Artykuł metodologiczny

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

DOI:

10.3791/69447

⸱

27 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa generowanie organoidów z komórek nabłonka pęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 na rusztowaniu hydrożelowym z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie osadzenie w żelach kolagenowych 3D oraz ekspozycję na mechaniczne obciążenia za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki do badania mechanobiologii pęcherzykowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż dynamika oddychania i obciążenie mechaniczne odgrywają kluczową rolę w biologii pęcherzyków płucnych, ich wkład w patogenezę chorób układu oddechowego jest często pomijany. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy model organoidów, w którym organoidy nabłonkowo-włókniowe śródrostkowe są poddawane kontrolowanemu obciążeniu mechanicznemu za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki. Ta platforma odtwarza przestrzenną organizację i wielokomórkową złożoność tkanki pęcherzykowej oraz umożliwia badania nad tym, jak komunikacja między komórkami i mechanotransdukcja wpływają na strukturę i funkcjonowanie tkanek w zdrowiu i chorobie. W tym protokole opisujemy metody generowania i hodowli organoidów nabłonkowych i fibroblastowych z wykorzystaniem linii komórkowych nabłonka śródpęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 w hydrożelu z błoną podstawną i macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie organoidy są nieenzymatycznie izolowane i osadzane w żelach kolagenowych 3D na wyspecjalizowanych płytkach bioreaktora. Przedstawiamy procedury stosowania naprężenia równoosiowego, aby naśladować patologiczne wzorce oddychania obserwowane podczas zaostrzeń układu oddechowego. Na koniec przedstawiamy standardowy proces charakteryzacji, w tym immunobarwienie dla markerów specyficznych dla komórek oraz immunoanalizy profilujące uwalnianie mediatorów immunologicznych. Razem te analizy wspierają ocenę struktury i funkcji organoidów. Protokół ten zapewnia przyjazną użytkownikowi, powtarzalną i adaptowalną platformę do badania biologii pęcherzyków w warunkach mechanicznego obciążenia, z łatwo modyfikowalnymi parametrami, aby spełnić różnorodne cele eksperymentalne i rozwijać badania nad mechanizmami chorób płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki płucne to pęcherzyki końcowe układu oddechowego i służą jako główne miejsce wymiany gazów. Składają się głównie z komórek nabłonkowych typu I i II, odpowiedzialnych za wymianę gazów, funkcje odpornościowe i utrzymanie integralności strukturalnej, oraz fibroblastów w ścianach, które utrzymują homeostazę macierzy zewnątrzkomórkowej1. Te i inne komórki rezydentne są nieustannie narażone na cykliczne rozciągnięcie i naprężenia ścinające podczas oddychania2. Takie mechaniczne sygnały są przekształcane w sygnały biochemiczne, które wpływają na strukturę komórek, różnicowanie i komunikację3.

Patologiczne obciążenie mechaniczne obserwuje się w chorobach płuc, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP). POChP to postępujące schorzenie charakteryzujące się niszczeniem mięślicha, przewlekłym stanem zapalnym oraz zwężeniem małych dróg oddechowych4. W tej chorobie zniszczenie ścian pęcherzyków włosowych, utrata elastyny, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) prowadząca do włóknienia oraz przewlekłe zapalenie wspólnie upośledzają zdolność płuc do wytrzymania uszkodzeń strukturalnych 5,6. Skutkuje to heterogenicznymi i nieprawidłowymi deformacjami pęcherzyków zębowych podczas oddychania, które dodatkowo nasilają się podczas zaostrzeń choroby 7,8.

