Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunobarwienie płodu i noworodków myszy na całym stanie.

289 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

28 kwietnia 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metodę immunoznakowania całego gniazda rozwijających się jajników myszy, z zastosowaniami do innych małych tkanek.

Streszczenie

Rezerwa jajnikowa składa się z oocytów dostępnych dla kobiety do rozmnażania i występuje w pierwotnych pęcherzykach, z których każdy zawiera jeden oocyt otoczony kilkoma komórkami ziarniskowatym. Oocyty początkowo są pierwotnymi komórkami rozrodczymi, które tworzą się poza gonadą i migrują do rozwijającego się jajnika podczas rozwoju embrionalnego. Gdy dotrą do jajnika, stają się oogoniami i dzielą się przez mitozę, z niepełną cytokinezą, tworząc skupiska połączonych komórek zwanych torbielami komórek rozrodczych. Podczas torbieli komórki wchodzą w mejozę i stają się oocytami. U myszy, dwa dni przed narodzinami, torbiele zaczynają się rozpadać, a każdy oocyt jest pakowany w pierwotny pęcherzyk. Tylko część oocytów przetrwała podczas tego procesu, reszta przechodzi apoptozę. Regulacja rozkładu torbieli i powstawania pierwotnych pęcherzyków jest tylko częściowo zrozumiana, a identyfikacja zaangażowanych cząsteczek jest kluczowa dla zrozumienia tego procesu. Całkowite barwienie immunobarwne rozwijających się jajników myszy może być wykorzystane do określenia lokalizacji potencjalnych cząsteczek regulatorowych oraz oceny wpływu na powstawanie pierwotnych pęcherzyków spowodowanych mutacjami lub innymi zmianami molekularnymi przy użyciu markerów komórek oocytowych i somatycznych. Jajniki pobierane są od myszy płodowych lub noworodkowych, utrwalane w formaldehydzie i blokowane. Jajniki są następnie wystawiane na działanie przeciwciał przeciwko interesującemu białko, a następnie przeciwciała wtórne sprzężone z fluorescencyjnym tagiem wykrywającym przeciwciała pierwotne. Na koniec jajniki są montowane i badane mikroskopią konfokalną. Procedura ta pozwala wykrywać wiele interesujących białek i może być stosowana także do innych małych tkanek, takich jak płodowe jądra myszy.

Wprowadzenie

Immunobarwienie całego gniazda połączone z obrazowaniem konfokalnym to potężna metoda analizy ekspresji białek i morfologii komórek w małych tkankach bez konieczności sekcjonowania1. W tej metodzie tkanki są najpierw pobierane, utrwalane i blokowane, a następnie wystawiane na działanie przeciwciał przeciwko białkom zainteresowania. Przeciwciała są albo bezpośrednio sprzężone z fluoroforami, albo oznaczane są wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforami rozpoznającymi przeciwciała pierwotne. Tkanka jest następnie inkubowana barwnikiem fluorescencyjnym 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI), aby wizualizować jądra komórkowe. Ten krok jest ważny, aby zapewnić orientację przestrzenną podczas obrazowania tkanki. Na koniec tkanka jest montowana i wizualizowana za pomocą mikroskopii konfokalnej. Inna technika stosowana do badania morfologii tkanek polega na osadzaniu tkanki w parafinie, sekcjonowaniu oraz oznaczaniu barwnikami takimi jak hematoksylyna i eozyna lub przeciwciałami. Alternatywnie można przygotować mrożone cięcia i poddać je immunobarwie. Niestety, obie te techniki wymagają przekroju, co skutkuje utratą informacji trójwymiarowych. Chociaż sekcje seryjne mogą pomóc, analiza jest żmudna i wymaga przeglądania dużej liczby sekcji. Dlatego metoda całego montażu jest korzystna, ponieważ zachowuje trójwymiarową strukturę tkanki, którą można zobrazować za pomocą sekcji optycznej.

Rozwój pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) w oocytach oraz składanie oocytów w pierwotne pęcherzyki są niezbędne dla płodności kobiet. PGC powstają pozaembrionicznie i muszą migrować do jajnika podczas rozwoju embrionalnego. Gdy płąki PGC dotrą do jajnika, zaczynając mniej więcej od dnia embrionalnego (E) 10.5 u myszy, klasyfikuje się je jako oogonia2. Oogonia przechodzą mitozę, ale z niepełną cytokinezą, tworząc połączone ze sobą skupiska komórek zwane torbielami komórek rozrodczych3. Oogonia wchodzi w mejozę od E 13.5, przekształca się w oocyty i przechodzi przez profazę I do etapu diplotenu. W miarę rozwoju oocytów torbiele się rozpadają, umożliwiając otoczenie każdej oocytu warstwą ziarnistych komórek, tworząc pierwotne pęcherzyki z zatrzymem diplotenowym4. Utrata dużej liczby oocytów zbiega się z rozpadem torbieli, co uważa się za istotne dla kontroli jakości podczas powstawania pierwotnych pęcherzyków. Liczba jajków zatrzymanych przez diploten w pęcherzykach pierwotnych stanowi rezerwę jajników dostępnych do rozmnażania i jest bezpośrednio związana z płodnością. Jeśli powstawanie pęcherzyków zostanie zakłócone, może to prowadzić do zmniejszenia rezerwy jajnikowej, ograniczając długość życia rozrodczego kobiet.

Immunobarwienie całościenne zostało użyte do identyfikacji i analizy ekspresji białek podczas rozwoju oocytów embrionalnych, płodowych i noworodkowych. Badane cząsteczki to m.in. MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT oraz STAT3 5,6,7,8,9. Technika ta była również szeroko stosowana do odkrycia, jak regulacja powstawania pęcherzyków pierwotnych jest regulowana. Jajniki płodowe lub noworodkowe były hodowane i wystawione na cząsteczki sygnalizacyjne lub inhibitory. Oocyty w hodowanych jajnikach przechodzą pierwotne tworzenie pęcherzyków pierwotnych, podobnie jak in vivo10. Posiew jajników został z powodzeniem wykorzystany do badania hormonówsterydowych 6, 10, 11, KIT8 oraz PI3K12 na tym etapie rozwoju jajników. Po hodowli stosuje się immunobarwienie na całych nasadach z użyciem przeciwciał przeciwko helikazie DEAD box 4 (DDX4, znanej również jako homolog myszy wazy (MVH)), białka eksprimowanego w cytoplazmie oocytów. Następnie jajniki są badane mikroskopią konfokalną w celu oceny powstawania pierwotnych pęcherzyków pierwotnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z użyciem myszy zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użycia Zwierząt Uniwersytetu Syracuse (IACUC). Następujący protokół dotyczy oznaczania jajników noworodków myszy w dniach 1–5 po porodzie (patrz Rysunek 1 dla schematu). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie i naprawa jajników

  1. Uśpienie noworodkowych myszy C57BL/6 zgodnie z "Przewodnikiem po opiece i użyciu zwierząt laboratoryjnych" Narodowego Instytutu Zdrowia oraz protokołami zatwierdzonymi przez IACUC. Rozcinają jajniki w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
    UWAGA: W tym przypadku noworodkowe myszy zostały uśpione przez dekapitację, zgodnie z naszym protokołem IACUC dotyczącym zwierząt. Samce i samice szczepu myszy C57BL/6 można u noworodków odróżnić po obecności małej ciemnej plamki między otworami płciowymi u samców. Aby rozcinać jajniki, najpierw przetnij żołądek i wyjmij jelita. Następnie otwórz odwłok z nacięciem środkowym do ogona, a następnie wykonaj dwa poziome cięcia. Umieść jajniki pod każdą nerką, wyizoluj każdy jajnik i usuń nadmiar tkanek.
  2. Umieść jajniki bezpośrednio w 600 μL 5,3% paraformaldehydu (PFA; 16% PFA o jakości EM rozcieńczonej w 1x PBS) (utrwalenie) w mikrorurce w temperaturze pokojowej (RT). Inkubuj jajniki w fiksacji na nutatorze przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Używaj w okapie spalinowym lub dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Noś rękawiczki, ochronę oczu oraz odzież ochronną, aby zapobiec kontaktu ze skórą i oczami. Utylizować jako odpady niebezpieczne.
  3. Usuń jajniki i myj dwa razy w 1 mL 0,1% Triton X-100 w 1x PBS (PT), a następnie raz na 1 mL PT na nutatorze przez co najmniej 30 minut w RT. Inkubuj w 1 mL PT + 5% BSA (Block) przez co najmniej 30 minut w RT na nutatorze lub przechowuj w 4 °C do 2 tygodni.

2. Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi

  1. Inkubować z pierwotnym przeciwciałem rozcieńczonym w 500 μl PT + 5% BSA O/N w temperaturze 4 °C na nutatorze. Przemyj trzy razy w 1 mL PT + 1% BSA, 30 minut na RT na nutatorze.
    UWAGA: Rozcieńczenie zależy od przeciwciała. Reprezentatywne dane pokazane tutaj są oznaczone rozcieńczonym wskaźnikiem DDX4 w skali 1:200. Przeciwciała przeciwko dwóm różnym białkom mogą być stosowane jednocześnie, o ile pierwotne przeciwciała są wytwarzane w dwóch różnych gatunkach, a jedno wtórne nie jest wytwarzane w gatunku, który drugi rozpoznaje (nie używaj koziego anty-myszy-Alexa 488 i osiołowego anty-kozi-Alexa 568).
  2. Podczas inkubacji jajników z pierwotnym przeciwciałem inkubuj rozcieńczone przeciwciało wtórne szczyptą proszku zarodkowego w stężeniu 500 μL PT + 5% BSA O/N w temperaturze 4 °C na nutatorze (przykrytym folią), aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał wtórnych. Wiruj przeciwciało wtórne w stężeniu 6000 x g przez 30 sekund, aby zebrać proszek resztowy na dnie. Upewnij się, że nie pobierasz tego resztka podczas przenoszenia wtórnego do probówki.
    UWAGA: Rozcieńczenie zależy od przeciwciała. Reprezentatywne dane pokazane tutaj są oznaczone rozcieńczonym preparatem przeciwkróliczym dla kóz Alexa 488 w skali 1:200.
  3. Inkubować z wcześniej wchłoniętym fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym (wyprodukowanym w kroku 2.2) przez 2–4 godziny w RT na nutatorze. Od tego momentu przykrywaj folią. Przemyj trzy razy w 1 mL PT + 1% BSA, przez 30 minut na RT na nutatorze.

3. Oznaczanie jąder DAPI i zamontowanie jajników na szkiełku

  1. Inkubuj w DAPI 1:1000 w PBS przez 90 minut w RT. Raz myj 1 mL 1x PBS.
  2. Przenieś jajniki na szkiełko mikroskopowe za pomocą szerokiego końcówki mikropipety o pojemności 200 μL. Usuń nadmiar skarbonki za pomocą igły lub strzykawki. Dodaj 3 krople mediów mocujących na jajniki.
  3. Delikatnie nałóż pokrywkę na jajniki, upewniając się, że materiał montażowy rozprzestrzenia się na krawędzi slipu. Zabezpiecz krawędzie pokrywy lakierem do paznokci i pozwól lakierowi wyschnąć, a następnie przechowuj w temperaturze -20 °C.

4. Przygotowanie proszku z zarodków

  1. Homogenizacja ~ E 12.5–E 14.5 zarodków myszy w minimalnej objętości lodowatego 1x PBS. Dodaj 4 objętości lodowatego acetonu, wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
    UWAGA: Aceton jest łatwopalny i drażniący dla oczu oraz skórę. Używaj w okapie spalinowym lub dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Noś rękawiczki, ochronę oczu oraz odzież ochronną, aby zapobiec kontaktu ze skórą i oczami. Utylizować jako odpady niebezpieczne.
  2. Wiruj w 10 000 x g przez 10 minut, usuń supernatant, a następnie przemyj granulat lodowatym acetonem i ponownie zakręć.
  3. Rozłóż granulkę na arkuszu papieru filtracyjnego, umieść ją w plastikowej tacce i pozwól wyschnąć O/N w okapie chemicznym. Zmiel na drobny proszek, pozwól całkowicie wyschnąć na powietrzu i przechowuj w temperaturze -20 °C.

