Artykuł metodologiczny

In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 stycznia 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę ubikwitynacji Streptococcus pneumoniae przy użyciu lizatu komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymów ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem białkowym VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny aktywności bakteriolitycznej, umożliwiającej badanie efektorów immunologicznych zależnych od ubikwityny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubikwitynacja to wszechstronna modyfikacja potranslowa, która odgrywa kluczową rolę w odporności cytosolowej. Po inwazji komórek gospodarza bakterie patogenne są początkowo zamknięte w endosomie, z którego uwalniają się i uciekają do cytosolu, aby uniknąć degradacji lizosomów. Po wejściu do cytosolu bakterie są szybko oznaczane łańcuchami ubikwityny przez ligazy gospodarza E3, oznaczając je do usunięcia przez różne szlaki efektorowe, w tym autofagię i proteasom. Aby określić wkład poszczególnych szlaków w eliminację bakterii, rekonstrukcja in vitro oferuje kontrolowane i jednoznaczne podejście. Tutaj, wykorzystując Streptococcus pneumoniae (SPN) jako modelowy patogen bakteryjny, przedstawiamy szczegółowy protokół jego ubikwitynacji przy użyciu lizatów komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymu ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny jego aktywności bakteriolitycznej niezależnie od innych czynników komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, ta procedura ma potencjał do wyjaśnienia funkcji immunologicznych ligaz i efektorów ubikwityny w kontekście wolnym od komórek, gdzie rozkładanie takich mechanizmów może być trudne w nienaruszonych komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubikwityna (Ub) to małe białko o masie 8,6 kDa, które modyfikuje substraty docelowe, przyłączając się kowalencyjnie do nich w swojej C-końcowej glicynie, tworząc wiązanie izopeptydowe z grupą ε-amino reszt lizyny w procesie zwanym ubikwitynacją1. Zjawisko to jest kontrolowane przez serię zorganizowanych kroków obejmujących enzym aktywujący ubikwitynę E1, enzym sprzęgający ubikwitynę E2 oraz ligazę ubikwitynyE3 1,2,3. Ub może być przyłączony jako monomer lub łańcuchami o różnych długościach przez siedem reszt lizynowych (liniowe/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 i K63)4. Te unikalne łańcuchy Ub działają jako markery molekularne dla różnych funkcji komórkowych, takich jak degradacja proteasomalna, transport komórkowy, naprawa DNA oraz selektywna autofagia3.

Chociaż kanoniczna rola ubikwitynacji od dawna wiąże się z utrzymaniem homeostazy komórkowej, na przykład degradacją źle złożonych białek za pomocą proteasomów lub kierowaniem określonych ładunków na selektywną autofagię 5,6, obecnie jest jasne, że ubikwityna pełni również kluczowy mechanizm wykrywający przez cytosolowy układ odpornościowy przeciwko infekcjom bakteryjnym. Bakterie wewnątrzkomórkowe często przenikają do komórek gospodarza, aby uniknąć wykrycia przez odpowiedź immunologiczną z zewnątrzkomórkowej i rozmnażają się w chronionym środowisku 7,8. Wiele patogenów wykorzystuje układy wydzielnicze i toksyny, aby nieodwracalnie uszkadzać vakuole, które je noszą, umożliwiając przedostanie się do cytosolu i pozyskanie składników odżywczych. Po wejściu do cytosolu bakterie te są ozdobione łańcuchami poliubikwityny przez specyficzne ligazy E3, które działają jako molekularny "znacznik śmierci", kierujący je w kierunku selektywnej eliminacji. Na przykład ligaza E3 SMURF1 angażuje Mycobacterium tuberculosis, inicjując poliubikwitynację sprzężoną z K48 bezpośrednio na swojej powierzchni, co prowadzi do jej degradacji przez proteasom11. Parkina gromadzi się w wakuolach zawierających bakterie i tworzy łańcuchy ubikwityny powiązane z K6312, podczas gdy ARIH1 i LRSAM1 modyfikują powierzchnie bakterii odpowiednio łańcuchami K48 i K6, hamując tym samym wzrost bakterii 13,14. Podczas gdy większość ligaz E3 kieruje się głównie do substratów białkowych gospodarza, niektóre ligazy wykazują wyraźną specyficzność dla składników mikrobiologicznych. RNF213 identyfikuje i ubikwitynuje lipopolisacharydy (LPS) występujące w Salmonella enterica serovar Typhimurium15, a kompleksSCF FBXO2 rozpoznaje bakteryjne glikany obecne w grupie A Streptococcus jako podłoże ubikwitynacji16, ułatwiając ksenofagię. KompleksSCF FBXW7 natomiast rozpoznaje motywy degronowe w białkach powierzchniowych Streptococcus pneumoniae (SPN). Należą do nich β-galaktozydaza A (BgaA) oraz powierzchniowe białko pneumokokowe A (PspA), które po oznakowaniu łańcuchami poliubikwityny sprzężonymi z K48, zostały potwierdzone za pomocą przeciwciał specyficznych dla K48 Ub, prawdopodobnie przyciągają układ proteasomalny, umożliwiając skuteczną eliminację bakteryjną17.