Chociaż do badania biologii pęcherzyka pęcherzykowego stosowano kilka metod in vitro, każda z nich ma istotne ograniczenia. Systemy współhodowli 2D ułatwiają badanie interakcji między komórkami, ale nie rejestrują architektury tkanek ani dynamiki macierzy zewnątrzkomórkowej, co zmniejsza znaczenie fizjologiczne. Statyczne kultury 3D lepiej zachowują strukturę i interakcje macierzowe, jednak nie uwzględniają dynamicznych wskazówek mechanicznych obecnych in vivo. Platformy mikrofluidyczne i organ-on-chip mogą naśladować przepływ płynów i naprężenia mechaniczne, zapewniając wysoką wierność fizjologiczną, ale często są technicznie skomplikowane, o niskiej przepustowości i kosztowne9. Dla kontrastu, trójwymiarowy model organoidów mechanicznie obciążonych tutaj łączy złożoność strukturalną, heterogeniczność komórkową oraz kontrolowaną stymulację mechaniczną – aspekt często pomijany w istniejących modelach, w ramach powtarzalnej, skalowalnej platformy, która oferuje równowagę między istotnością fizjologiczną a dostępnością eksperymentalną10,11.

Aby zrozumieć złożone mechanizmy przyczyniające się do chorób takich jak POChP oraz odkryć cele terapeutyczne, opracowano modele chorobowe. Pomimo swojego znaczenia, naprężenia mechaniczne są często pomijane w modelach in vitro alveolarnych stosowanych do badania mechanizmów i patogenezy chorób płuc, takich jak POChP. Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy metodę hodowania organoidów nadbłonkowych pęcherzyków w matrycy podstawowej, pobierania i osadzania w 3D żelach kolagenowych, stosowania cyklicznego naprężenia mechanicznego za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki oraz oceny kluczowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych. Te trójwymiarowe modele mechanicznych organoidów lepiej rejestrują interakcje komórkowe oraz mikrośrodowisko ludzkiej niszy pęcherzyka płucnego, umożliwiając badanie przesłuchu między nabłonkiem a mezenchymalnym12.

Bioreaktor stosuje odkształcenie równoosiowe z konfigurowalnymi parametrami, pozwalając na wydłużenie do 30% i częstotliwości do 5 Hz do modelowania zarówno warunków fizjologicznych, jak i patologicznych. W tym badaniu stworzyliśmy modele organoidów osadzonych w hydrożelach kolagenu-I, poddawanych 18% naprężeniom przy 0,4 Hz przez 24 godziny, aby naśladować patologiczne oddychanie. Ustanowiliśmy ustandaryzowany workflow charakteryzacji, który obejmuje immunobarwienie dla markerów specyficznych dla komórek oraz immunotesty do ilościowego uwalniania mediatorów immunologicznych po przeciężeniu mechanicznym. Celem tego badania jest zapewnienie fizjologicznie istotnej, przyjaznej dla użytkownika i elastycznej platformy do badania biologii pęcherzyków płucnych pod obciążeniem mechanicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie etapy wymagają techniki aseptycznej, materiałów sterylnych i odczynników, a wykonywane są w szafie bioasekuracyjnej, aby zmniejszyć narażenie personelu na materiały biologicznie niebezpieczne i zanieczyszczenie hodowli. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórkowa i zakładanie zapasów komórkowych

  1. Przed powstaniem organoidów hoduj komórki A549 i MRC-5 na standardowych plastikowych kolbach poddanych posiewce tkankowej (T75 cm2) do około 70%-80% konfluentności przy użyciu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego o 10% płodową surowicę bydła (FBS) i 1% penicylin-streptomycynę, dalej określaną jako "kompletny DMEM".
  2. Zarówno dla A549, jak i MRC-5, nasiona o objętości 2 x 104 komórek /cm 2, w całkowitej objętości 10 mL kompletnego DMEM. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5%CO2 w nawilżonym środowisku aż do osiągnięcia około 70%-80% konfluencji.
  3. Wymieniaj podłoże co 48 godzin, aby zapewnić optymalne warunki wzrostu.
  4. Subkultura: zasysanie wszystkich podłoży z kolby po zbiórce w 70%-80%, przemycie raz ciepłem solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie dodanie 4 mL trypsyny-EDTA.
  5. Inkubuj w 37 °C przez 5 minut i wizualizuj kolby mikroskopem jasnym, aby zapewnić całkowite odłączenie. Neutralizuj, dodając 4 mL kompletnego DMEM.
  6. Policz komórki za pomocą wybranej techniki, takiej jak liczenie wykluczeń trypanowego niebieskiego.
  7. Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 200 x g przez 5 minut.
  8. Aspiruj supernatant, aby pozostawić osad komórkowy na dnie stożkowej rurki. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w odpowiedniej objętości kompletnego DMEM, delikatnie triturując.
  9. Do zamrażania należy ponownie zawiesnąć w kompletnym ośrodku zawierającym 10% DMSO, aby uzyskać 1 x10 6 komórek /mL. Do powstawania organoidów ponownie zawiesaj, aby uzyskać 1 x 106 komórek /mL.

2. Ustalenie i scharakteryzowanie dojrzewania trójwymiarowego modelu organoidu nadbłonkowego i włóknistego pęcherzyka włosowego

UWAGA: Matryca piwnicy powinna być rozmrażona na lodzie przez noc i przechowywana w lodzie podczas tych etapów. Wyższe temperatury mogą powodować zastygnięcie matrycy.

  1. Przygotuj mieszankę 2:3 matrycy piwnicowej i zaawansowanego DMEM. Dodaj 300 μL tego roztworu do każdej dołki płyty z 24 dołkami, zapewniając równomierne pokrycie dna każdego dołku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze przez 1 godzinę, aby matryca mogła się zastygnąć.
  2. Przygotuj 5% roztwór matrycy piwnicowej w pełnym DMEM, który będzie podłożem hodowlowym organoidów. Dla każdego otworu uzyskaj 1,2 mL tego roztworu, rozcieńczając 60 μL matrycy podstawowej w 1 140 μL pełnego DMEM.
  3. W czasie zastygania matrycy podstawowej wymieszaj 300 000 ogniw A549 z 30 000 ogniw MRC-5 w 200 μL 5% roztworu matrycy podstawowej przygotowanego w pełnym DMEM opisanym w kroku 2.2.
  4. Gdy mieszanina podstawowa 2:3 się zastygnie, pipetować 200 μL mieszaniny A549/MRC-5 na żelowaną matrycę, a następnie przywrócić płytę z 24 dołkami do inkubacji w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 21 dni, aby umożliwić wzrost i różnicowanie organoidów pęcherzykowych.
  5. Wizualizuj kultury pod mikroskopem świetlnym przez następne 48 godzin. Komórki powinny się agregować w tym czasie.
  6. Co 48 godzin wymień 5% roztwór matrycy piwnicowej/DMEM na 200 μL świeżego medium 5%. Aby nie zakłócać organoidów osadzonych w hydrożelu, delikatnie przechyl płytkę, aby stary roztwór gromadził się wzdłuż ścianki studni przed aspiracją.
  7. W dniach 3, 9 i 21 dojrzewania zrób zdjęcia organoidów z 10-krotnym obiektywnym powiększeniem i wykonaj cztery reprezentatywne obrazy lub pola widzenia każdego dołku. Reprezentatywne obrazy wczesnej morfologii organoidów w dniach 3, 9 i 21 przedstawione są na Rysunku 1.
  8. Dla każdego pola widzenia policz wszystkie organoidy większe niż 50 μm średnicy. Korzystając z znanego pola widzenia, ekstrapoluj średnią całkowitą liczbę organoidów na odwiert od średniej liczby na pole, zakładając powierzchnię płyty 24 dołków wynoszącą 1,9 cm².
    UWAGA: Analizy te można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak Fiji13.
  9. Średnią średnicę i powierzchnię organoidów można również zmierzyć, aby uzyskać ilościowe informacje o cechach wzrostu organoidów w hodowli.

3. Pobór trójwymiarowych organoidów nabłonkowych i fibroblastowych nadrostów nadrostowych

UWAGA: Wszystkie etapy pobierania organoidów powinny być wykonywane na lodzie.