5. Analiza ekspresji białek za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Po oznakowaniu interesującego białka zwizualizuj je za pomocą mikroskopii konfokalnej. Do badania ekspresji białek zazwyczaj używamy 3–4 zwierząt (6–8 jajników) i wykonujemy kilka obrazów każdego jajnika.
    UWAGA: Obrazy opisane w sekcji reprezentatywnych wyników zostały uzyskane albo za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego mikroskopu laserowego skanującego konfokalnego. Parametry używane są opisane w sekcji reprezentatywnych wyników i różnią się w zależności od używanego mikroskopu.

6. Analiza powstawania i rozwoju pierwotnych pęcherzyków za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Po oznakowaniu jajników pod kątem cytoplazmatycznego markera oocytu, takiego jak DDX4, dla każdego jajnika losowo przypisz dwa obszary, czyli "rdzenie" do wizualizacji.
    UWAGA: Rdzeń składa się z 4 głównych sekcji optycznych o średnicy 212 × 212 μm, z których każda jest oddzielona głębokością 15–20 μm. Cztery przekroje optyczne obejmują zarówno korę, jak i rdzep przedkołowy, aby zapewnić ocenę wszystkich obszarów jajnika. Na każdy jajnik przypadają 2 rdzenie z 4 przekrojami optycznymi, co daje łącznie 8 sekcji (patrz Rysunek 2).
  2. Po zobrazowaniu głównej sekcji optycznej do analizy wykonaj stos Z: 5 obrazów powyżej i 5 obrazów poniżej głównej sekcji, każdy oddalony od 1 μm. Dla każdej głównej sekcji policz łączną liczbę oocytów w danej sekcji
  3. Następnie dla każdego oocytu w głównej sekcji określ, czy jest powiązany z innym oocytem, badając główną sekcję oraz stos sekcji, aby ustalić, czy oocyty w głównej sekcji były powiązane z oocytami powyżej czy poniżej płaszczyzny ogniskowej. Na koniec, dla każdego oocytu określić, na jakim etapie rozwoju mieszków jest (pierwotny, pierwotny lub wtórny).
    UWAGA: Zaleca się analizę co najmniej 4 zwierząt (8 jajników), aby uzyskać dane statystycznie istotne.