Chociaż proces oznaczania tych cytosolowych najeźdźców ubikwityną jest dobrze poznany, mechanizm, w którym układ proteasomalny usuwa tak duże mikroorganizmy, pozostaje wątpliwy. Najnowsze badania wykazały, że gospodarz AAA+ ATPaza, VCP/p97 (białko zawierające walosynę), odgrywa kluczową rolę w tym procesie. We współpracy z kofaktorami takimi jak UFD1 i NPLOC4, VCP może identyfikować bakterie oznaczone poliubikwityną i fizycznie wyodrębniać białka ubikwitynowane z błony bakteryjnej, co powoduje ich pęknięcie i ułatwianie ich eliminacji z środowiska cytosolowego bez zależności od mechanizmu proteasomalnego18.

Cytosol gospodarza zawiera złożoną sieć szlaków odpornościowych, które działają równolegle i w sposób bezpieczny, gwarantując usuwanie patogenów. Ta redundancja jest kluczowa dla silnej obrony, ale komplikuje wysiłki mające na celu identyfikację i zbadanie roli poszczególnych czynników odpornościowych19. W tym kontekście systemy rekonstrukcji in vitro stanowią użyteczną platformę do analizy konkretnych szlaków w warunkach kontrolowanych. Przedstawiamy tutaj system wolnokomórkowy, który odtwarza proces ubikwitynacji i utraty żywotności SPN za pomocą lizatów komórek ssaków lub enzymów E1-E2-E3-Ub wraz z oczyszczonymi kompleksami efektorowymi gospodarza. W tym dwuetapowym protokole najpierw ułatwiamy sprzężenie łańcuchów poliubikwityny na bakterii, a następnie oceniamy ich eliminację przez VCP/p97 w połączeniu z UFD1 i NPLOC4. Odtworzając ten szlak in vitro, omijamy złożoność komórkową i konkretnie badamy zdolność VCP do neutralizacji patogenu. To precyzyjne ustawienie pozwala na szczegółową analizę rozpoznawania podłoża, specyficzności łańcucha, trybu działania efektora oraz niezbędnych składników niezbędnych do inicjowania skutecznej odpowiedzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hodowli komórkowej i lizatu

