Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Joydeep Rakshit; Feng Qu; Saloni Darji; Andrew Dyba; Bryn Cook; David  H. Thompson

doi:10.3791/69465

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69465

⸱

9 stycznia 2026

Joydeep Rakshit¹ , Feng Qu¹ , Saloni Darji¹ , Andrew Dyba¹ , Bryn Cook¹ , David H. Thompson¹

¹Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Streszczenie

Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) to biopolimery zbudowane z powtarzających się sekwencji pentapeptydów, które naśladują motywy występujące w tropoelastynie ssaków. Ich unikalne cechy czynią je idealnymi kandydatami do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, od dostarczania leków i genów po inżynierię tkanek i ukierunkowane obrazowanie molekularne. Konwencjonalne metody oczyszczania z ekspresji Escherichia coli (E. coli) mogą być nieskuteczne dla ELP ze względu na powstawanie ciał inkluzyjnych. Inne metody, takie jak cykl odwrotnych przejść (ITC), wykorzystują właściwości ELP o niższej krytycznej temperaturze roztworu (LCST) do oddzielenia go od zanieczyszczeń, takich jak lipopolisacharydy (LPS), ale zazwyczaj wymagają wielu etapów podgrzewania i chłodzenia, które są czasochłonne i mogą prowadzić do niskich odzysków w zależności od sekwencji, stężenia i masy cząsteczkowej konstrukcji ELP. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy proces ekstrakcji i wytrącenia oparty na rozpuszczalnikach organicznych, który wykorzystuje wewnętrzną hydrofobiczność ELP, umożliwiając szybkie, solidne i szeroko stosowane oczyszczanie bezpośrednio z pelletów komórkowych E. coli . Metoda ta wykorzystuje polarne rozpuszczalniki organiczne do wspomagania rozbicia komórek i selektywnej rozpuszczania ELP w jednym kroku. Kolejny etap wytrącenia skutecznie usuwa pozostałości rozpuszczalników organicznych, zanieczyszczenia o niskiej masie molekularnej oraz endotoksyny, dając wysoce czyste ELP z poziomem LPS poniżej 1 EU/mL w mniej niż 3 godziny. Dane z mikroskopii siłowej z zakresu sił atomowych sugerują, że białka ELP fuzyjne oczyszczone w ten sposób mogą samoorganizować się w odwrócone struktury przypominające micele, które zachowują funkcję białka fuzyjnego. Ta metoda szybkiego oczyszczania oferuje naukowcom prosty i potencjalnie skalowalny sposób oczyszczania ELP, tworząc nowe możliwości wykorzystania ELP i ich białek fuzji jako elastycznych elementów budulcowych dla zastosowań materialnych i biomedycznych.

Wprowadzenie

Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) to biopolimery złożone z powtarzających się (VPGXG)n motywów 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Reszta gościnna X w jednostce pentapeptydowej może być dowolnym aminokwasem innym niż prolina. Zmiany w X mogą być wykorzystane do dostrojenia hydrofobowości, zachowania przejścia termicznego oraz cech funkcjonalnych konstrukcji ELP w celu stworzenia mod....