  1. Po 21 dniach dojrzewania zasysaj supernatant i delikatnie przepłucz około 1-2 mL lodowatego PBS.
  2. Dodaj 1-2 mL zimnego roztworu do pozyskiwania organoidów i inkubuj płytkę w temperaturze 2-8 °C przez 30-90 minut przy umiarkowanym potrząsaniu.
    UWAGA: Zatrzymaj inkubację, gdy organoidy unoszą się na dnie studni.
  3. Monitoruj dysocjację za pomocą mikroskopii jasnego pola. Dysocjacja jest uznawana za zakończoną, gdy matryca podstawowa na dnie studni przestaje być widoczna, a organoidy znajdują się w zawieszeniu. Skrobak komórek może być użyty do delikatnego przesuwania hydrożelu matrycy organoid-podłoża, aby przyspieszyć proces.
  4. Zgromadzić zawartość wszystkich odwiertów w stożkowej rurce o pojemności 50 ml na lodzie.
  5. Wirować w 500 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Aspiruj supernatant, myj pellet organoidalny 1-2 mL lodowatego PBS, a następnie ponownie wiruj, aby uzyskać granulat. Aspiruj PBS.

4. Ustalenie organoidów trójwymiarowych osadzonych w kolagenie oraz zastosowanie mechanicznych odkształceń

UWAGA: Używaj okrągłych płyt hodowlanych z piankowymi kotwicami kompatybilnymi z bioreaktorem rozciągającym komórki. Płytka hodowla używana w tym protokole ma powierzchnię wzrostu ~6,6 cm2.

  1. Przygotuj działający roztwór żelu kolagenu I o stężeniu 2 mg/ml. Roztwór powinien zawierać 1× PBS, 11,4 mM NaOH oraz 2 mg/mL kolagenu I, a ostateczna objętość powinna być dostosowana za pomocą wody sterylnej. Przygotuj 2 ml tego roztworu kolagenu I na dołek okrągłej piankowej płytki z 6 dołkami.
  2. Dodaj 1 ml roztworu kolagenu I 2 mg/mL do kotwic piankowych na obrzeżach płyty, zapewniając pełne nasycenie.
    UWAGA: Kotwy piankowe muszą być dokładnie nasączone roztworem kolagenu I, aby zapewnić prawidłową przyczepność. Niepełne nasycenie może prowadzić do odwarstwienia żelu kolagenowego podczas mechanicznej aplikacji, co prowadzi do zmniejszenia efektywnego odkształcenia w porównaniu do zamierzonego celu.
  3. Ponownie zawiesij pellet organoidowy w 6 mL 2 mg/mL kolagenu z ogona szczura i pipetuj 1 mL zawiesiny do środka okrągłej płyty piankowej z 6 dołkami, zapewniając, że mieszanka kolagenu nasączona organoidami miesza się z początkowym kolagenem wolnym od organoidów dodanym do okrągłych kotwic piankowych.
    UWAGA: Unikaj generowania bąbelków przy dodawaniu zawiesiny organoidowej do każdego odwiertu.
  4. Polimeryzuj kolagen-I przez 1 godzinę, pozostawiając płytki w inkubatorze (37 °C, 5%CO2). Po polimeryzacji żel powinien wyglądać na mętny.
  5. Dodaj 2 mL kompletnego DMEM na organoidy A549/MRC5 z osadzonym w 3D kolagenem i zwróć płytkę do inkubatora na 24 godziny.
  6. Zamień podłoże hodowlane na DMEM + 1% FBS i inkubuj przez noc przed ekspozycją na odkształcenie mechaniczne.

5. Rozciąganie komórek w bioreaktorze i ekspozycja na naprężenia mechaniczne

  1. Wkładaj stacje załadunku do każdej studni płyty podstawowej. Zawierają one sześć słupów obciążających o średnicy 25 mm, które pozwalają na odkształcenie elastycznej błony płytek Tissue Train wokół nich i wystawienie hodowli 3D na naprężenia równoosiowe.
  2. Nałóż cienką warstwę silikonowego smaru na górę słupków załadunkowych.
  3. Załóż czerwone uszczelki na dno każdej płytki z 6 dołkami.
  4. Włóż przygotowane płyty do płyty podstawowej na górze słupków załadunkowych.
  5. Przenieś to urządzenie do inkubatora nawilżonego o temperaturze 37 °C z zawartością 5%CO2 i podłączyć złączki szybkozłączne do płyty bazowej. Powtórz kroki od 5.1 do 5.6, pomijając połączenia, aby uzyskać kontrolę bez obciążeń.
    UWAGA: Opcjonalnie można zastosować zatyk uszczelniający rurkę, który zapobiega działaniu ciśnienia próżniowego na dnie pojedynczego odwiertu BioFlex, umożliwiając generowanie nienaprężonej kultury kontrolnej na tej samej płytce.
  6. Przykryj folią z pleksi i dodaj ~5-10 funtów ciężaru, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
  7. Włącz sprężarkę powietrza i otwórz zawór wylotowy z kompresora.
  8. Włącz pompę ciśnieniową i otwórz zawór zbiornika ciśnieniowego podłączony do odpływu zbiornika próżniowego. Upewnij się, że ciśnienie podciśnienia wynosi około 90 kPa.
  9. Otwórz zawór dopływu powietrza ze sprężarki umieszczonej w pobliżu sterownika bioreaktora. Reguluj ciśnienie tak, aby nie przekraczało 15 PSI przy porcie wentylacyjnym.
  10. Uruchom oprogramowanie pokładowe i ustaw pożądane parametry cyklicznego odkształcenia mechanicznego. W tym badaniu zastosowano schemat o amplitudzie odkształcenia 18% przy 0,4 Hz przez 24 godziny. Aby to skonfigurować, stwórz nowy schemat, ustaw minimalne wydłużenie na 0%, maksymalne na 18% i rozpocznij protokół.
  11. Obserwuj płytę i błonę, aby upewnić się, że ruch jest widoczny przez całą sesję naprężania. Membrana powinna się deformować wokół słupów obciążeniowych.
  12. Regularnie sprawdzaj syfonę pod kątem wilgoci i obserwuj ekran komputera pod kątem czasu pracy, postępów oraz odpowiedniej morfologii schematu odszczepu.
  13. Po zakończeniu reżimu odkształcenia odłącz zespół płyty podstawowej i przywróć odcięte hodowle do inkubacji przez 24 godziny przed analizą charakteryzacji w dalszej fazie.
  14. Wyłącz i rozmontuj system w odwrotnej kolejności od rozruchu: zamknij lub wyłącz zawór dopływu sprężarki powietrza, następnie zawór zbiornika ciśnieniowego, pompę ciśnieniową, zawór wylotowy sprężarki powietrza, a na końcu sprężarkę powietrza, w tej kolejności.
  15. Pobierz supernatant po 24 godzinach inkubacji po ekspozycji na obciążenia mechaniczne. Przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

6. Morfologiczna charakterystyka organoidów za pomocą immunofluorescencji

  1. Umyj model żelu organoidalno-kolagenowego trzy razy PBS, delikatnie dodając 1 ml PBS, inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Ostrożnie zasysaj PBS i powtórz proces mycia łącznie trzy razy.
  3. Ustalić model, inkubując 2 mL paradehydu 4% przez godzinę w temperaturze 4 °C.
  4. Myj modele trzy razy PBS, jak opisano powyżej.
  5. Użyj skalpela, aby delikatnie przeciąć okrągłe piankowe kotwy w elastycznych wejściach z żelem kolagenowym i umieść je w szalce Petriego.
  6. Przepuszczają organoidy, inkubując z 2 mL 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Myj modele trzy razy za pomocą PBS.
  8. Blokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując modele 3 mL 5% albuminy surowicy bydłej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń środek blokujący i przejdź do kolejnego kroku.
  9. Modele inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z koktajlem barwniczym zawierającym antyludzką zonula occludens-1 (ZO-1) sprzężoną z Alexa Fluor 594 w rozcieńczeniu 1:100, falloidyną sprzężoną z Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1:1000 w celu oceny F-aktyny oraz barwieniem jądrowym DAPI w rozcieńczeniu 1:4000. Rozcieńczalnik to 1 mL 1% BSA w PBS. Krawędzie płytki przyklej taśmą przed inkubacją w temperaturze 4 °C.
  10. Następnego dnia zasysaj roztwór koktajlu barwiącego i myj modele trzy razy PBS.
  11. Obrazuj mikroskopem konfokalnym i wykonuj stosy Z o długości 5 μm reprezentatywnych organoidów przy powiększeniu obiektywnym 40x.
  12. Analizuj intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do analizy obrazów Fiji. Normalizuj średnią intensywność fluorescencji z powierzchnią organoidu, aby zapewnić dokładne porównanie w różnych warunkach środowiskowych.