  1. Rozmroz komórki A549 i hoduj je w kolbie T25, używając pełnego DMEM z 10% surowicy płodowej bydła (FBS). Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym środowisku z zawartością 5%CO2. Przepuszczaj komórki przez trzy przejścia do konserwacji, a następnie przelej 2 ×10 6 komórek do kolby T75. Kontynuuj hodowlę, aż gęstość komórek osiągnie 8-10 × 106 komórek.
  2. Zeskrobaj komórki z kolby T75 w temperaturze 4 °C za pomocą buforu reakcyjnego zawierającego 200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl i 5% glicerolu przy pH 7,4. Wiruj wycięte ogniwa w 120 × g przez 10 minut, aby je ogranulować, a następnie ponownie zawiesić w buforze reakcji, aby uzyskać końcową objętość około 0,6 mL w rurce wirówki o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: Cała próbka musi być przetwarzana w lodzie.
  3. Sonikuj zawiesinę komórki za pomocą wąskiej sondy (średnica końcówki 2 mm) o amplitudzie 40 μm z 2 sekundami impulsów włącz/wyłącz przez 2-2,5 minuty, utrzymując mieszankę na lodzie. Wiruj sonifikowane próbki w dawce 21 000 × g przez 45 minut, zbieraj powstały supernatant i dodaj 2-3 razy koktajlu inhibitorów proteazy 50x.
    UWAGA: Albo natychmiast użyć lizatu do reakcji ubikwitynacji tego samego dnia, albo zamrażać go błyskawicznie przy użyciu ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C; Jednak pamiętaj, aby użyć go maksymalnie w ciągu 3 dni, aby skutecznie ubiquitynować. Stężenie lizatu w zakresie od 2 do 4 mg/mL nadaje się do ubikwitynacji.

2. Hodowla bakteryjna

  1. Hodować bakterię, szczep R6 Streptococcus pneumoniae (SPN) (serotyp II), przez noc w temperaturze 37 °C z 5%CO2 w medium THY złożonym z bulionu Todda Hewitta w proszku (3,7 g/100 mL) i ekstraktu drożdżowego (1,5 g/100 mL).
    UWAGA: Unikaj szczepienia bakterii, jeśli podłoże zmieniło się na ciemnobrązowy. Streptococcus pneumoniae jest klasyfikowany jako patogen o poziomie biobezpieczeństwa 2 (BSL-2); podejmować środki ostrożności i stosować się do właściwych protokołów zabezpieczających BSL-2, w tym korzystania z certyfikowanej szafy do zabezpieczeń biologicznych.
  2. Następnego dnia zaszczep z nocnej hodowli do świeżego podłoża THY (1:10) w temperaturze 37 °C z zawartością 5%CO2 i zwiększ SPN aż gęstość optyczna na 600 nm (OD600 nm) osiągnie 0,4. Przygotuj zapas glicerolu SPN (900 μL kultury SPN i 600 μL glicerolu (50%) i przechowuj go w temperaturze -80 °C.
  3. W dniu eksperymentu ubikwitynacji rozmraża się nowe zapasy SPN z -80 °C i całkowicie zaszczepiają do 5 mL podłoża THY, pozwalając rosnąć aż OD600 nm osiągną 0,4.
    UWAGA: Hodowla bakteryjna została wyhodowana do OD600 nm wynoszącej 0,4, co odpowiada około 10 komórkomSPN na mL. Korelację tę ustalono poprzez wyliczenie jednostek tworzących kolonie (CFU), ustalane przez seryjne rozcieńczenie hodowli w 1x PBS, aby zmniejszyć stężenie komórek bakteryjnych, umożliwiając uzyskanie policzalnych kolonii, oraz poprzez wyróżnienie na płytkach agarowych BHI, które są bardziej wzbogaconym medium niż THY.

3. Test ubikwitynacji in vitro z lizatu ssaków

  1. Weź około 10 komórek SPN7 i dokładnie przemyj co najmniej trzy razy buforem reakcji (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl i 5% glicerolu przy pH 7,4), ponownie zawieszając bakterie w następnym buforze, następnie wirując w 21 000 × g przez 5 minut, a następnie rozpylając je przez wirowanie w 21 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Ponownie zawiesij osad SPN z lizatem komórek ssaków A549 wraz z oczyszczoną ubikwityną (350 μM) i 1 mM ATP i inkubuj przez 1-2 godziny w temperaturze 27 °C.
    UWAGA: Unikaj zamrażania i rozmrażania lizatu komórek ssaków. Najlepiej, jeśli lizat zostanie przygotowany tego samego dnia co test ubiquitinacji.
  3. Po inkubacji należy raz przemyć bakterię buforem reakcyjnym zawierającym 1 M mocznika, następnie dwa przemycia wyłącznie buforem reakcji, a następnie utrwalić 1% paradehydem (PFA). Po utrwaleniu inkubuj komórki PBS zawierającym glicynę (1 mg/mL) przez 15 minut, a następnie wykonaj dwa 1-krotne płukania PBS.
    UWAGA: Stosuje się płukanie mocznika o mocy 1 M, aby łagodnie zakłócić interakcje niekowalencyjne, zapewniając, że pozostaną tylko kowalencyjnie ubikwitynowane bakterie. Następnie ważne jest dokładne przemytie buforem reakcyjnym, aby usunąć resztki mocznika, ponieważ jego obecność może zakłócać badanie zabijania in vitro .
    Jako kontrolę negatywną przygotuj całą mieszaninę reakcji i inkubuj ją z bakteriami na lodzie, aby zahamować aktywność enzymatyczną. Zaraz po inkubacji płucz próbkę, a następnie utrwal ją za pomocą 1% PFA, aby utrzymać stan reakcji.

4. Test ubikwitynacji in vitro z kompleksu enzymu E1-E2-E3

  1. Najpierw przygotować mieszaninę reakcji składającą się z ubikwityny (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), kompleksu Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 nM) oraz 2 mM ATP w buforze reakcyjnym (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl i 5% glicerolu przy pH 7,4), aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 100-150 μL.
    UWAGA: Przechowuj wszystkie enzymy w temperaturze -80 °C. Aby uniknąć utraty aktywności w wyniku wielu cykli zamrożenia i rozmrażania, stwórz małe aliquoty i wykorzystuj nowe dla każdej reakcji ubikwitynacji.
  2. Ponownie zawiesz bakterie (10-7 CFU) w tej mieszaninie reakcji zawierającej ubikwitynę i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze 27 °C. Następnie przemyj bakterię buforem reakcji zawierającym 1 M mocznika przez co najmniej 3x, a następnie utrwal 1% paradehydu (PFA). Po utrwaleniu inkubuj komórki PBS zawierającym glicynę (1 mg/mL) przez 15 minut, a następnie wykonaj dwa 1-krotne płukania PBS.
    UWAGA: Jeśli dochodzi do nadmiernej utraty komórek, można zmniejszyć liczbę płukań.

5. Wizualizacja bakterii ubikwitynowanych

  1. Po utrwaleniu próbki 1% PFA inkubuj ją w 3% BSA przez godzinę w temperaturze 27 °C, a następnie wykonaj dwa mycia z 1x PBS.
  2. Ponownie zawiesij bakterie ubikwitynowane za pomocą przeciwciała pierwotnego w stężeniach wyższych niż te typowo stosowane w testach immunofluorescencyjnych. Do barwienia w temperaturze 27 °C przez godzinę używaj przeciwciała specyficznego dla bakterii oraz przeciwciała antyubikwitynowego (1:100), rozcieńczonego w PBS zawierającym 1% BSA.
    UWAGA: Aby optymalnie barwić przeciwciała, użyj rurki wirówki o niskiej zawartości białek, aby zminimalizować utratę przeciwciał, lub użyj wyższego stężenia przeciwciał, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
  3. Następnie dwukrotnie przemyj bakterię 1x PBS, a następnie ponownie zawiesij je odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z Alexa Fluor 488 i 555, odpowiednio przez 1 godzinę w temperaturze 27 °C.
  4. Nałóż około 10-20 μL oznaczonej próbki bakteryjnej metodą drop castingu i wymieszaj 5-10 μL medium montażowego z DAPI lub bez, następnie nałóż na to pokrywkę i użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar płynu. Na koniec obserwuj próbkę pod mikroskopem konfokalnym tego samego dnia.

6. Ekspresja i oczyszczanie białek

  1. Aby uzyskać ekspresję dzikiego typu VCP/p97, przekształcić plazmid zawierający VCP pET28a w szczep E. coli BL21-DE3 za pomocą standardowego protokołu transformacji E. coli 20. Kolonie inkubacyjne powstały po przemianie w nocy w bulionie Luria (LB) w temperaturze 37 °C. Następnego dnia zaszczep hodowlę w skali 1:50 do dobrze napowietrzonej kolby zawierającej LB i pozwól jej rosnąć, aż OD600 nm osiągnie 0,7-0,8. Dodaj 200 μM IPTG do hodowli i inkubuj przez 5 godzin w temperaturze 37 °C, potrząsając przy 180 obr./min; potwierdź ekspresję białka za pomocą SDS-PAGE.
    UWAGA: Na cały etap wzrostu i ekspresji bakterii jako presja selekcyjna stosowano Kanamycynę (50 μg/mL).
  2. Aby uzyskać ekspresję UFD1 typu dzikiego, przekształc plazmid zawierający UFD1 w szczep E. coli BL21-Rosetta za pomocą standardowego protokołu transformacji E. coli 20. Kolonie inkubacyjne powstały po przemianie w nocy w bulionie Luria (LB) w temperaturze 37 °C. Następnego dnia zaszczep hodowlę w skali 1:50 do dobrze napowietrzonej kolby zawierającej LB i pozwól jej rosnąć, aż OD600 nm osiągnie 0,7-0,8. Dodaj 1 mM IPTG do hodowli i inkubuj przez 5 godzin w temperaturze 37 °C, potrząsając z prędkością 180 obr./min; potwierdź ekspresję białka za pomocą SDS-PAGE.
  3. Aby wyrazić NPLOC4 typu dzikiego, należy wprowadzić plazmid zawierający NPLOC4 do szczepu E. coli BL21-Rosetta przy użyciu standardowej metody transformacji E. coli 20. Inkubować kolonie powstałe w wyniku przemiany w bulionie Luria (LB) przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia przelej rozcieńczenie hodowli w stosunku 1:50 do dobrze napowietrzonej kolby wypełnionej LB i pozwól jej rosnąć, aż gęstość optyczna przy OD600 nm osiągnie 0,7-0,8. Następnie dodaj 1 mM IPTG do hodowli i kontruj inkubację przez 16 godzin w temperaturze 18 °C, potrząsając przy 180 obr./min; Weryfikuj ekspresję białka poprzez analizę SDS-PAGE.
    UWAGA: Dla całego etapu wzrostu i ekspresji bakterii wykonanego w szczepie E. coli BL21-Rosetta zastosowano Kanamycynę (50 μg/mL) oraz chloramfenikol (20 μg/mL) jako presję selekcyjną. Sekwencje pET28a-p97 i pET41b-NPLOC4 są przedstawione w Pliku Uzupełniającym 1.
  4. Po ekspresji białek wiruj komórki bakteryjne w dawce 21 000 × g przez 10 minut i ponownie zawiesij pellet w buforze lizy zawierającym 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolu, 1 mM PMSF, 5% glicerolu, pH 8.
  5. Sonikuj komórki przez 1 godzinę za pomocą wąskiej sondy (średnica końcówki 6 mm) o amplitudzie 50 μm i z impulsem 20 sekund włącz/wyłącz przy 4 °C. Rozsypuj zanieczyszczenia granulkami używając 15 000 × g przez 1 godzinę i zbieraj supernatant.
    UWAGA: Całkowita sonakacja trwała 1 godzinę (30 minut WŁĄCZONY i 30 min WYŁĄCZ jako 20 sekundowe impulsy), a proces kontynuowano aż zawiesina mętnych komórek stała się przezroczysta i przezroczysta. Konieczna jest wirowanie wysokiej prędkości, aby zapewnić, że zanieczyszczenia komórkowe pozostają w granulatach i nie odsuwają się podczas ładowania lizatu na kolumnę oczyszczającą białko.
  6. Przepuszcz supernatant przez filtr 0,4 μm i ładuje go na kolumnę wypełnioną kulkami Ni-NTA do oczyszczania powinowactwa, wstępnie wyważoną buforem oczyszczającym (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanol, 5% glicerol, pH 8).
  7. Płucz kolumnę bogatą w białko za pomocą buforu płuczącego zawierający 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5M β-merkaptoetanolu, 5% glicerol o pH 8 oraz 30-60 mM imidazolu o zawartości około 400 mL, a następnie eluuj białko za pomocą buforu elucyjnego zawierającego 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolu, 5% glicerolu, pH 8, oraz 250 mM imidazolu.
    UWAGA: Stężenie imidazolu i objętość washu mogą się różnić w zależności od konkretnego analizowanego białka. Aby ocenić czystość, należy wykonać SDS-PAGE. Niezbędne jest dokładne przemycie kolumny, aż eluent wykazuje negatywną reakcję z odczynnikiem Bradforda. Frakcja eluowana wykazuje wyraźny, skoncentrowany pas docelowego białka, który powinien przede wszystkim reprezentować próbkę, z jedynie niewielkimi śladami, jeśli w ogóle, innych białek.
  8. Zbierz różne frakcje, przeanalizuj je za pomocą SDS PAGE, aby zidentyfikować, które frakcje zawierają białka czyste, a następnie wykonaj wymianę buforu buforowego do buforu reakcji (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl i 5% glicerolu przy pH 7,4) przy użyciu kolumny PD-10.
    UWAGA: Zmierz stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda (Coomassie Brilliant Blue G-250). Wszystkie białka powinny być szybko zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C.

7. Test zabijania bakterii in vitro

  1. Połącz 6 μM VCP/p97 z po 1 μM NPLOC4 i UFD1, a następnie wypełnij objętość buforem reakcyjnym do około 90 μL. Pozwól tej mieszance reakcyjnej inkubować się na lodzie przez 2 godziny.
  2. Dodaj 1-2 mM ATP do mieszaniny reakcji zawierającej p97-UFD1-NPLOC4, a następnie połącz ją z ubikwitynowanym SPN (107 komórek ) na czas trwania 2 godzin w temperaturze 37 °C.
  3. Aby ocenić żywotność bakterii, bezpośrednio po leczeniu należy pobrać 1 μl aliquot mieszaniny reakcji, wykonać seryjne rozcieńczenie (1:1, 1:10, 1:100 i 1:1000) i umieścić 10-2 μL każdej rozcieńczeniny na płytkach agarowych Brain Heart Infusion (BHI). Powtarzaj ten zabieg, używając 1 μL aliquotu z reakcji po 2 godzinach inkubacji.
    UWAGA: Znajdź wszystkie rozcieńczenia, aby uzyskać lepsze efekty.
  4. Oceń jednostki tworzące kolonie (CFU) pomiędzy punktami 0 i 2 godziny. Oblicz żywotność bakterii (%), dzieląc liczbę CFU po 2 godzinach przez liczbę CFU przy 0 godzinach, a następnie mnożąc wynik przez 100.
    UWAGA: Aby uzyskać bardziej wiarygodne wyniki, do porównania jako negatywną kontrolę wykorzystaj denaturowany termicznie VCP/p97, VCP/p97 pozbawiony kompleksu kofaktorowego UFD1-NPLOC4 lub wariant VCP/p97 niedobory ATPazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz protokół szczegółowo opisuje wykorzystanie komórek A549 ssaków do produkcji lizatu komórkowego bogatego w niezbędne składniki do rozpoczęcia procesu ubikwitynacji (Rysunek 1A). Ten lizat, niezależnie od tego, czy jest w stanie skoncentrowanym lub zastępowany oczyszczonymi składnikami, takimi jak UBE1 (enzym aktywujący ubikwitynę E1), UbE2C (enzym konjugujący ubikwitynę E2) oraz kompleks Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (ligaza ubikwityna E3), jest mieszany z oczyszc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż system rekonstrukcji in vitro opisany tutaj stanowi solidne ramy do badania molekularnych zawiłości ubiquitinacji i eliminacji bakterii, należy wziąć pod uwagę kilka istotnych ograniczeń. Poleganie na nadfizjologicznych stężeniach oczyszczonych białek, obejmujących mechanizmy ubikwitynacji (E1, E2, E3 ligazy, ubikwityna) oraz kompleks efektorów gospodarza (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), dostarcza kluczowych mechanistycznych wglądów w ubikwitynację i usuwanie patogenów, ale może nie odzwierciedlać w pełni warunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażamy wdzięczność dla Obiektu Poziomu 2 ds. bezpieczeństwa biologicznego oraz Ośrodka Mikroskopii Konfokalnej na IIT Bombay. Sourav Ghosh. (17.06.2018(i) EU-V), Sumit Rakshit (221610197857) i Udit Kumar Das (24D0061) otrzymali stypendia odpowiednio od CSIR, UGC, rządu Indii oraz IIT Bombay. Anirban Banerjee otrzymał dofinansowanie badawcze od Science and Engineering Research Board, rządu Indii (grant numer SPR/2019/000808) oraz Ignite Life Science Foundation (numer grantu IGNITE/FG-OC/2021/004). Instytucje finansujące nie brały udziału w projektowaniu badania, jego zbieraniu i analizie danych, decyzji o publikacji ani w przygotowaniu rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koktajl inhibitorów proteazy 50XPromega G6521
6x-Jego-UbiquitynaUBPBioE1100
Linia komórkowa A549  ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202 
Alexa Fluor 555InvitrogenA-31572    
Przeciwciało przeciw UbiquitynieEnzoBML-PW8810-0100
Przeciwciało klonujące Apu2 specyficzne dla Ubiquitin K48Sigma AldrichZRB2150
ATPSigma AldrichA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (wysoki poziom glukozy)HiMedia AL251
FBSGibco (pochodzenie amerykańskie)38220090
GlicerolPureSynth PSR37325
HEPESSigma AldrichH4034-100G
KClSigma AldrichP3911
MgCl2Sigma AldrichTC006
Paraformaldehyd  Sigma AldrichE6148
plazmid pET28a-p97Nasze laboratoriumPlazmid dostępny na życzenie
Plazmid pET41b-NPLOC4Nasze laboratoriumPlazmid dostępny na życzenie
Plazmid pET41b-UFD1AddgenePlazmid #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Sigma Aldrich23-030
Szczep Streptococcus pneumoniae R6ATCCATCC BAA-255Patogen grupy ryzyka -2, do obsługi w placówce BSL-2
Proszek bulionowy Todd HewittHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
MocznikHiMedia MB032
Proszek z ekstraktu drożdżowego  HiMedia RM027

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
  2. Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  3. Damgaard, R. B. The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities. Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).
  4. Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly. Front Physiol. 10, 835(2019).
  5. Kikkert, M., et al. Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).
  6. Korac, J., et al. Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).
  7. Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).
  8. Ercoli, G., et al. Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia. Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).
  9. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2. EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).
  10. Surve, M. V., et al. Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking. PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).
  11. Franco, L. H., et al. The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  12. Manzanillo, P. S., et al. The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).
  13. Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).
  14. Huett, A., et al. The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium. Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).
  15. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).
  16. Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan. EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).
  17. Apte, S., et al. An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins. Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).
  18. Ghosh, S., et al. Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence. Nat Microbiol. , (2025).
  19. Mitchell, G., Isberg, R. R. Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation. Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).
  20. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  21. Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).
  22. Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1. Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Streptococcus PneumoniaeUbiquitin Enzyme ComplexMammalian Cell LysateUFD1 NPLOC4 ComplexSuper Resolution MicroscopyCryo Electron MicroscopyColony Forming Units

Powiązane artykuły