Artykuł metodologiczny

Mikrofabrykacja podłoży z mikroskalowymi gradientami sztywności w celu kierowania migracją komórek stromalnych szpiku kostnego

DOI:

10.3791/69473

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje wytwarzanie podłoża z polidimetylosiloksanu dwuwarstwowego (PDMS) za pomocą litografii miękkiej. Metoda wykorzystuje geometrycznie modulowane mikrostruktury w sztywnej warstwie podłożnej, połączone z miękką, płaską warstwą wierzchnią, aby generować mikroskalowe efektywne gradienty sztywności, umożliwiając badania mechanobiologii komórkowej bez zakłóceń topograficznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, jak komórki reagują na sygnały mechaniczne, jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów zaangażowanych w rozwój tkanek i postęp choroby. Jednak istniejące substraty hodowli komórek in vitro często nie oddają fizjologicznych gradientów sztywności na skali komórkowej, jednocześnie eliminując zakłócające sygnały topograficzne. W tym badaniu przedstawiamy model sztywności rozdzielonej z wykorzystując podłoże z dwuwarstwowego polidimetylosiloksanu (PDMS). Podłoże to składa się z miękkiej, płaskiej warstwy zawieszonej na sztywnej warstwie podłożnej z mikrostrukturami w kształcie żłobienia i bruzd. Wierzchnia warstwa skutecznie przekazuje zmiany sztywności w strukturze podstawowej, jednocześnie zachowując jednolitą topografię i chemię powierzchni kontaktu komórki. Modulacja sztywności uzyskuje się poprzez zmianę szerokości naprzemiennych żłobień i rowków, które są rozmieszczone równomiernie. Skaningowa mikroskopia elektronowa potwierdziła morfologię płaskiej powierzchni oraz spójną topografię kontaktową. Mikroskopia sił atomowych wykazała, że zmiany sztywności zależą od mikrostruktury: dla wzorów o średnicy 20 μm moduły sprężystości wynosiły około 950 kPa dla żłobień i 850 kPa dla rowków; dla wzorów 50 μm wartości te wynosiły odpowiednio około 1070 kPa i 950 kPa. Pierwotne komórki szpiku kostnego myszy dobrze się przyczepiły i rozprzestrzeniały na podłożu, wykazując preferencję lokalizacji jądrowej w kierunku sztywniejszych obszarów grzbietu w wzorze 50 μm (61,49%, p < 0,05), co potwierdza efektywną komórkową percepcję gradientu mechanicznego. Podsumowując, protokół ten oferuje powtarzalną metodę budowy substratu z podłożem z mikroskalowymi gradientami sztywności, minimalizującym zakłócenia chemiczne lub topograficzne i umożliwiając badania mechanotransdukcji komórkowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mają zdolność wyczuwania i reagowania na bodźce mechaniczne w swoim zewnętrznym mikrośrodowisku 1,2,3, które są kluczowe do regulacji różnych procesów komórkowych, w tym adhezji, migracji, proliferacji i różnicowania4. In vivo właściwości mechaniczne mikrośrodowiska tkanek wykazują istotną heterogeniczność przestrzenną, z różnicami w sztywności macierzy obserwowanymi zarówno w kontekstach fizjologicznych – takich jak połączenia kości i mięśni – jak i w warunkach patologicznych, takich jak w guzach 5,6,7. Kompleksowe badanie tych czynników mechanicznych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych regulujących zachowanie komórek. Mechanizmy te są kluczowe w procesach takich jak rozwój tkanek, postęp choroby oraz proces regeneracji i naprawy 8,9.

Aby symulować to złożone mechaniczne mikrośrodowisko in vitro, szeroko stosuje się hydrożele lub elastomery do tworzenia podłoży o zmiennej sztywności poprzez regulację stopnia sieciowania lub stosunku składników 3,10,11,12,13. Jednak metody te często prowadzą do dyskretnych zmian sztywności, które nie odtwarzają ciągłych, mikroskopijnych gradientów sztywności wiernie naśladujących warunki fizjologiczne 13,14,15,16,17. Najnowsze badania analizowały techniki takie jak optyczne sieciowanie (np. użycie fotomaski do regulacji ekspozycji na promieniowanie UV)18, mieszanie mikrofluidyczne wielokanałowe19,20 oraz środki sterowane dyfuzją21 do budowy gradientów sztywności. Niestety, takie podejścia mogą być technicznie skomplikowane i wprowadzać dodatkowe zmienne, takie jak rozmiar siatki22, pęcznienie 23,24 oraz topografia25. Wprowadzenie czynników zakłócających utrudnia interpretację odpowiedzi komórkowych na sztywność. System dwuwarstwowy PDMS, wykorzystujący mikrofilarowe matryce lub wzory szachownicowe jako strukturę nośną, został przyjęty do tworzenia podłoża do hodowli komórkowych o gradientach sztywności26,27. Podejścia te opierają się na dyskretnych podłożach pod chemicznie jednorodną błoną, aby osiągnąć izotropową modulację sztywności, co stanowi cenne podstawy do badania adhezji i rozprzestrzeniania się komórek. Jednak natywne mikrośrodowisko komórkowe in vivo często jest wysoce anizotropowe pod względem właściwości mechanicznych28,29. To kierunkowe mechaniczne sygnalizowanie ma być postulowane jako głęboko wpływające na fundamentalne zdarzenia biologiczne. Dlatego obecne strategie biofabrykacji są ograniczone w zdolności do odtworzenia subtelnych interakcji sztywności komórek obserwowanych in vivo, które zależą od dokładnego naśladowania gradientów sztywności w skali mikroskalowej oraz przestrzennej heterogeniczności w substratach obciążonych komórkami.

Wcześniejsze badania wykazały, że komórki mogą postrzegać skuteczną sztywność sztywnych obiektów nawet wtedy, gdy nie znajdują się one bezpośrednio w kontaktie komórkowym30. Na podstawie tego badania wprowadzamy nowatorski podłoże do hodowli komórek z polidimetylosiloksanu (PDMS), które generuje kontrolowane gradienty sztywności na skalach przestrzennych od 5 do 50 μm, odpowiadając zakresowi wielkości istotnemu dla mechanosensowania podkomórkowego i jednokomórkowego. Podłoże składa się z dwóch odrębnych warstw: sztywnej warstwy PDMS z regulowanymi mikrostrukturami geometrycznymi oraz jednolitej, płaskiej miękkiej warstwy PDMS, która służy jako powierzchnia stykająca się z komórką. Ta konstrukcja pozwala na modulację mechaniczną wyłącznie poprzez zmiany geometrii podkonstrukcji, przy jednoczesnym zachowaniu spójnej chemii powierzchni i topografii. W konsekwencji skutecznie oddziela sygnał sztywności od innych sygnałów fizycznych i chemicznych, oferując biologicznie bardziej istotny system modulacji sztywności.

W przeciwieństwie do tradycyjnych podłoży opartych na hydrożelu, nasze podejście umożliwia badania mechaniczne z pojedynczą zmienną bez zakłóceń spowodowanych pęcznią, rozmiarem siatki czy topologią powierzchni. Podłoże jest łatwe do wykonania przy użyciu standardowej miękkiej litografii i jest wysoce powtarzalne31. Jest również kompatybilny z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości, co czyni go szczególnie dobrym do obrazowania w czasie rzeczywistym oraz ilościowych badań odpowiedzi komórkowych na mikroskopijne sygnały sztywności. Niniejszy manuskrypt przedstawia kompletny protokół produkcji, szczegółowo opisuje strategię kontroli parametrów oraz demonstruje użyteczność substratu w reprezentatywnych eksperymentach hodowli komórkowych. Ostatecznie to podejście stanowi solidne i dostępne narzędzie in vitro do badania odpowiedzi komórek na gradient sztywności w mikroskali.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne komórki stromalne szpiku kostnego myszy (mBMSC) zostały wyizolowane z kości piszczelowej i udowej myszy (nie. WP20230204, zatwierdzone przez Komisję Etyczną Centrum Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Wuhan).

1. Przygotowanie formy do mistrza

UWAGA: Nasze protokoły są specyficzne dla epoksydowego negatywnego fotorezysty używanego podczas tych badań.

  1. Połóż na płytce grzewczo dwa czyste płytki krzemowe (50,8 ± 0,2 mm, <100> orientowane, 525 ± 25 μm) na płytce grzewczej, aby się odwodniły.
  2. Weź jedną płytkę krzemową z płyty grzewczej, schłodzi ją do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do warstwy spin. Nałóż 3-5 ml fotorezystru na środek płytki.
  3. Aby uzyskać wysokość cech 20 μm, należy zastosować następujący protokół spinowy: spinuj przez 10 s przy 7,1 × g, a następnie spinuj o 410 × g przez 30 s. Aby uzyskać wysokość cech 30 μm, należy zastosować następujący protokół spinowy: spinuj przez 10 s przy 7,1 × g, a następnie spinuj o 170 × g przez 30 s. Użyj skalpela ostrożnie, aby usunąć wszelkie kulki krawędzi, które mogą powstać podczas powlekania wirowania.
  4. Piecz na miękko w następujący sposób: ustaw płytę grzewczą na 95 °C, pozwól płytkowi stać na płycie przez 13 minut. Wyjmij płytkę z płyty grzewcza i pozwól jej naturalnie ostygnąć do temperatury pokojowej, unikając nagłego spadku temperatury.
  5. Ustawij fotomaskę na płytkach pokrytych fotorezystancją i naświetl na światło UV z całkowitą dawką 120 mJ/cm2.
  6. Wypal po ekspozycji w następujący sposób: używając dwóch płyt grzewczych (65 °C i 95 °C), pozwól, by płytka pokryta fotorezystancją stała na płytce grzewczo 65 °C przez 1 minutę, zanim przeniesiemy ją na płytę grzewczą 95 °C i zostawimy tam na 5 minut. Przenieś płytkę na stos chusteczek mikrofibry i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
  7. Wywołaj płytkę, przenosząc ją do szalki Petriego wypełnioną PGMEA, a następnie zanurz cały wafel w wywoływaczce. Przyspiesz rozwój poprzez ręczne mieszanie.
    UWAGA: PGMEA jest łatwopalna i drażniąca oczy oraz drogi oddechowe. Utylizuj go jako "łatwopalne odpady organiczne" w dedykowanych pojemnikach.
  8. Po wywołaniu wyjmij płytkę z wywoływacza i przemyj ją izopropanolem. Jeśli w izopropanolu blisko powierzchni próbki powstaje mlecznobiały przepływ (wywołanie nie jest jeszcze zakończone), ponownie zanurz próbkę w wywoływaczu, aby zakończyć proces wywoływania. Przemyj wywołaną próbkę izopropanolem, aż w pobliżu powierzchni próbki nie powstaje mlecznobiały przepływ. Po pełnym wywołaniu wypal fotorezystor na twardo, umieszczając płytkę na płycie grzewającej 150 °C przez 15 minut.
  9. Fluoruj płytkę do następujących procesów miękkiej litografii: wystaw płytkę na działanie plazmy tlenowej pod próżnią przez 30 sekund (100 W), aby aktywować powierzchnię, a następnie umieść ją w próżniowym desykatorze. Wrzuć 30 μL trichloro(1H,1H,2H,2H,2H-tridekafluoro-n-oktyl) na szklaną szkiełkę umieszczoną wewnątrz próżniowego desykatora. Osusz osuszacz na 2 minuty i utrzymuj stan próżniowy przez 30 minut. Piecz płytkę w 90 °C przez godzinę, aby zakończyć proces silanizacji.
    UWAGA: Ściśle kontroluj wilgotność względną otoczenia poniżej 60% przez cały proces. Nadmierna wilgoć może wywołać szybką hydrolizę silanu, co powoduje powstanie białych, nielotnych wydzielin polisiloksanu. Wytrącenia zakłócą jednolitość rozkładu pary silanowej, co skutkuje niepowodzeniem silanizacji. Leczenie przeprowadzaj w okapu, ponieważ trichloro(1H,1H,2H,2H,2H-tridekafluoro-n-oktyl) silan reaguje gwałtownie z wodą, uwalniając toksyczne opary HCl. Zneutralizuj rozcieńczonym alkalicznym materiałem przed utylizacją jako fluorowane/chlorowane odpady organiczne. Proces silanizacji osiąga 90% skuteczności.

2. Fabryzacja

UWAGA: Proces miękkiej litografii użyty do wytwarzania podłoża z polidimetylosiloksanu (PDMS) można podzielić na dwa wyraźne etapy: 1) przygotowanie zarówno strukturalnej warstwy podłożnej, jak i wierzchniej, 2) łączenie dwóch warstw PDMS. Całkowita wydajność produkcji przekracza 80%.

  1. Przygotowanie do PDMS
    1. Dla warstwy podłożnej przygotuj prekursor PDMS, mieszając prepolimer i środek utwardzający w proporcji 10:1 masowo, a następnie odgazowuj w próżni. Wlej 1,5 mL prekursora PDMS (10:1) na formę SU8, pokrywając całą powierzchnię, następnie odgazuj pod próżnią i odpoczywaj przez 30 minut. Ostrożnie przenieś do piekarnika i utwardzaj w 90 °C przez godzinę. Odklej podwarstwę strukturalną PDMS od formy głównej.
    2. Do warstwy wierzchniej przygotuj prekursor PDMS, mieszając prepolimer i środek utwardzający w proporcji 30:1 wagowo-30:1 i odgazowując pod próżnią. Wylej prekursor PDMS na fluorowany płytkę krzemową. Aby uzyskać grubość 9 μm, należy zastosować następujący protokół powłoki spinowej: spinuj o 7,1 × g przez 10 s, a następnie spinuj o 2300 × g przez 60 s.
    3. Po powlekaniu spinowym sprawdź folię PDMS pod światłem otoczenia, aby sprawdzić jednolitość – szczególnie sprawdzając widoczne defekty, takie jak smugi, pęcherzyki czy nierówne nagromadzenie krawędzi. Jeśli folia wydaje się jednolita przezroczysta i ma stałe odbicie na całej powierzchni płytki, przejdź do kolejnego kroku; Jeśli nie, powtórz proces powłoki spinowej z nową płytką. Umieść płytkę powłokowaną na równej powierzchni, aby zapewnić jednorodną grubość folii PDMS. Ostrożnie przenieś do piekarnika i utwardzaj w 90 °C przez 3 godziny.
      UWAGA: Uzyskano warstwy o grubości 9,11 ± 0,34 μm.
  2. Klejenie
    1. Umieść strukturyzowaną warstwę PDMS (10:1) z wzorzystą stroną skierowaną w dół na warstwę PDMS, zapewniając dobry kontakt między dwiema warstwami bez pęcherzyków na granicy.
    2. Przenieś zespół do piekarnika i utwardzaj w 90 °C przez 3 godziny.
    3. Pozwól zespołowi ostygnąć do temperatury pokojowej na stosie mikrofibrowych tkanek. Odłącz ostatnią podwójną warstwę od płytki i przechowaj w szalce Petriego do dalszego użycia.
      UWAGA: Jeśli podczas obierania powstają pęcherzyki między warstwą wierzchnią a warstwą podnią, zazwyczaj oznacza to niepełne przyleganie między tymi warstwami. Upewnij się, że przed powłoką spinową dokładnie odgazowujesz prekursor PDMS i upewnij się, że powierzchnia folii jest wolna od kurzu lub zanieczyszczeń przed nałożeniem warstwy podłoża PDMS, aby zapewnić pełny kontakt. Upewnij się, że płytka krzemowa jest pozioma podczas powłoki spinowej, montażu i utwardzania. Rozrywanie filmu może wystąpić z powodu nierównomiernej silanizacji płytki lub niejednorodnej grubości PDMS. Aby rozwiązać problem, ściśle kontroluj wilgotność środowiskową podczas silanizacji poniżej 60% wilgotności wilgotnej. Proces silanizacji osiąga 90% skuteczności.