7. Funkcjonalna charakterystyka organoidów za pomocą testu ELISA i cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)

  1. Rozmroz supernatanty na lodzie i oceniaj wydzielanie interleukiny-6 (IL-6) oraz interleukiny-8 (IL-8) za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów ELISA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Ocena uwalniania LDH, markera cytotoksyczności, za pomocą komercyjnie dostępnego testu absorpcji LDH.
  3. Generuj standardową krzywą przy użyciu rekombinowanego białka LDH w stężeniach półlogaritmowych od 0,5 μg do 0,5 ng. Interpoluj stężenia LDH z każdej próbki za pomocą krzywej standardowej.

8. Opcjonalnie: Izolacja próbek do analiz RNA lub białek

  1. Zamiast dodawać 4% paraformaldehydu do barwienia immunofluorescencyjnego, dodaj przygotowany bufor RLT zawierający β-merkaptoetanol w ilości 10 μL na 1 mL RLT.
  2. Użyj 300 μL na model i pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie odłączyć i zlikwidować komórki.
  3. Przelej lizat do mikrowirówki wolnej od RNazy i umieść rurki na suchym lodzie, aby szybko zamroziły. Przenieś do -80 °C na długoterminowe przechowywanie.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć buforu RIPA do ekstrakcji białka, przygotowując: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 lub Triton X-100; 0,5% deoksycholatan sodu; 0,1% SDS w wodzie zdejonizowanej. Dostępny jest również gotowy bufor RIPA.
  4. Dodaj 200 μL na model, kamień na lodzie przez 5 minut, a następnie pobierz lizat.
  5. Rotuj w 15 000 x g przez 10 minut w 4 °C, aby uzyskać zanieczyszczenia z pelletami, a następnie przenieść do -80 °C do długoterminowego przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustanowiono i hodowano przez ponad 21 dni organoidy nabłonka pęcherzykowego i fibroblastów pochodzące z linii komórkowych. Przez cały ten czas obserwowano zmiany morfologiczne, a liczbę, powierzchnię i średnicę organoidów oceniano w 3., 9. i 21. dniu w celu monitorowania wzrostu i rozwoju. Średnia liczba organoidów na studzienkę uległa znacznemu zmniejszeniu w dniach 9. i 21. w porównaniu z dniem 3. (Rysunek 2A). Z kolei średnia powierzchnia i średnica organoidów istotnie wzrosły w dniach 9....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) organoidy nabłonkowo-włókniowe nadrostowe stanowią wysoce fizjologicznie istotną platformę do modelowania struktury i funkcjonowania płuc pod obciążeniem mechanicznym. W przeciwieństwie do systemów współkultury 2D czy nawet 3D, organoidy zachowują kluczowe cechy mikrośrodowiska płuc in vivo, w tym organizację przestrzenną, przekrzyki nabłonkowo-mezenchymalneoraz interakcje macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Obciążenie mechaniczne odgrywa kluczową rolę w przebudowie dróg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy twierdzą, że badania przeprowadzono w braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują wsparciu Providence Airway Center w Providence Health Care, którego wkład umożliwił ukończenie tego rękopisu. Prace te zostały sfinansowane przez MITACS (ID IT27789), we współpracy z Providence Airway Center (PAC) w Providence Health Care (PHC) oraz Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (IDs AWD-024378 i AWD-024440).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka mikrowirówki o pojemności 1,5 mLEppendorf0030 125.215
15 mL stożkowa lampaFisher Scientific14-959-53A
16% paraformaldehyduThermo Fisher Scientific28908
2-merkaptoetanolMillipore SigmaM3148
50 mL stożkowa rurkaFisher Scientific14-432-22
6-dołkowa (elastyczna membrana) Tissue Train okrągła płyta piankowaFlexcell InternationalTTCF-5001
Ogniwa A549Amerykańska Kolekcja Kultury Typowej (ATCC)CCL-171
Sprężarka powietrzaCalifornia Air Tools10020DSPCAD
Albumina surowicy bydłaMillipore SigmaA9418
Bufor RLTQiagen79216
CO2 InkubatorPHCBIMCO-170AICUVL-PA
Roztwór do zbierania organoidów CultrexBio-Techne3700-100-01
Zestaw do testów cytotoksyczności LDH CyQUANT LDHThermo Fisher ScientificC20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol)Thermo Fisher ScientificD1306
DimetylsulfoksydSigma AldrichD2650-100ML
Dulbecco' zmodyfikowanego Eagle' s medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092
Mikroskop EVOS XL CoreThermo Fisher ScientificAMEX1200
Serum bydła płodu (FBS)Thermo Fisher ScientificA5209501
Oprogramowanie do analizy obrazów FidżiNarodowe Instytuty Zdrowia
System Flexcell FX-6000 Tension and Tissue Train (zawiera kontroler napięcia Flexlink FX-6000, zbiornik ciśnieniowy, płytę podstawową, akrylowe okno, cylindryczne stacje załadunkowe o średnicy 25 mm, syfon, oprogramowanie FlexSoft FX-6000 V1.0 oraz różne rurki)Flexcell InternationalFX6000T
Ludzka interleukina-6 Duoset ELISABio-TechneDY206
Ludzka interleukina-8 Duoset ELISABio-TechneDY208
Mikroskop konfokalny Leica DMi8Leica Microsystems11889122
Matryca bazalna membrana matrigelowaCorning356237
Komórki MRC-5ATCCCCL-185
ParafilmMillipore SigmaP7793
Penicylina/streptomycyna (Pen/Streptokok)Thermo Fisher Scientific15140122
Sondy znakujące falloidynę, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
Kolagen ogonowy szczura ISigma-AldrichC3867
Rekombinowane ludzkie białko dehydrogenazy mleczanowej (aktywne)AbcamAb93699
Bufor lizy RIPAThermo Fisher Scientific89901
Mikrofugeowe rurki wolne od RNazyThermo Fisher ScientificAM12400
T75 cm2 kolba kulturowa T75 cmsupGreiner658175
Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
Przeciwciało monoklonalne ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific339194

