Kwas lipoowy moduluje szlak nrf2/HO-1, aby tłumić stan zapalny w grzybiczym zapaleniu rogówki za pomocą mechanizmów cytoprotekcyjnych ukierunkowanych na gospodarza

Podsumowanie

Kwas liponowy aktywuje szlak cytoprotekcyjny Nrf2/HO-1 w grzybiczym zapaleniu rogówki, obniżając poziom cytokin zapalnych i uszkodzenia rogówki. Ta terapia ukierunkowana na gospodarza wykazuje lepsze profile bezpieczeństwa w porównaniu z konwencjonalnymi lekami przeciwgrzybiczymi, jednocześnie dostarczając mechanistycznych wglądów w leczenie chorób oka wywołanych stresem oksydacyjnym poprzez endogenne wzmocnienie szlaku antyoksydacyjnego.

Streszczenie

Kwas liponowy (LA), antyoksydant ditiolowy o wzorowym profilu bezpieczeństwa oczu, był badany pod kątem zdolności do łagodzenia oksydacyjnego środowiska zapalnego, które powoduje grzybicze zapalenie keratitis. Ludzkie komórki nabłonkowe rogówki tolerowały LA do 60 μM bez utraty żywotności, a po wyzwaniu Aspergillus fumigatus LA wywołała trzykrotną eskalację translokacji jądrowej czynnika erytroidalnego 2-powiązanego z czynnikiem 2 (Nrf2) oraz pięciokrotny wzrost efektora heme oxygenazy-1 (HO-1). Farmakologiczne wyciszanie Nrf2 za pomocą ML385 lub katalityczna blokada HO-1 za pomocą protoporfiryny cyny IX wyeliminowało te zdarzenia molekularne i przywróciło ekspresję interleukiny-1β oraz czynnika martwicy nowotworów-α, potwierdzając ścisłą zależność Nrf2/HO-1. Równoległe eksperymenty w modelu grzybicy myscej potwierdziły obserwacje in vitro : miejscowa LA zmniejszała nieprzezroczystość rogówki i wyniki zapalne o 47%, jednocześnie wzmacniając ekspresję Nrf2 i HO-1 w rogówce, jednocześnie zmniejszając o połowę transkrypcje cytokin; współstosowanie SnPPIX unieważniło te korzyści. Dane łącznie wyznaczają spójną hierarchię mechanistyczną, w której LA, w klinicznie osiągalnych stężeniach, zwiększa poziom białka Nrf2 i zwiększa translokację jądrową, wzmacnia aktywność HO-1, a tym samym tłumi turbulencje cytokiniczne wywołane patogenami. Wyniki te pozycjonują LA jako łatwo tłumaczalny, skierowany do gospodarza suplement zdolny uzupełniać chemioterapię przeciwgrzybiczą oraz sugerują szersze perspektywy terapeutyczne dla modulacji Nrf2-centrycznej zapalenia rogówki zagrażającego wzroku.

Wprowadzenie

Grzybicze zapalenie rogówki (FK) jest obecnie uznawane za powszechne nagłe przypadki okulistyczne, odpowiedzialne za ponad 1 milion przypadków potwierdzonych hodowlami rocznie oraz nieproporcjonalnie dużą liczbę ślepoty rogówki w regionach tropikalnych i subtropikalnych ^1,2. Szacunki zachorowalności zbliżające się do 6-8 na 100 000 w Stanach Zjednoczonych, a nawet wyższe w gospodarkach rolniczych, podkreślają narastające globalne zagrożenie, które preferencyjnie dotyka populacje w wieku produkcyjnym po urazach roślinnych lub noszeniu soczewek kontaktowych ^3,4. Grzyby włókniste, zwłaszcza gatunki Fusarium i Aspergillus, dominują w krajobrazie etiologicznym, dobrze radząc sobie w ciepłym, wilgotnym klimacie i wykorzystując mikrouszkodzenia oczu do inicjowania infekcji⁵.