3. Charakterystyka

  1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    1. Przetnij próbkę ostrym ostrzem, aby uzyskać czyste krawędzie.
    2. Zamontuj próbki na stopniach SEM pod kątem 90° i 0°, używając przewodzącej taśmy węglowej, aby umożliwić odpowiednio charakterystykę przekroju i powierzchni.
    3. Próbki pokryj złotem przez 120 sekund, aby poprawić jakość obrazowania SEM i pobrać zdjęcia SEM próbek.
  2. Mikroskopia sił atomowych (AFM)
    UWAGA: Wybierz sondę ScanAsyst-Air do ilościowego mapowania nanomechanicznego modułu.
    1. Umieść końcówkę wspornika AFM w centrum pola widzenia. Umieść lokalizację lasera na samym końcu wspornika, ustawiając system dźwigni optycznej.
    2. Przed pomiarami PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PeakForce QNM), skalibruj wspornik AFM, aby określić następujące kluczowe parametry: Stała sprężynowa wspornika: 0,40135 N/m; Czułość na odchylenie: 28,993 nm/V (ustalana przez wykonanie krzywej siły na sztywnej próbce odniesienia); Promień końcówki: ~21 nm (skalibrowany metodą względną względem próbki referencyjnej o znanym module modułu).
    3. W panelu Skan na liście parametrów skanowania skonfiguruj następujące początkowe ustawienia skanowania: ustaw rozmiar skanu na 70 μm dla próbek z okresowymi paskami i odstępem 50 μm. Ustaw rozmiar skanu na 50 μm dla próbek z okresowymi paskami i odstępem 20 μm. Ustaw Samples/Line and Lines na 256 (co daje obraz 256 x 256 pikseli).
    4. Ustawienia Otwórz w mikroskopie i ustaw domyślny punkt nastawienia Maksymalnej Siły Zaangażowania w parametrach Aktywacji.
    5. Kliknij ikonę Engage na pasku narzędzi Workflow i kontynuuj monitorowanie sygnałów w czasie rzeczywistym podczas automatycznego podejścia.
    6. Upewnij się, że ScanAsyst Auto Control jest ustawione na tryb indywidualny. Dostosuj wartość nastawioną Maksymalnej Siły do odpowiedniej wartości, aby osiągnąć pożądany zakres Odkształcenia: dla warstwy górnej wartość nastawiona Maksymalnej Siły wynosi 0,020 nN; dla strukturalnej warstwy podłoża wartość PeakForce wynosi 5 nN.
    7. Rozpocznij skanowanie, klikając przyciski od góry do dołu lub od dołu do góry .
    8. Monitorowanie i korekcja krzywej siły: Jeśli krzywe siły wydają się zniekształcone lub zauważono problemy z synchronizacją (np. nieregularne kształty, niespójne linie bazowe), kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie Monitora siły i wybierz Automatyczna konfiguracja , aby automatycznie skorygować wyrównanie i czułość krzywej siły.
    9. W ustawieniach kanału obliczania modułu wybierz model DMT , aby dopasować część krzywej siły do obliczania modułu sprężystości.
    10. Kliknij przycisk przechwytu, aby pobrać i zapisać wysokorozdzielczą topografię oraz mapę właściwości nanomechanicznych.
    11. Przeprowadz analizę po akwizycji za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazu AFM. Otwórz zapisane pliki AFM i wyodrębnij wartości modułu, wybierając obszary na powierzchni próbki; Obliczaj średni moduł, odchylenie standardowe i profile rozkładu zarówno dla warstwy górnej, jak i dolnej za pomocą wbudowanych narzędzi do analizy statystycznej oprogramowania. Eksportuj mapy przetworzonego modułu i dane ilościowe.
    12. Liczba skanów AFM na próbkę: Wykonaj trzy niezależne skany pełnego obszaru dla każdej próbki. Upewnij się, że każde skanowanie obejmuje obszar odpowiadający rozmiarowi cech strukturalnych próbki: 70 μm × 70 μm dla próbek z okresowymi pasami o rozstawie 50 μm, a 50 μm × 50 μm dla tych z pasami o rozstawie 20 μm. Do pomiarów modułu struktury podstawowej (10:1 PDMS) oraz warstwy warstwy wierzchniej (30:1 PDMS) należy zastosować następującą strategię próbkowania, aby zapewnić wiarygodność danych.
      1. Folia na górnej warstwie (30:1 PDMS): niezależnie mierzyć moduł 2x, przy czym każdy pomiar składa się z dwóch nienakładających się skanów o rozdzielczości 5 μm × 5 μm.
      2. Struktura podstawowa (10:1 PDMS): Biorąc pod uwagę dwie odrębne konfiguracje okresowych pasków (20 μm i 50 μm), moduł modułu mierzy się 2x niezależnie dla każdej konfiguracji.

4. Eksperyment z hodowlą komórek in vitro

UWAGA: PDMS to materiał hydrofobowy, który musi być powlekany, aby wspierać przyczepność komórek przed hodowlą, a odpowiednią metodę powlekania należy dobrać zgodnie z typem komórki. Etyczne zatwierdzenie musi zostać uzyskane, jeśli komórki pierwotne są wykorzystywane do eksperymentu komórkowego.

  1. Powłoka z poli-D-lizyny (PDL)
    1. Sterylizuj podłoże przez zanurzenie w alkoholu przez 10 minut; potem pranie przez 3 x 5 minut z PBS.
    2. Rozpuszczaj PDL (masa cząsteczkowa 150 000 do 300 000 Da) przy użyciu PBS w stężeniu 0,1 mg/mL. Dla podłoża o rozmiarze 24 dołków dodaj 1 ml roztworu roboczego PDL i umieść go w inkubatorze 37 °C na 4 godziny, aby całkowicie pokryć powierzchnię podłoża.
    3. Po zakończeniu powłoki usuń roztwór roboczy PDL i usuń wszelkie pozostałości PDL, myjąc 3 razy PBS. Wykorzystaj podłoże do kolejnych eksperymentów komórkowych. Jeśli powłoka nie zostanie użyta od razu, wysusz ją i przechowuj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Udana powłoka wykazała jednorodną, pozbawioną cech powierzchnię pod mikroskopią fazowo-kontrastową, bez widocznych krystalicznych opadów ani artefaktów wysychających. Podłoża wykazujące jakiekolwiek oznaki krystalizacji lub niejednorodnej powłoki zostały odrzucone.
  2. Izolacja i hodowla pierwotnych komórek stromalnych szpiku kostnego myszy (mBMSC)
    1. Izoluj pierwotne komórki stromalne szpiku kostnego myszy (mBMSC) z kości piszczelowej i udowej myszy.
    2. Hodować komórki w pożywce wzrostowej składającej się z α-MEM uzupełnionego 10% surowicą płodową bydła (FBS), 1% antymikotykiem antymykotycznym i 1% pirogrowinianem sodu.
    3. Komórki nasienne w przejściu 3 na podłoża uzyskane w kroku 4.1.3 z gęstością 5 000 komórek/cm2 , aby zminimalizować potencjalne efekty zakłócające kontaktu z komórkami.
  3. Barwienie i obrazowanie immunofluorescencyjne
    1. Po 16 godzinach hodowli (37 °C, 5%CO2) utrwal komórki 4% paradehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemyj 3 razy PBS. Następnie przepuszczaj komórki 0,1% Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyj 3 razy PBS.
    2. Dla wizualizacji cytoszkieletu barw F-aktynę falloidyną (rozcieńczenie 1:500) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie myj 3 razy odpowiednią ilością PBS, aby usunąć resztki barwnika.
    3. Zamontuj podłoże z jednoczesnym barwieniem jąder komórkowych. Nałóż kroplę gliceryny z DAPI, aby pokryć komórki. Następnie ostrożnie nałóż pokrywkę na podłoże i zabezpiecz marginesy lakierem do paznokci. Unikaj bąbelków tak bardzo, jak to możliwe.
    4. Wykonaj obrazy fluorescencyjne rejestrujące morfologię komórkową i pozycjonowanie jąder za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotolitografia była wykorzystywana do tworzenia wielokrotnego użytku krzemowych form głównych z równoległymi mikrostrukturami z rowkami i równoległymi. Stworzono dwa wzory, o szerokości rowka (szerokość rowka jest identyczna z szerokością rowka) odpowiednio 20 i 50 μm. Każdy wzór obszaru miał wymiary 7 mm × 7 mm. Precyzja i możliwość ponownego użytku form krzemowych znacznie uprościły proces powtarzalnej produkcji podłoża. Następnie forma główna została użyta do odtworzenia mikrostruktur w PDMS. Twarda formuła PDMS zosta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście do zaprojektowania podłoża opartego na dwuwarstwowym PDMS, zaprojektowanego do wprowadzania lokalnych zmian sztywności przy zachowaniu topograficznie jednolitej, pozbawionej cech powierzchni. To podejście pozwala na modulację mechaniczną wyłącznie poprzez zmiany geometrii podstruktury, przy jednoczesnym zachowaniu spójnej chemii powierzchni i topografii. W konsekwencji skutecznie oddziela sygnał sztywności od innych sygnałów fizycznych i chemicznych, oferując biologiczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało finansowo wsparte przez Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Uniwersytetów Chin (nr 2042024YXB018 dla W. Ji).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  4% paraformaldehyduTechnologia ServicebioG1101
AcetonSzanghajski Aladyn10000418
AntyantyGibco15240-062Antybiotyk przeciwmykotyczny
Medium montażowe antyfade z DAPIBeyotime BiotechnologyP0131gliceryna z DAPI 
Płytka hodowla komórkowaGNIAZDO70200124 studnie
EksykatorzeSichuan Shubo (Group) Co.,Ltd913354-30SNŚrednica wewnętrzna=180 mm
Serum bydlęce płodoweHyCloneSV30208.02
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOlympusDP74
IzopropanolSzanghajski Aladyn80109218GC≥ 99.7%
Nakładka do maskiSyczuan Nanguang Vacuum Technology Co.,LtdH94-37
Modyfikacja MEM AlphaHyCloneSH30265.01
Analiza nanoskopowaBrukerWersja 3.0Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu AFM.
System obrazowania wysokiej treści Opera Phenix PlusPerkin Elmer2400L23248 Wyposażony w 10x air objective
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co.,Ltd171011-1Fotorezystyk wywoływaczy negatywny; SPECYFIKACJA: UL; Procent:min99,7%
FalloidynaUelandy YP0052L594-Falloidyna
Roztwór soli buforowanej fosforanemHyCloneSH30256.01
Oczyszczacz plazmowyTechnologia plazmowa (Niemcy)Flecto 10 
Poli-D-lizynaBeyotime BiotechnologyST508Numer CAS 27964-99-4
Mikroskop sondowy skanującyBrukerIkona WymiaruWykorzystuje oprogramowanie sterujące nanoskosami, w tym eksperymentalne przestrzenie robocze PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) oraz Point-and-Shoot Ramping.
Końcówka krzemu na dźwigni azotkuBrukerSCANASYST-AIRSonda posiada pojedynczą, literę V powspornikową powsporniczkę pokrytą refleksem Al; k= 0,4 N/m (nominalnie), f0 = 70 kHz.
Płytki krzemoweShenzhen Rigorous Technology Co.,Ltd-50.8± 0,3 mm średnicy, (100) zorientowany, 525 i plusmn; 25 μ m grubości
Pirowęglan soduGibco11360-070
Preparat do powłaczania rotacyjnegoInstytut Mikroelektroniki Chińskiej Akademii NaukKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co.,Ltd-Fotorezystyk ujemny; 72,3% stałe; Lepkość 4400; Gęstość 1,143g/ml
Zestaw silikonowy SYLGARD 184Firma Dow Chemical Company01673921
Trichloro(1H,1H,2H,2H,2H-tridekafluoro-n-oktyl) silanSzanghajski Aladyn78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1% Triton X-100 do permeabilizacji
Trypsin-EDTAGibco25200-0720,25% trypsyna-EDTA (1x)
Piekarnik próżniowyMemmert (Niemcy)  VO 200 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Deymier, A. C., et al. Micro-mechanical properties of the tendon-to-bone attachment. Acta Biomater. 56, 25-35 (2017).
  6. Wang, Z., et al. Multi-omics investigations revealed underlying molecular mechanisms associated with tumor stiffness and identified sunitinib as a potential therapy for reducing stiffness in pituitary adenomas. Front Cell Dev Biol. 10, 820562(2022).
  7. Stylianou, A., Voutouri, C., Mpekris, F., Stylianopoulos, T. Pancreatic cancer presents distinct nanomechanical properties during progression. Ann Biomed Eng. 51 (7), 1602-1615 (2023).
  8. Cambria, E., et al. Linking cell mechanical memory and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 24 (3), 216-228 (2024).
  9. Mittelheisser, V., et al. Evidence and therapeutic implications of biomechanically regulated immunosurveillance in cancer and other diseases. Nat Nanotechnol. 19 (3), 281-297 (2024).
  10. Sridharan, R., Cavanagh, B., Cameron, A. R., Kelly, D. J., O'Brien, F. J. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 89, 47-59 (2019).
  11. Yi, B., Xu, Q., Liu, W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration. Bioact Mater. 15, 82-102 (2022).
  12. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys J. 86 (1), 617-628 (2004).
  13. Song, Y., et al. Biphasic regulation of epigenetic state by matrix stiffness during cell reprogramming. Sci Adv. 10 (7), eadk0639(2024).
  14. Taufalele, P. V., et al. Matrix stiffness enhances cancer-macrophage interactions and M2-like macrophage accumulation in the breast tumor microenvironment. Acta Biomater. 163, 365-377 (2023).
  15. Xie, J., Bao, M., Hu, X., Koopman, W. J. H., Huck, W. T. S. Energy expenditure during cell spreading influences the cellular response to matrix stiffness. Biomaterials. 267, 120494(2021).
  16. Wu, B., et al. Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth. Nat Cell Biol. 25 (3), 415-424 (2023).
  17. Driscoll, T. P., et al. Integrin-based mechanosensing through conformational deformation. Biophys J. 120 (20), 4349-4359 (2021).
  18. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), 9(2012).
  19. Soliman, B. G., et al. Droplet-based microfluidics for engineering shape-controlled hydrogels with stiffness gradient. Biofabrication. 16 (4), 045026(2024).
  20. Kosmidis Papadimitriou, A., et al. Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics. Biofabrication. 16 (2), 025023(2024).
  21. Isomursu, A., et al. Directed cell migration towards softer environments. Nat Mater. 21 (9), 1081-1090 (2022).
  22. Xia, J., et al. Regulation of cell attachment, spreading, and migration by hydrogel substrates with independently tunable mesh size. Acta Biomater. 141, 178-189 (2022).
  23. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  24. Li, X., et al. 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers. 8, 269(2016).
  25. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical regulation of cell behavior-cross talk between substrate stiffness and nanotopography. Engineering. 3 (1), 36-54 (2017).
  26. Lee, S., Hong, J., Lee, J. Cell motility regulation on a stepped micro pillar array device (SMPAD) with a discrete stiffness gradient. Soft Matter. 12 (8), 2325-2333 (2016).
  27. Hong, J., Lee, S., Park, S., Lee, J. Micro checkerboard patterned polymeric surface with discrete rigidity for studying cell migration. J Micromech Microeng. 25 (4), 045012(2015).
  28. Mostert, D., Van Der Putten, C., Sahlgren, C. M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Bioengineering structural anisotropy in living tissues. Nat Rev Bioeng. 3 (9), 727-741 (2025).
  29. Khuu, N., Kheiri, S., Kumacheva, E. Structurally anisotropic hydrogels for tissue engineering. Trends Chem. 3 (12), 1002-1026 (2021).
  30. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys: Condens Matter. 22 (19), 194116(2010).
  31. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  32. Leong, P. L., Morgan, E. F. Measurement of fracture callus material properties via nanoindentation. Acta Biomater. 4 (5), 1569-1575 (2008).
  33. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomater. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  34. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J Appl Polym Sci. 131 (22), 41050(2014).
  35. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  36. Wang, D., et al. A novel approach for PDMS thin films production towards application as substrate for flexible biosensors. Mater Lett. 221, 228-231 (2018).
  37. Tonin, M., Descharmes, N., Houdré, R. Hybrid PDMS/glass microfluidics for high resolution imaging and application to sub-wavelength particle trapping. Lab Chip. 16 (3), 465-470 (2016).
  38. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  39. Psarski, M., et al. Hydrophobization of epoxy nanocomposite surface with 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane for superhydrophobic properties. Cent Eur J Phys. 10 (5), 1197-1201 (2012).
  40. Pham, J. T., Xue, L., Del Campo, A., Salierno, M. Guiding cell migration with microscale stiffness patterns and undulated surfaces. Acta Biomater. 38, 106-115 (2016).
  41. Miranda, I., et al. Properties and applications of PDMS for biomedical engineering: a review. J Funct Biomater. 13, 2(2022).
  42. Zhang, W., Choi, D. S., Nguyen, Y. H., Chang, J., Qin, L. Studying cancer stem cell dynamics on PDMS surfaces for microfluidics device design. Sci Rep. 3 (1), 2332(2013).
  43. Toworfe, G. K., Composto, R. J., Adams, C. S., Shapiro, I. M., Ducheyne, P. Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function. J Biomed Mater Res A. 71 (3), 449-461 (2004).
  44. Wang, L., Sun, B., Ziemer, K. S., Barabino, G. A., Carrier, R. L. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane) surfaces affect adhesion of Caco-2 cells. J Biomed Mater Res A. 93 (4), 1260-1271 (2010).
  45. Lu, M., Ding, L., Zhong, T., Dai, Z. Improving hydrophilicity and adhesion of PDMS through dopamine modification assisted by carbon dioxide plasma. Coatings. 13, 126(2023).
  46. Jiang, B., Guo, H., Chen, D., Zhou, M. Microscale investigation on the wettability and bonding mechanism of oxygen plasma-treated PDMS microfluidic chip. Appl Surf Sci. 574, 151704(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pod o a do mikrowytwarzaniakom rki zr bowe szpiku kostnegopod o e z PDMSmikrostruktury w formie rowk w i grzbiet wskaningowa mikroskopia si atomowychskaningowa mikroskopia elektronowamechanotransdukcja kom rkowamodu y spr ysto ci

Powiązane artykuły