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knudsen, L., Ochs, M. The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components. Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).
  2. Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction. J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).
  3. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  4. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).
  5. Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. Airway and extracellular matrix mechanics in COPD. Front Physiol. 6, 346(2015).
  6. Burgess, J. K., Gosens, R. Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness. Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).
  7. Harris, C., et al. An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation. J Biomech. 88, 186-189 (2019).
  8. Xu, Y., et al. Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).
  9. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  10. Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms. Front Med. 12, 1552803(2025).
  11. Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II. Front Med. 12, 1683514(2025).
  12. Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions. Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. Alveolar organoids in lung disease modeling. Biomolecules. 14 (1), 115(2024).
  15. Manuyakorn, W., et al. Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses. PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).
  16. Kılıç, A., et al. Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells. Sci Rep. 10 (1), 966(2020).
  17. Tam, A., et al. Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma. Cells. 11 (19), 3016(2022).
  18. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).
  19. Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation. Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).
  20. Barnett, K. C., et al. An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).
  21. Li, Y., et al. HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration. BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).
  22. Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19. Viruses. 15 (8), 1655(2023).
  23. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  24. Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities. J Transl Med. 23 (1), 497(2025).
  25. Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).
  26. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Front Physiol. 11, 566(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

Tagi

Kolagen 3Dkom rki A549fibroblasty MRC 5odkszta cenie mechaniczneorganoidy nab onkowo fibroblastycznemarkery immunobarwieniacharakterystyka organoid wmechanotransdukcja
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły