Powtórz ten proces wymiany buforu trzy razy, aby usunąć około 99% zanieczyszczeń małych cząsteczek, takich jak sole czy mocznik.
5. Skoncentruj próbki białka poprzez liofilizację za pomocą szybkiego liofilizatora próżniowego.
   UWAGA: Dostosuj liczbę cykli w zależności od stopnia odsalania wymaganego dla zastosowań końcowych.

5. Ilościowa analiza białek za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA)

UWAGA: Stężenie białka w próbkach zostało określone za pomocą testu białka BCA, przy czym standardem była albumina surowicy bydła (BSA). Test BCA to kolorymetryczna metoda kolorymetryczna na bazie kwasu bicynchoninowego zgodna z detergentami do wykrywania i ilościowego określania całkowitego białka. Opiera się na redukcji Cu²⁺ do Cu⁺ przez białka w środowisku zasadowym (reakcja Biureta), a następnie na wysoce czułym i selektywnym kolorymetrycznym wykrywaniu jonu miedziowego (Cu⁺) za pomocą odczynnika zawierającego kwas bicynchoninowy. Test generuje fioletowy kompleks powstały w wyniku chelatacji jednego jonu miedziowego z użyciem dwóch cząsteczek BCA. Test BCA daje spójną, liniową odpowiedź z BSA, zapewniając wiarygodne odniesienie do krzywej standardowej. Chociaż wiadomo, że różne białka dają różne odpowiedzi w teście BCA, użycie BSA zapewnia powtarzalną względną ilościową liczbę na różnych próbkach. Ponieważ naszym celem była normalizacja dla równego obciążenia białkami, a nie absolutna ilościowa analiza każdego gatunku, kalibracja oparta na BSA oferowała najbardziej odporne i powtarzalne podejście.

1. Procedura
   1. Dodaj 25 μL każdego standardu BSA (zakres roboczy 20-2000 μg/mL) oraz nieznaną próbkę białka do wyznaczonych dołków z płytą 96-dołkową.
   2. Do każdego dołku dodaj 200 μL odczynnika roboczego BCA.
   3. Dokładnie wymieszaj za pomocą mikropłyty przez 30 sekund.
   4. Przykryj talerz i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   5. Przynieś talerz do temperatury pokojowej.
   6. Zmierz absorpcję przy 562 nm za pomocą czytnika mikropłyt.
2. Analiza danych
   1. Odejmij średnią absorbancję pustego (zero białka) od wszystkich wartości próbki i standardowej absorbancji.
   2. Zrób standardową krzywą absorpcji względem stężenia BSA (mikrogram/mikrolitr).
   3. Użyj równania regresji z krzywej do obliczenia stężeń białek w nieznanych próbkach.

6. Normalizacja stężenia białka

1. Procedura
   1. Zmierz stężenie białka w każdej próbce osocza za pomocą odpowiedniej metody ilościowej.
   2. Zapisz stężenie i całkowitą objętość każdej próbki.
   3. Przygotuj 50 mM buforu wodorowęglanu amonu (pH 7,8) jako rozcieńczalnika.
   4. Oblicz wymagane rozcieńczenie według wzoru C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Dla próbki o stężeniu 1,3 mg/mL i objętości 100 μL oblicz końcową objętość potrzebną do osiągnięcia 1 mg/mL:[V₂ = \frac{1.3 \razy 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Oblicz objętość bufora do dodania, odejmując objętość początkową od wolumnu końcowego: objętość bufora = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Dodaj 30 μL 50 mM wodorowęglanu amonu (pH 7,8) do próbki osocza o pojemności 100 μL.
   8. Delikatnie mieszaj próbkę przez pipetowanie lub krótkie wirowanie.
   9. Potwierdź, że końcowa objętość wynosi 130 μL przy znormalizowanym stężeniu 1 mg/mL.
   10. Przejdź do dalszego przygotowania próbek proteomicznych.
       UWAGA: Zapewnij dokładną korektę stężenia, obliczając wymagany współczynnik rozcieńczania na podstawie wyników testu BCA. Każdy krok jest weryfikowany, a dane podawane jako dane uzupełniające (Tabela Uzupełniająca 1).

7. Przygotowanie próbki i trawienie tryptyczne

1. Redukcja białka
   1. Do roztworu białkowego w buforze wodorowęglanu amonu należy dodać odpowiedni środek redukujący (np. 1,4-ditiotreitol [DTT]) do końcowego stężenia 100 mM.
   2. Inkubuj mieszankę w temperaturze 60 °C przez 30 minut w termomieszarce lub bloku grzewczym.
      UWAGA: DTT to drażniący środek i należy go obchodzić w rękawiczkach wewnątrz okapu wyparowego.
      UWAGA: Dodatkowe informacje o trypsynie stosowanej do trawienia zostały przedstawione w Tabeli Materiałów. Krótko mówiąc, zastosowano trypsynę o jakości sekwencyjnej Tosyl Fenylalanyl Chloromethyl Ketone (TPCK) (w celu eliminacji aktywności chymotryptycznej), aby zapewnić wysoką swoistość rozszczepienia w pozostałościach lizyny i argininy. Aktywność enzymu została zweryfikowana na podstawie specyfikacji producenta, odpowiadającej aktywności N-Benzoyl-L-Arginine Ethyl Ester (BAEE) wynoszącej około 1 jednostki na mg białka. Jeśli chodzi o stężenia DTT i octamidu Iodo (IAA), potwierdzamy, że 100 mM DTT i 200 mM IAA odnoszą się do roztworów zapasowych, a nie do końcowych stężeń użytych w reakcji. Końcowe stężenia robocze podczas redukcji i alkilacji mieściły się w standardowym zakresie (zazwyczaj 5-10 mM DTT i 10-20 mM IAA, odpowiednio).
2. Alkilacja reszt cysteinowych
   1. Po redukcji pozwól próbce ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Krótko wiruj, aby zebrać kondensat na dnie rurki.
   3. Dodaj 200 mM IAA przygotowanej w buforze 50 mM wodorowęglanu amonu (ABC), aby alkilować zredukowane reszty cysteiny.
   4. Inkubuj próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zapobiec degradacji IAA.
      UWAGA: Jodoacetamid jest światłoczuły i potencjalnie toksyczny; Unikaj ekspozycji i obchodzić się z nimi w słabym świetle.
3. Trawienie enzymatyczne
   1. Przed użyciem przygotuj trypsynę o jakości sekwencyjnej w buforze ABC o masie 50 mM.
   2. Do każdej próbki dodaj trypsynę w stosunku trypsyny do białka 1:25 (w/w).
   3. Inkubuj reakcję w 37 °C przez 17 godzin, aby umożliwić pełne trawienie enzymatyczne.
      UWAGA: Wydłużony czas trawienia może prowadzić do nadtrawienia; Zapewnij stabilność temperatury podczas inkubacji.
4. Tłumienie reakcji
   1. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając do każdej próbki kwas mrówkowy, aby uzyskać końcowe stężenie 1,0% (v/v).
   2. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby denaturować resztkową trypsynę i ustabilizować mieszaninę peptydów.
      UWAGA: Kwas mrówkowy jest żrący; Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE) i pracuj w okapie chemicznym.
5. Odzysk peptydów
   1. Wiruj trawioną mieszaninę peptydów w dawce 3500 g przez 12 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nierozpuszczalny materiał.
   2. Ostrożnie przenieś przezroczysty supernatant zawierający strawione peptydy do fiolek z autosamplerem, nie zakłócając granulatu.
   3. Przechowuj roztwory peptydów w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy LC-MS/MS.
6. Przygotowanie do analizy LC-MS
   1. Załaduj próbki peptydów bezpośrednio do systemu LC-MS wyposażonego w mobilność jonów do separacji i analizy peptydów.
   2. Upewnij się, że wszystkie fiolki są prawidłowo zamknięte, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu.

8. Analiza LC MS-MS

1. Załadunek peptydów i odsolanie
   1. Załaduj 1 μg próbki peptydu do pętli próbki w trybie częściowej pętli.
   2. Peptydy desalone wykorzystują kolumnę pułapki C18 przez płukanie rozpuszczalnikiem wodnym zawierającym 0,1% kwasu mrówkowego z przepływem 15 μL/min przez 1 minutę.
      UWAGA: Przez cały cykl używaj wody z kwasem mrówkowym o stężeniu 0,1% jako rozpuszczalnika A oraz acetonitrylu z 0,1% kwasu mrówkowego jako rozpuszczalnika B.
2. Separacja peptydów
   1. Połącz kolumnę pułapkową w linii z analityczną kolumną C18 o odwróconej fazie.
   2. Peptydy elute, wykorzystujące liniowy gradient od 3% do 40% Rozpuszczalnik B przez 55 minut z przepływem 300 nL/min.
   3. Przepłukaj kolumnę 80% rozpuszczalnikiem B przez 7,5 minuty, aby usunąć zatrzymywane składniki.
   4. Przed kolejnym wstrzyknięciem ponownie wyrównaj kolumnę 3% rozpuszczalnika B.
   5. Utrzymuj piec kolumnowy na 35 °C, a autosampler na 4 °C podczas pracy.
      UWAGA: Uwzględnij wtryski puste między próbkami, aby zminimalizować przenoszenie próbek.
3. Ustawienia akwizycji spektrometrii mas
   1. Analiza spektralna mas peptydów elucyjnych
      1. Skonfiguruj system UPLC i połącz go bezpośrednio z układem w wysokiej rozdzielczości.
      2. Steruj systemem za pomocą oprogramowania MS.
      3. Upewnij się, że spektrometr masowy jest skonfigurowany jako hybrydowy instrument kwadrupolowo-jonowy mobilność i ortogonalne przyspieszenie czasu lotu (oa-TOF).
      4. Przed rozpoczęciem pracy sprawdź, czy wszystkie połączenia gazowe z azotem i natryskiem blokady są zabezpieczone i wolne od wycieków.
         UWAGA: Należy obsługiwać połączenia wysokiego napięcia i gazy pod ciśnieniem zgodnie z normami bezpieczeństwa laboratoryjnego.
   2. Konfiguracja jonizacji
      1. Spektrometr mas działa w trybie dodatniej jonizacji elektroroztryskowej (ESI) za pomocą podwójnego źródła jonów elektroroztryskowych.
      2. Ustaw napięcie kapilarne nano-ESI na 3,4 kV.
      3. Reguluj napięcie stożka próbki do 40 V, a napięcie stożka ekstrakcyjnego do 4 V.
      4. Ustaw przepływ azotu w spektrometrii mobilności jonowej (IMS) na 90 mL/min.
      5. Sprawdź stabilność natrysku i upewnij się o stały prąd jonów przed dalszą pracą.
   3. Separacja mobilności jonów
      1. Ustaw wysokość impulsu przewodnika jonowego IMS na 40 V podczas transmisji jonów.
      2. Reguluj prędkość prowadzenia jonowego IMS do 800 m/s.
      3. Stopniowo zwiększ wysokość fali przemieszczającej się liniowo z 8 V do 20 V w całym cyklu IMS, aby osiągnąć optymalne rozdzielenie jonów dzięki mobilności.
         UWAGA: Zapewnij stabilny przepływ gazu IMS; Fluktuacje mogą wpływać na rozdzielanie jonów i powtarzalność czasu dryfu.
   4. Kalibracja masy zamka
      1. Skalibruj analizator czasu lotu (TOF) za pomocą roztworu jojku sodu (NaI) o stężeniu 2 μg/μL.
      2. Ustaw zakres kalibracji tak, aby wykrywał jony w zakresie od 50 m/z do 2000 m/z.
      3. Pobieraj widma odniesienia masy blokady co 45 s, używając podwójnego kanału źródła elektrosprayu do korekcji masy w czasie rzeczywistym.
      4. Sprawdź, czy krzywa kalibracji osiąga dokładność masy w granicach ±5 ppm, zanim przejdziesz do akwizycji danych.
4. Pozyskiwanie danych
   1. Pobieranie danych w trybie ciągłym, naprzemiennie pomiędzy dwoma funkcjami:
      1. Funkcja 1 (Niskoenergetyczna MS): Rejestr niskich widm jonów prekursorowych.
      2. Funkcja 2 (HDMSE o wysokiej energii): Rejestruj widma jonów fragmentów przy podwyższonej energii zderzenia z rozdzieleniem mobilności jonów.
   2. W Funkcji 2 ustaw energię kolizji w obszarze Pułapki na 4 eV.
   3. Zwiększ energię kolizji w obszarze transferowym z 20 eV do 45 eV, aby uzyskać kontrolowaną fragmentację peptydu.
   4. Ustaw czas akwizycji widma na funkcję na 0,9 s, a opóźnienie skanowania na 0,024 s.
   5. Monitoruj całkowity chromatogram jonów (TIC), aby potwierdzić spójną odpowiedź instrumentu przez cały czas.
   6. Importuj surowe dane do oprogramowania do analizy proteomiki (np. Progenesis QI lub odpowiednik).
   7. Wyrównuj chromatogramy między biegami, używając domyślnego odniesienia do wyrównania lub ręcznie wybranego przebiegu referencyjnego.
   8. Identyfikacja peptydów i białek za pomocą wyselekcjonowanej bazy danych (np. UniProt Human - tylko przeglądane wpisy).
   9. Ustaw następujące parametry wyszukiwania:
      Enzym: trypsyna
      Stała modyfikacja: karbamydometylacja (C)
      Modyfikacja zmienna: Utlenianie (M)
      Tolerancja peptydów: Zgodnie z rozdzielczością instrumentu
      Dozwolone nieudane dekolty: 1
      Wskaźnik fałszywych odkryć (FDR): ≤ 1%
   10. Wykonaj normalizację metodą normalizacji do wszystkich białek .
   11. Stosuj progi filtracji: ≥2 peptydy na białko, ≥1 unikalny peptyd, zmiana fałdów ≥1,5 oraz skorygowana wartość p <0,05.
       UWAGA: To ogólne wytyczne dotyczące bezpieczeństwa laboratoryjnego – zawsze należy przestrzegać przepisów EHS (Environmental Health & Safety and Safety) oraz lokalnych wymogów prawnych.
5. Kontrola jakości
   1. Wykonaj kalibrację przed i po uruchomieniu z wykorzystaniem standardu NaI, aby potwierdzić dokładność masy.
   2. Upewnij się, że odniesienie masy blokady pozostaje stabilne przez całą analizę.
   3. Oceń powtórzenie zastrzyków, aby potwierdzić powtarzalność czasu retencji, dryfu i intensywności widmowej.
      UWAGA: Jodek sodu jest drażniący. Podczas obsługi używaj rękawiczek i unikaj wdychania lub kontaktu ze skórą.
      UWAGA: Zapoznaj się z Plikiem Uzupełniającym 1 , aby uzyskać wytyczne dotyczące utylizacji odpadów. Zawsze pracuj w zimnym środowisku lub na lodzie podczas pracy z próbkami osocza, aby zapobiec degradacji białka. Zakładaj rękawice z nitrylem, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu podczas obsługi próbek biologicznych i buforów. Wykonuj kroki wirowania za pomocą chłodzonej wirówki wstępnie schłodzonej do 4 °C. Upewnij się, że wszystkie używane rurki i strzykawki są sterylne i odpowiednio oznakowane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Zawsze używaj wody o jakości proteomicznej do przygotowania buforów.

Wyniki

Próbki osocza były przetwarzane za pomocą wkładu spinowego w celu selektywnego usunięcia 14 białek o wysokiej obserwacji, mianowicie albuminy, IgG, IgA, transferyny, haptoglobiny, antytrypsyny, fibrynogenu, alfa2-makroglobuliny, alfa1-kwasowej glikoproteiny, IgM, apolipoproteiny AI, apolipoproteiny AI, dopełnienia C3 oraz transtyretyny. Ten etap wyczerpania był kluczowy dla poprawy wykrywania biomarkerów o niskiej obfitości w dalszej analizie proteomicznej. Każda próbka plazmy (8-10 μL) była rozcieńczana, klarowana za po...

Dyskusja

Wewnętrzna złożoność plazmy jako matrycy biologicznej stanowi poważne wyzwanie dla analizy proteomicznej. Ogromny zakres dynamiczny stężeń białek, wraz z dominacją kilku gatunków o wysokiej obfitości, może maskować wykrywanie klinicznie istotnych białek o niższej obfitości. W niniejszym badaniu złagodziliśmy te wady, wykorzystując wieloetapowy, standaryzowany proces przygotowywania próbek, zaprojektowany tak, by selektywnie wzbogacać białka o umiarkowanej i niskiej obfitości oraz zachować analityczną spójność między prób...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koncentrator śpinowy o masie cząsteczkowej 5 kDa	Agilent Technologies	5185 i minus; 5991	Wykorzystywany do wymiany buforu i usuwania soli; Zatrzymuje białka powyżej 5 kDa
Wodorowęglan amonu (ABC)	Sigma Aldrich	Numer katalogu: T6567	Stosowany do trawienia tryptycznego
Buforuj A Equil/Load/Wash	Agilent Technologies	5185-5987
Buffer B Elucia	Agilent Technologies	5185-5988
Wirówka chłodząca	CPR-30 Plus Chłodzenie Wirówki	Nie ma	Wykorzystywane do wirowania próbek białek w niskiej temperaturze
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Stosowany do trawienia tryptycznego
Aparat elektroforetyczny	BIO RAD	1658004	Używane dla SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	Numer CAS: 144-48-9	Stosowany do trawienia tryptycznego
IMS T-Wave	Wody	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eBardziej kompletnaCharakterystyka Mi xturesandMolecules-720004176.pdf	Separacja mobilności jonowej (IMS)
Czytnik wielotrybowy Infinite M Plex	TECAN		Czytnik wielopłytowy
System LC-MS	Wody	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
Oprogramowanie MassLynx 4.1 SCN781	Wody	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Oprogramowanie do spektrometrii mas
Multiple Affinity Removal Spin Cartridge Human 14 (MARS Hu-14)	Agilent Technologies	5188 i minus; 6560	Używany do usuwania 14 białek o wysokiej ilości, w tym albuminy, IgG, IgA, transferyny itd.
system nanoACQUITY UPLC	Wody	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Wody	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operon FDU-7003	Operon	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Liofilizator próżniowy szybkości
Zestaw do testowania białka BCA Pierce	Thermo Scientific	23225	Wykorzystywane do ilościowego określenia stężenia białka za pomocą testu kolorymetrycznego
Progenesis QI dla proteomiki	Wody	V4.2
Wirówka laboratoryjna R-8C BL, wirnik o stałym kącie z 12 &; 15 mL	REMI		Wirówka
SYNAPT G2 w wysokiej rozdzielczości MS	System HDMSE, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Hybrydowy spektrometr mas kwadrupolowy IMS z ortogonalnym przyspieszeniem i czasem lotu (oa-Tof)
Fiolka całkowitej regeneracji	Wody	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Trypsyna	Sigma Aldrich	Numer katalogu: T6567	Stosowany do trawienia tryptycznego