7. Wykorzystanie jodku propidiu jako alternatywnego markera jądrowego

  1. Po kroku 2.3 inkubuj przez 30 minut w dawce 0,1 mg/ml RNazy A (10 μL 10 mg/ml w 1 ml PT + 1% BSA). Usuń RNazę A i inkubuj w 10 μg/mL jodku propidiu (10 μL 1 mg/mL w 1 mL PT + 1% BSA) przez 20 minut w RT na nutatorze. Od tego momentu przykrywaj tubkę folią.
    UWAGA: Jodek propidiu jest toksyczny i mutagenny. Używaj w okapie spalinowym lub dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Noś rękawiczki, ochronę oczu oraz odzież ochronną, aby zapobiec kontaktu ze skórą i oczami. Utylizować jako odpady niebezpieczne.
    UWAGA: Toto-3 może być również używany jako marker jądrowy.
  2. Usuń jodek propidiu i myj przez 30 minut w 1 mL PT + 1% BSA. Pomiń krok 3.1 (barwienie DAPI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono typowe wyniki metody immunodawistyki opisanej tutaj. Obrazy na Rysunkach 3, 4, 5 i 6 zostały wykonane obracającym się dyskowym mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu olejnego 40x, NA 1.3, z czasem naświetlenia od 100 do 250 ms i mocą lasera od 0,01 do 0,1%. Na Rysunku 3 noworodkowe jajniki myszy są oznaczone przeciwciałami przeciwciałami ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Raport ten opisuje metodę fluorescencyjnego oznaczania całych jajników dla białek interesujących nas zainteresowania. Procedura ta była szeroko stosowana do określenia ekspresji białek podczas tworzenia pęcherzyków pierwotnych, a także do charakteryzowania zmian w ich tworzeniu w różnych warunkach 4,5,6,7,8,9,10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Obrazowanie wykonano w Blatt Imaging Center na Uniwersytecie Syracuse. Obrazy na Rysunku 7 zostały uzyskane z Zeissa LSM980 z Airyscan2 wspieranym przez NIH S10 OD026946-01A1. Prace te były wspierane grantami R03 HD102016 i R21 HD112756 od NIH (dla europosła).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-ludzki VASA (wyprodukowany w kozie)R& DAF2030
anty-DDX4/MVH (wyprodukowany w króliku)AbcamAB13840
anty-GCNA1/TRA98 (wyprodukowany w szczurze)Abcamab82527
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)FisherBP-1600
Okładki 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (proszek)Sigma AldrichD-9542Przygotuj roztwór 5 mg/ml w dH2O
Zakres sekcji
Anty-kozy Alexa 568 dla osłaInvitrogenA11057
Osiołek anty-myszy Alexa 488InvitrogenA21202
Osioł anty-Króliczy Alexa 568InvitrogenA10042
Osły anty-Rabbit Alexa 647InvitrogenA31573
Donkey anty-Rat Alexa 488InvitrogenA21208
Etanol 200 proofPharmco111000200
Cienkie nożyczki – ostreNarzędzia Nauki Ścisłej14060-09Do precyzyjnej pracy przy usuwaniu jajników i przycinaniu nadmiaru tkanek
Kleszcze (pęseta Dumont, styl 5)Nauka o mikroskopii elektronowej72705-01 (0209-5-PO)
Alexa 488 przeciwko kozom przeciwko królikomInvitrogenA11008
Rurki mikrowirówki 1,5 mLThermo Scientific3451PK
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-123
Mieszacz nutacyjnyLabNetS0500
Paraformaldehyd 16%Nauka o mikroskopii elektronowej15710
Szalki Petriego 100 x 15 mmProdukcja Bioplastu940-10774
Fosforanowa buforowana sól fizjologiczna 1X(Fisher) S271-1;                   (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O                            80 g NaCl                                        2.0 KCl                                                14,4 g Na2HPO4                  2,4 g KH2PO4                  Reguluj pH do 7,4 z HCl; Ostatni tom 1 L. Następnie rozcieńcz z 10X do 1X do użycia
Uchwyt na przypinkiNarzędzia Nauki Ścisłej26016-12do trzymania prostej igły zgiętej w lekkim zakrzywieniu
Końcówki filtrów pipetekOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
Końcówki pipetyOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
Pipety 0,2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0,1-2 uL) F144054M;       (2-20 uL) F144056M;     (20-200 uL) F144058M;       (100-1000 uL) F144059M
Propidium jodek, 1mg/ml w dH2OInvitrogenP3566
Proszek RNazy ASigma AldrichRG513-50mgPrzygotuj roztwór 10 mg/ml w 0,1 M octana sodu (pH 5,2). Podgrzej do 100°C oC przez 15 minut. Schłodzenie do RT i regulacja pH przez dodanie 0,1 objętości 1 M Tris-Cl (pH 7,4)
Prosta igłaprosta igła wygięta w krzywiznę, aby odciąć nadmiar tkanki od jajnika
Triton X-100Thermo ScientificX100-100ML
Strzykawka gruźlicynowa 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
VectashieldLabratoria wektoroweH-1900
Nożyce WagneraNarzędzia Nauki Ścisłej14068-12Do dekapitacji i większych cięć
Szerokoprzeciętna końcówka pipety 20 ulLabCon1026-965-008-9

Bibliografia

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

prymordialne pęcherzykicysty komórek zarodkowychmarkery oocytówmarkery komórek somatycznychmikroskopia konfokalnapłodowe jajniki myszytworzenie pęcherzyków

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.