Pomimo pół wieku stosowania klinicznego, natamycyna 5% pozostaje jedynym preparatem miejscowym zatwierdzonym specjalnie dla FK; jednak chemia polienu powoduje słabą penetrację rogówki, wymaga częstego podawania i nie jest powszechnie dostępna ^6,7. Niepokojąco, kolejne badanie nadzoru z Azji Południowej wykazało stopniowe wzrosty minimalnych stężeń hamujących zarówno natamycyny, jak i triazoli, przy czym izolaty Fusarium wykazują roczny wzrost oporności na natamycynę o ≥6% oraz równoległy trend dla vorikonazolu⁸. Dane te są zgodne z raportami klinicznymi o niepowodzeniach terapii i wzmacniają prognozy, że rynek terapii FK rozszerzy się z 0,9 miliarda USD w 2023 roku do 1,48 miliarda USD do 2033 roku, głównie z powodu niedoskonałości obecnej farmakoterapii. Zabiegi chirurgiczne ad hoc, takie jak płaty spojówkowe czy keratoplastyka penetrująca, ratują anatomię w opornych wrzodach, ale są one wymagające zasobów i ograniczają wzrok⁹. Łącznie te niedociągnięcia podkreślają potrzebę stosowania strategii kierowanych przez gospodarza lub wielocelowych, które wykraczają poza samą działalność fungistatyczną.

Stres oksydacyjny i wynikająca z niej kaskada zapalna są obecnie uznawane za kluczowe czynniki determinujące patogenezę grzybów i bliznowactwo rogówki. Po inwazji grzybów komórki nabłonkowe rogówki oraz populacje odpornościowe rezydentów, w tym komórki tuczne spojówkowe, dendrytyczne komórki limbalne oraz keratocyty stromalne, inicjują wrodzone odpowiedzi immunologiczne za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców, takich jak Dectin-1 i receptory podobne do^Toll-10. Reaktywne odmiany tlenu pochodzące z neutrofilów (ROS) gromadzą się w zakażonym stromie jako część antybakteryjnego wybuchu oksydacyjnego, podczas gdy infiltrujące makrofagi i limfocyty T utrwalają przewlekły stan zapalny poprzez amplifikację cytokin¹¹. Paradoksalnie, grzyby włókniste zwiększają swoje własne obwody antyoksydacyjne (np. nadtlenkowe dismutazy regulowane przez Yap1), aby przetrwać to wrogie środowisko. Nadmiar ROS z kolei aktywuje transkrypcję IL-1β, TNF-α zależną od NF-κB, a także innych prozapalnych mediatorów, które powodują niszczenie tkanek i opacyzację rogówki¹². W centrum endogennej cytoprotekcji znajduje się czynnik jądrowy czynnik erytroidny 2 powiązany z czynnikiem 2 (Nrf2), którego translokacja do jądra koordynuje ekspresję hemooxygenazy-1 (HO-1) oraz szeregu enzymów detoksykujących w różnych typach komórek rogówki, w tym komórkach nabłonkowych, keratocytach i komórkach śródbłonka^13,14. Starzenie się, cukrzyca i przewlekłe zapalenie obniżają tę oś, czyniąc tkanki oczne podatnymi na utleniające, podczas gdy genetyczne lub farmakologiczne wzmocnienie Nrf2 przyspiesza zamykanie rany nabłonkowej i hamuje wzrost cytokin w różnych uszkodzonych rogówkach¹⁵.

Badania dowodowe koncepcji zaczęły wykorzystywać tę ścieżkę w FK. Naturalne małe cząsteczki, takie jak perillaldehyd¹⁶, kwas galowy¹⁷, hydroksytyrosol¹⁸ oraz związek organoselenu ebselen¹⁹, osiągają podwójne działanie przeciwgrzybicze i przeciwzapalne, wzmacniając sygnalizację Nrf2-HO-1, jednocześnie bezpośrednio osłabiając żywotność grzybów. Platformy nanomedyczne, które współdostarczają środki przeciwgrzybicze i antyoksydanty, dodatkowo ilustrują terapeutyczną obietnicę łączenia oczyszczania patogenów z wzmocnieniem obrony gospodarza^20,21. Jednak wielu z tych kandydatów napotyka przeszkody translacyjne związane ze złożonością formułowania lub nieudowodnionym bezpieczeństwem oczu.

Kwas liponowy (LA) to wszechobecny antyoksydant ditiolu o dobrze ugruntowanej systemowej historii bezpieczeństwa oraz wyjątkowej wszechstronności farmakodynamicznej. Na podstawie badań w tkankach wątrobowych i nerwowych^10,12 LA ma zamiar bezpośrednio modyfikować reszty cysteiny (szczególnie Cys151, Cys273 i Cys288) na białku ECH-stowarzyszonym Kelch-podobnym z ECH-1 (Keap1), zaburzając jego interakcję z Nrf2 i tym samym zapobiegając ubikwitynacji i degradacji proteasomalnej Nrf2, co skutkuje zwiększonym poziomem białka Nrf2, zwiększoną translokacją jądrową oraz zwiększoną transkrypcją HO-1. Jednak bezpośrednie wykazanie interakcji Keap1-LA w komórkach nabłonka rogówki wymaga przyszłych badań. LA wykazała korzyści cytoprotekcyjne w modelach upokarzeń oksydacyjnych wątrobowych, nerwowych i ocznych^13,15. Jego amfipatyczny charakter ułatwia penetrację tkanek bez toksyczności błonowej obserwowanej przez polieny, a formuły kliniczne istnieją już dla miejscowych i ogólnoustrojowych wskazań. Niemniej jednak zdolność LA do modulowania zapalnego mikrośrodowiska rogówki, a tym samym łagodzenia FK, nie została dokładnie zbadana.

Niniejsze badanie zatem badało, czy LA może złagodzić keratopatię wywołaną przez A. fumigatusa poprzez aktywację osi Nrf2/HO-1 przy jednoczesnym tłumieniu cytokin prozapalnych. Wykorzystując ludzkie komórki nabłonka rogówki oraz zwalidowany model FK myszy, określiliśmy charakterystykę dawka-odpowiedź, rozłożyliśmy zależności mechanistyczne za pomocą selektywnych inhibitorów oraz porównaliśmy wyniki terapeutyczne wobec niezakażonych grup kontrolnych i zakażonych z leczeniem wehikualizowanym. Z naszej wiedzy jest to pierwsze systematyczne badanie potwierdzające skuteczność terapeutyczną kwasu lipoinowego w grzybiczym keratitisie poprzez kompleksową charakterystykę dawkowo-odpowiedzi, sekcję mechanistyczną z użyciem selektywnych inhibitorów farmakologicznych zarówno Nrf2, jak i HO-1 oraz walidację zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych. Ta praca unikalnie integruje odczyty molekularne, komórkowe i translacyjne, aby dostarczyć ostatecznych dowodów na zależność szlaku Nrf2/HO-1 leżącą u podstaw przeciwzapalnych działań LA. Integrując odczyty molekularne, komórkowe i in vivo , staraliśmy się zapewnić kompleksową ocenę LA jako łatwo przetłumaczalnej, ukierunkowanej na gospodarza terapii, która odpowiada na podwójne wymogi: eliminację patogenów i unieruchamianie zapalne u FK.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (numer protokołu: IACUC-2024-FK-007) i przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem Association for Research in Vision and Ophthalmology dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Samce myszy C57BL/6, w wieku 8-10 tygodni i ważące 20-25 g, były trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach w kontrolowanych warunkach środowiskowych 22 ± 2 °C i wilgotności względnej 50%-60%, z cyklem światła i ciemności 12:12 godzin. Te konkretne zwierzęta wolne od patogenów zostały pozyskane w Charles River Laboratories (patrz Tabela materiałów). Wszystkie myszy przeszły tygodniowy okres aklimatyzacji, aby przystosować się do nowego środowiska przed eksperymentalnymi procedurami, z nieograniczonym dostępem do standardowego jedzenia dla gryzoni i wody.

UWAGA: Aspergillus fumigatus to patogen wymagający zabezpieczenia biologicznego poziomu 2. Wszystkie hodowle grzybów muszą być obsługiwane w certyfikowanej szafce bezpieczeństwa biologicznego, z użyciem odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i ochrony oczu. Dimetylosiarczek (DMSO) jest łatwopalny i może przenikać przez skórę; Obchodzić się w dobrze wentylowanych pomieszczeniach i unikać bezpośredniego kontaktu. Ketamina i ksylazyna to substancje kontrolowane, wymagające bezpiecznego przechowywania i odpowiedniej dokumentacji zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.

Przygotowanie eksperymentalne
Wszystkie wymagane odczynniki, leki i materiały zostały przygotowane zgodnie z eksperymentalnym procesem pracy (zobacz Tabelę materiałów oraz Ilustrację Uzupełniającą 1 dla schematu). Roztwory racemiczne (±)-α-lipoowe (LA) przygotowywano przy użyciu racemicznego kwasu α-liponowego (1,2-ditiolanu-3-pentanoinowego) rozpuszczonego w DMSO do stężenia 60 mM i przechowywanego w jednorazowych alikwotach w temperaturze -80 °C, aby zapobiec rozkładowi oksydacyjnemu. Inhibitor Nrf2 ML385 oraz inhibitor HO-1 SnPPIX zostały podobnie przygotowane i alicytatowane do jednorazowego użycia, aby uniknąć cykli zamrożenia i rozmrażania. Wszystkie podłoża i suplementy do hodowli komórkowej przygotowywano w warunkach sterylnych i przed użyciem podgrzewano do 37 °C.

Wszystkie materiały skażone kulturami grzybowymi, w tym płytki agarowe, rurki hodowlane i jednorazowe plastiki, były autoklajowane w temperaturze 121 °C przez 30 minut przed utylizacją w pojemnikach na odpady biohazardowe. Odpady chemiczne zawierające rozpuszczalniki organiczne były zbierane osobno i utylizowane zgodnie z instytucjonalnymi protokołami zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Tkanki i tusze zwierzęce były spalane za pośrednictwem zatwierdzonych usług odpadów biomedycznych.

Hodowla grzybów i przygotowanie do infekcji
Aspergillus fumigatus był hodowany na agarze dekstrozy Sabouraud w temperaturze 37 °C przez 5-7 dni, aż zaobserwowano dojrzałe konidium. Konidia były zbierane przez zalewanie dojrzałych hodowli bezpłodną solą fizjologiczną (PBS) zawierającą 0,05% Tween-80, a zawiesiny konidiów filtrowano przez sterylną gazę w celu usunięcia fragmentów strzępków. Stężenie konidiów zostało określone za pomocą hemocytometru i dostosowane do ustalonych stężeń na podstawie opublikowanych modeli grzybowego keratitis. Do eksperymentów in vitro wybrano 1 x 10⁶ konidiów/mL (wielokrotność zakażenia 10:1) na podstawie wcześniejszych badań wykazujących, że to stężenie wywołuje silne reakcje zapalne w komórkach nabłonka rogówki, jednocześnie utrzymując odpowiednią żywotność komórek dla dalszych analiz^16,17. Do badań in vivo wybrano 1 x 10⁷ konidiów/mL, ponieważ szczepionka ta powoduje stałe, umiarkowanie nasilone zapalenie rogówki z powtarzalnymi wynikami choroby do 5. dnia po zakażeniu, zapewniając wystarczający zakres dynamiczny do oceny skuteczności terapeutycznej bez nadmiernej śmiertelności^16,19.

Leczenie zwierząt i infekcje rogówki
Pod znieczuleniem ogólnym (podanie ketaminy 100 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg) keratitis grzybicze wywoływano przez wykonanie trzech liniowych rys o średnicy 1 mm na środkowej rogówce za pomocą sterylnej igły 25G, po czym nastąpiło miejscowe zastosowanie 5 μL zawiesiny konidialnej A. fumigatus . Myszy zostały losowo przydzielone do grup leczenia (n=8 na grupę): kontrolne (niezakażone), kontrolne zakażone, zakażone + LA leczone (60 μmol/L miejscowo 4 razy dziennie) oraz zakażone + LA + leczenie SnPPIX (LA plus 5 mg/kg SnPPIX dootrzewkowo dziennie). Ocena kliniczna i pobranie tkanek przeprowadzono 5. dnia po zakażeniu.

Środki ostrożności dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami: Wszystkie procedury z unieczulonymi zwierzętami powinny być wykonywane w warunkach aseptycznych. Monitorowanie zwierząt w trakcie znieczulenia w celu uzyskania depresji oddechowej. Utylizacja skażonej pościeli, odpadów chirurgicznych i zakażonych tkanek poprzez autoklawowanie, a następnie spalenie zgodnie z procedurami zarządzania odpadami biologicznymi z zagrożeniem biologicznym.

Hodowla komórek i leczenie
Ludzkie komórki nabłonkowe rogówki (HCEC) zostały pobrane z ATCC i utrzymywane w medium DMEM/F-12, uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła, 1% penicylin-streptomycynę oraz 1% L-glutaminę w stężeniach równomokrotnych w 37 °C w nawilżonej atmosferze 5% CO₂. Komórki były subhodowane co 3-4 dni po osiągnięciu 80%-90% zbiegu i wykorzystywane między przejściami 3-8, aby zapewnić spójność. W przypadku eksperymentalnych zabiegów komórki zasiano w odpowiednich płytkach w rozmiarach 5 x 10⁴ komórek na dołek i pozostawiano do przylegania przez 24 godziny przed zabiegiem. We wszystkich eksperymentach mechanistycznych in vitro komórki najpierw były wystawione na działanie konidiów Aspergillus fumigatus w wielokrotności zakażeń (MOI) 10:1 przez 4 godziny, aby ustalić infekcję, a następnie dodano LA (60 μM), ML385 (5 μM) lub SnPPIX (1 μM) samodzielnie lub w połączeniu przez dodatkowe 24 godziny przed pobraniem próbki. Taki sekwencyjny projekt pozwala ocenić terapeutyczne działanie LA na ustalone problemy grzybiczne, a nie na leczenie profilaktyczne.

Ocena żywotności komórek (analiza CCK-8)
Żywotność komórek oceniano za pomocą zestawu Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Komórki zostały zasiane w płytkach 96-dołkowych o pojemności 5 x 10 po⁴ komórki na dołek i inkubowano przez 24 godziny przed zabiegiem. Po ekspozycji na lek do każdego dołku dodawano 10 μL roztworu CCK-8, a płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Absorpcję zmierzono na poziomie 450 nm za pomocą wielomodowego czytnika mikropłyt. Każdy warunek eksperymentalny wykonywano w oktuplikacie, a eksperymenty powtarzano trzy razy niezależnie. Stężenie kontroli pojazdu (DMSO) utrzymywano poniżej 0,1%, aby uniknąć efektów cytotoksycznych.

Ekstrakcja RNA i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym
Całkowite RNA zostało wyizolowane z komórek hodowli i tkanek rogówki za pomocą zestawu RNeasy Mini Kit zgodnie z protokołem producenta. Próbki tkanek były homogenizowane w buforze RLT przy użyciu homogenizatora tkanek przez 2 minuty przy częstotliwości 50 Hz. Jakość i stężenie RNA oceniano za pomocą spektrofotometru, a do analizy końcowej użyto próbek o stosunku 260/280 1,8-2,0. Synteza cDNA pierwszej nici została przeprowadzona za pomocą zestawu do transkrypcji odwróconej cDNA o wysokiej pojemności z łączną ilością 1 μg RNA na reakcję. Ilościowe PCR przeprowadzono przy użyciu SYBR Green-based qPCR master mix na systemie PCR w czasie rzeczywistym, z początkową denaturacją w 95 °C przez 2 minuty, a następnie 40 cyklami 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę. Przeprowadzono analizę krzywej topnienia w celu weryfikacji specyficzności amplikonu. Wszystkie sprężarki zostały zweryfikowane pod kątem efektywności (90%-110%) oraz swoistości przed użyciem. Relatywna ekspresja mRNA została obliczona metodą 2^(-ΔΔCT) z genem referencyjnym GAPDH .

Ekstrakcja białek i analiza Western blot
Do całkowitej ekstrakcji białka komórki i tkanki były lizowane w buforze RIPA wzbogaconym koktajlami inhibitorów proteazy i fosfatazy. Frakcje białek jądrowych i cytoplazmatycznych przygotowywano przy użyciu jądrowych i cytoplazmatycznych odczynników ekstrakcyjnych NE-PER zgodnie z protokołem producenta. Stężenia białek zostały określone za pomocą testu Bradforda. Równe ilości białka (30-50 μg) zostały rozdzielone przez SDS-PAGE i przeniesione do membran PVDF. Po zablokowaniu 5% mleka beztłuszczowego w soli fizjologicznej z buforem Tris zawierającym 0,1% Tween-20 przez 1 godzinę, błony były inkubowane z pierwotnymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej stosowano odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z HRP. Pasma białkowe były wizualizowane za pomocą zwiększonego odczynnika chemiluminescencyjnego o czasie ekspozycji 30-180 s, w zależności od natężenia sygnału. Pasma były ilościowo określane za pomocą oprogramowania ImageJ, gdzie β-aktyna służyła jako kontrola obciążenia dla białek całkowitych, a lamina B1 dla białek jądrowych.

Ocena kliniczna i analiza histologiczna
Nasilenie choroby rogówki oceniano za pomocą standaryzowanego systemu oceny klinicznej opartego na ustalonych protokołach dla grzybiczego keratitisu myszy²². System oceniający ocenia trzy parametry w skali 0-4: przezroczystość rogówki (0 = przezroczysta, 4 = całkowicie nieprzezroczysta), nieregularność powierzchni (0 = gładka, 4 = ciężka wrzodza z perforacją) oraz odpowiedź zapalna (0 = brak nacieku, 4 = gęsta infiltracja z hipopyoną), co daje łączną liczbę punktów od 0 do 12. Wszystkie oceny kliniczne przeprowadzali dwaj niezależni obserwatorzy, którzy byli przydzieleni do grup leczenia, przy czym zgoda między obserwatorami przekraczała 90%. Zdjęcia rogówki zostały wykonane za pomocą biomikroskopu z lampą szczelinową wyposażonego w aparat cyfrowy. Do analizy histologicznej oczy były enukleowane, utrwalane w 4% paradehydu, osadzane w pararafinie i przecinane z grubością 5 μm. Przekroje były barwione hematoksyliną i eozyną w celu ogólnej oceny morfologii.

Test immunosorbentny związany z enzymami (ELISA)
Wydzielane poziomy IL-1β i TNF-α w supernatantach hodowli komórkowych oraz homogenatach tkanek rogówki były ilościowo określane za pomocą komercyjnych zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Supernatanty hodowli komórkowych pobrano po 24 godzinach leczenia, natomiast tkanki rogówki zostały ujednolicone w PBS zawierającym inhibitory proteazy. Próbki były wirowane w 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a do analizy ELISA użyto supernatantów. Wszystkie próbki zostały przeanalizowane w duplikacie, a stężenia cytokin obliczono na podstawie standardowych krzywych.

Analiza statystyczna
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z odpowiednimi biologicznymi replikacjami (n ≥6 dla badań in vitro , n =8 dla badań na zwierzętach) i powtórzono co najmniej 3 razy niezależnie. Dane przedstawiane są jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Analiza danych została przeprowadzona przy użyciu GraphPad Prism w wersji 9.0. Konkretnie wykorzystaliśmy funkcję testu normalności (Shapiro-Wilk) do oceny rozkładu danych, jednokierunkowy test ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya dla eksperymentów z więcej niż dwiema grupami oraz niesparowany test Studenta do porównań dwóch grup. Wykresy były generowane jako zgrupowane wykresy słupkowe z poszczególnymi punktami danych nakładanymi jako wykresy rozrzutowe, przy czym słupki błędu reprezentowały standardowy błąd średniej.

Wyniki

Eksperymentalny przepływ wykazał, że leczenie kwasem liponowym skutecznie moduluje szlak sygnalizacyjny Nrf2/HO-1, tłumiąc stan zapalny w modelach grzybicowego zapalenia rogówki.

Ocena cytotoksyczności kwasu lipoowego oraz inhibitorów specyficznych dla szlaku
Przeprowadzono wstępne badania dawka-odpowiedź, aby ustalić optymalne stężenia dla każdego związku używanego w tym badaniu. LA wykazała doskonałą biokompatybilność z HCEC, utrzymując żywotność komórek przy stężeniach d...

Dyskusja

Obecne wyniki potwierdzają kwas liponowy (LA) jako silny czynnik wywołujący oś Nrf2/HO-1, który łagodzi grzybicze keratitis (FK) poprzez ograniczenie prozapalnej ekspresji cytokin i zachowanie architektury rogówki. Zgodnie z najnowszymi badaniami wykazującymi silną aktywację Nrf2 przez związki ditiolanowe w zaburzeniach oksydacyjnych¹⁵, LA spowodowała pięciokrotny wzrost transkrypcji HO-1 i zmniejszenie wydzielania IL-1β/TNF-α o połowę, przewyższając kilka aktywatorów fitochemicznych zgłaszanych d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anti-HO-1	Technologia Sygnalizacji Komórkowej, Danvers, MA, USA	#8803
Anti-β-aktyna	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A5441
Antylaminowy B1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab16048
Anty-Nrf2	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab62352
Aspergillus fumigatus	ATCC 204305	Nie ma
Zestaw do testowania Bradford	Laboratoria Bio-Rad	5000006
Myszy C57BL/6	Laboratoria Charles River	Nie ma
Zestaw do Liczenia Komórek-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonia	343-07623
DMEM/F-12 medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Odczynnik ECL	Thermo Fisher Scientific	32106
Surowica bydła płodowa	Gibco, Thermo Fisher Scientific	16000044
Zapalnik GAPDH Forward	Synteza niestandardowa	Zwyczaj
GlutaMAX	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061
Zestaw do transkrypcji odwrotnej cDNA o wysokiej pojemności	Biosystemy stosowane, Thermo Fisher Scientific	4368814
HO-1 Przedni zapalnik	Synteza niestandardowa	Zwyczaj
HO-1 Odwrócony zapalnik	Synteza niestandardowa	Zwyczaj
IgG sprzężony przez HRP antymyszy	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab205718
Antykróliczy IgG sprzężony z HRP	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab205719
Ludzkie komórki nabłonkowe rogówki (HCEC)	ATCC, Manassas, VA, USA	CRL-11135
IL-1β Zestaw ELISA	R& D Systems, Minneapolis, MN, USA	DY201
Kwas liponowy (LA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1395
ML385 (inhibitor Nrf2)	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-100523
Spektrofotometr NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Odczynniki do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej NE-PER	Thermo Fisher Scientific	78833
Spłonka Nrf2 Forward	Synteza niestandardowa	Zwyczaj
Reff2 Ref Primer	Synteza niestandardowa	Zwyczaj
PBS z 0,05% Tween-80	Przygotowanie na zamówienie	Zwyczaj
Penicylina-streptomycyna	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122
PowerUp SYBR Green Master Mix	Biosystemy stosowane, Thermo Fisher Scientific	A25741
System PCR QuantStudio 5 w czasie rzeczywistym	Thermo Fisher Scientific	A28140
Bufor RIPA	Przygotowanie na zamówienie	Zwyczaj
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Niemcy	74104
Sabouraud dextroza agar	Przygotowanie na zamówienie	Zwyczaj
Biomikroskop z lampą szczelinową	Wyposażenie na zamówienie	Nie ma
SnPPIX (inhibitor HO-1)	Frontier Scientific, Logan, UT, USA	F6140
Synergy HTX Wielomodowy Czytnik Mikropłyt	BioTek Instruments, Winooski, VT, USA	SYNHXTTR
TBS-T (0,1% Tween-20)	Przygotowanie na zamówienie	Zwyczaj
TissueLyser LT	Qiagen	69980
TNF-α Zestaw ELISA	R& D Systems, Minneapolis, MN, USA	DY210