Method Article

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) to biopolimery zbudowane z powtarzających się sekwencji pentapeptydów, które naśladują motywy występujące w tropoelastynie ssaków. Ich unikalne cechy czynią je idealnymi kandydatami do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, od dostarczania leków i genów po inżynierię tkanek i ukierunkowane obrazowanie molekularne. Konwencjonalne metody oczyszczania z ekspresji Escherichia coli (E. coli) mogą być nieskuteczne dla ELP ze względu na powstawanie ciał inkluzyjnych. Inne metody, takie jak cykl odwrotnych przejść (ITC), wykorzystują właściwości ELP o niższej krytycznej temperaturze roztworu (LCST) do oddzielenia go od zanieczyszczeń, takich jak lipopolisacharydy (LPS), ale zazwyczaj wymagają wielu etapów podgrzewania i chłodzenia, które są czasochłonne i mogą prowadzić do niskich odzysków w zależności od sekwencji, stężenia i masy cząsteczkowej konstrukcji ELP. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy proces ekstrakcji i wytrącenia oparty na rozpuszczalnikach organicznych, który wykorzystuje wewnętrzną hydrofobiczność ELP, umożliwiając szybkie, solidne i szeroko stosowane oczyszczanie bezpośrednio z pelletów komórkowych E. coli . Metoda ta wykorzystuje polarne rozpuszczalniki organiczne do wspomagania rozbicia komórek i selektywnej rozpuszczania ELP w jednym kroku. Kolejny etap wytrącenia skutecznie usuwa pozostałości rozpuszczalników organicznych, zanieczyszczenia o niskiej masie molekularnej oraz endotoksyny, dając wysoce czyste ELP z poziomem LPS poniżej 1 EU/mL w mniej niż 3 godziny. Dane z mikroskopii siłowej z zakresu sił atomowych sugerują, że białka ELP fuzyjne oczyszczone w ten sposób mogą samoorganizować się w odwrócone struktury przypominające micele, które zachowują funkcję białka fuzyjnego. Ta metoda szybkiego oczyszczania oferuje naukowcom prosty i potencjalnie skalowalny sposób oczyszczania ELP, tworząc nowe możliwości wykorzystania ELP i ich białek fuzji jako elastycznych elementów budulcowych dla zastosowań materialnych i biomedycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) to biopolimery złożone z powtarzających się (VPGXG)n motywów 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Reszta gościnna X w jednostce pentapeptydowej może być dowolnym aminokwasem innym niż prolina. Zmiany w X mogą być wykorzystane do dostrojenia hydrofobowości, zachowania przejścia termicznego oraz cech funkcjonalnych konstrukcji ELP w celu stworzenia mod....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów

  1. Szczep bakteryjny: Stosuj chemicznie kompetentne komórki Escherichia coli BL21(DE3) jako gospodarza ekspresyjnego.
    UWAGA: Wybrano je ze względu na wysoką efektywność transformacji oraz przydatność do produkcji białek rekombinowanych.
  2. Plazmid ekspresyjny: Użyj białka fuzyjnego kodującego wektor pET21(+) z ampicylinową opornością9. Kup wektor plazmidowy od addgene. Wprowadź gen Cm2 za pomocą miejsca BsrG I na końcu inteiny.
    UWAGA: Sekwencja DNA plazmidowego dla tego białka jest podana w Pliku Uzupełniającym 1.
  3. Podłoże wzrostowe: Świetn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po przejściu przez ostatnie fazy protokołu kolejnym krokiem jest wizualizacja wyniku ekstrakcji i opadania za pomocą analizy SDS-PAGE oraz barwienia na błękit Coomasie. Gdy przed ekstracją organiczną następuje etap lizy, powinien być widoczny wyraźny pas ELP. W przypadku ELP-I-Cm2 pasmo to pojawia się na 100 kDa (rysunek 3A).

Przesiewanie różnych kombinacji rozpuszczalników organicznych wykazało zmienną efektywność ekstrakcyjną (rysunek 3B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC było wcześniej stosowane do oczyszczania ELP19 niechromatograficznego; Jednak może to być metoda czasochłonna i o niskiej wydajności. W metodach opisanych powyżej opisujemy podejście do szybkiego oczyszczania białka fuzyjnego ELP-I-Cm2, pokazując, jak metoda ekstrakcji i wytrącenia oparta na rozpuszczalnikach organicznych może być skutecznie stosowana do oczyszczania szerokiej gamy fuzji ELP i ELP. Protokół rozpuszczalnika organicznego jest nie tylko szybszy niż ITC, ale także znacznie skutecz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Instytutowi Badań nad Rakiem Uniwersytetu Purdue oraz programowi NIH CCSG (CA23168) za wsparcie tej pracy.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MerkaptoetanolBio-Rad161-0710Komponent SDS-PAGE
30% akryloamidu/bisakrylamiduTCIA3218Komponent SDS-PAGE
AcetonFisher ScientificA949Rozpuszczalnik organiczny
AcetonitrylFisher ScientificA996Rozpuszczalnik organiczny
AmpicylinaGold Bio- Gold BiotechnologyA-301-25Antybiotyk
APS (nadsiarczan amonu)Bio-Rad1610700Komponent SDS-PAGE
ButanolFisher ScientificL13171Rozpuszczalnik organiczny
EDTABioreagenty FisheraBP118-500Komponent buforu lizy
EtanolDecon LabsUN1170Rozpuszczalnik organiczny
Octan etyluFisher ScientificE195Rozpuszczalnik organiczny
GlicerolResearch Products InternationalG22020-0.5Świetny komponent mediów bulionu (TB)
Kwas solnyFisher ScientificA144SI-212Komponent buforu lizy
Natychmiastowa plama CoomasieAbcamab119211Komponent SDS-PAGE
IPTGGold Bio- Gold Biotechnology12481C25Komponent ekspresji białek
IzopropanolFisher ScientificA451-1Rozpuszczalnik organiczny
K2HPO4 (Fosforan potasu, monozasadowy)Nauka Warda470302-246Część 2 Komponent bufora
KH2PO4 (dwubazowy fosforan potasu)Nauka Warda470302-254Część 2 Komponent bufora
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Świetny komponent mediów bulionu (TB)
LizozymGold Bio- Gold BiotechnologyL-040-1Komponent buforu lizy
MetanolFisher ScientificA452Rozpuszczalnik organiczny
Natywny bufor próbekBio-Rad161-0738Komponent SDS-PAGE
Drabinka białkowaGold Bio- Gold BiotechnologyP008-500Komponent SDS-PAGE
Rozdzielanie buforu żelowegoBio-Rad1610798Komponent SDS-PAGE
Siarczan sodim Dodecyl (SDS)Thermo ScientificJ18220-36Komponent SDS-PAGE
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-500Komponent buforu lizy
Bufor żelowy do stosowaniaBio-Rad1610799Komponent SDS-PAGE
TEMEDBio-Rad1610801Komponent SDS-PAGE
Baza TrisBioreagenty FisheraBP-152Komponent buforu lizy
TryptonResearch Products InternationalT60065-1000.0Świetny komponent mediów bulionu (TB)
Ekstrakt drożdżowyResearch Products InternationalY20025-1000.0Świetny komponent mediów bulionu (TB)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles