Method Article

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy łzowe są kluczowe dla stabilności filmu łzowego i zdrowia powierzchni oka. Zmiany w składzie łez mogą być związane z chorobami oczu i ogólnoustrojowymi, takimi jak dysfunkcja gruczołów Meiboma i dyslipidemia. Profilowanie lipidów łzowych może pomóc w odkrywaniu biomarkerów w diagnostyce i leczeniu chorób. Jednak powszechne metody pobierania łez mają wyraźne ograniczenia: paski Schirmera często powodują podrażnienia i dyskomfort oczu ze względu na duży kontakt z powierzchnią oka, podczas gdy pobieranie mikronaczyń z mikrokapilar może powodować niską powtarzalność ze względu na zmienność operatora, zwłaszcza gdy wykonuje się to przez różne osoby. Te ograniczenia mogą ograniczyć dokładność i spójność danych lipidomicznych. Badanie to wprowadza minimalnie inwazyjną metodę pobierania próbek opartą na fenolowej czerwonej nici (PRT) zoptymalizowaną pod kątem lipidomiki łz. Cienka struktura PRT minimalizuje ryzyko podrażnień oczu i umożliwia szybkie oraz delikatne zbieranie łez. Ta przyjazna dla użytkownika i łatwa w wykonaniu metoda jest odpowiednia dla osób o zmniejszonej objętości łez lub niższej tolerancji na odczucia ciała obcego, a także umożliwia bardziej powtarzalne pobieranie próbek poprzez zmniejszenie zmienności zależnej od operatora. Lipidy łzowe zebrane przez PRT zostały wyekstrahowane za pomocą zoptymalizowanego protokołu separacji fazowej metanol/metyl tert-butyl (MTBE) i przeanalizowane za pomocą wysokorozdzielczego LC-Orbitrap-IQX MS/MS za pomocą oprogramowania LipidSearch. Workflow zidentyfikował ponad 700 unikalnych gatunków lipidów łzowych, z których każdy charakteryzuje się specyficznymi jonami produktów pochodzącymi z kwasów tłuszczowych. Wyniki te wskazują, że próbkowanie oparte na PRT zapewnia solidne odzyskiwanie lipidów do analizy lipidomicznej łz. To minimalnie inwazyjne i powtarzalne podejście stanowi praktyczną platformę dla klinicznych i eksperymentalnych badań nad lipidami łzowymi. Ostatecznie może to również ułatwić odkrywanie biomarkerów i monitorowanie chorób.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona łzawiąca jest najbardziej zewnętrzną barierą chroniącą powierzchnię oka przed patogenami i utrzymującą homeostazę ocznu 1,2, natomiast warstwa lipidowa w warstwie łzowej jest kluczowym elementem zapobiegającym parowaniu łez i utrzymującym stabilność błony łzowej 3,4. Zaburzenia w składzie lipidów łzowych zostały powiązane z różnymi chorobami oczu, w tym suchością oka (DED), dysfunkcją gruczołów Meiboma (MGD) oraz alergicznym zapaleniem spojówek 5,6,7,8. W rezultacie szczegółowa charakterystyka lipidomiki łzowej stała się kluczowym i trendowym kierunkiem badań dla bardziej kompleksowego zrozumienia molekularnych patologii leżących u podstaw tych schorzeń ocznych9.

Chociaż podejście lipidomiczne łzowe ma duże znaczenie kliniczne, kluczowym wyzwaniem w lipidomice łez jest ustanowienie ustandaryzowanego, powtarzalnego procesu zbierania i analizy. Obecne metody pobierania próbek łez, paski Schirmera i mikrokapilarna rurka, każda z nich mają swoje specyficzne ograniczenia. Paski Schirmera mają dużą powierzchnię kontaktu z powierzchnią oka, co często powoduje podrażnienie oczu i pęknięcia odruchowe 9,10. Dla porównania, pobieranie mikrocelarnych rurek jest silnie zależne od techniki operatora i może dawać niespójne wyniki, gdy wykonuje się to przez różne osoby11. Dodatkowo, niewłaściwe użycie tych narzędzi do pobierania próbek może również wiązać się z ryzykiem uszkodzenia powierzchni oka. Te ograniczenia mogą zagrozić dokładności i powtarzalności danych w dalszej części 12,13. Ponadto metody pobierania łez wymagające skomplikowanych procedur obsługi mogą ograniczać ich dostępność i standaryzację w różnych laboratoriach i placówkach klinicznych. Dlatego pilnie potrzebne jest ustanowienie nieinwazyjnego, solidnego i powtarzalnego procesu zbierania i przetwarzania łez, który pozwoli zachować natywny profil lipidowy łz.

Najnowsze badania podkreśliły przydatność fenolowej czerwonej nici (PRT) w dalszych analizach procesów LC-MS/MS w zastosowaniach proteomicznych i metabolomicznych 14,15. PRT oferuje wrodzone zalety jako narzędzie do zbierania łez. Jego cienka struktura, minimalnie inwazyjny charakter oraz prosta procedura próbkowania mogły minimalizować złożoność techniczną i zmniejszać zmienność zależną od operatora, jednocześnie będąc dobrze tolerowanym przez większość uczestników14,16. Jednak ustandaryzowany sposób pracy specyficzny dla analizy lipidomii łez opartej na PRT nie został jeszcze ustalony.

Protokół ten wprowadza zintegrowany workflow dla powtarzalnej lipidomiki łz: przyjazną użytkownikowi metodę zbierania łez opartą na PRT, dostosowaną do analizy lipidów, zoptymalizowany protokół ekstrakcji lipidów z eteru metylowego tert-butylowego (MTBE)/metanolu z określonymi stosunkami rozpuszczalnika do próbki i kontrolami przechowywania17,18, oraz zmodyfikowaną metodę identyfikacji lipidów wykorzystującą wysokorozdzielczość LC-MS/MS. To standaryzowane podejście umożliwia spójne profilowanie lipidomiczne łz, umożliwiające dalsze odkrywanie biomarkerów i charakteryzację chorób. Ponadto jest szczególnie dobrze dopasowany do osób o niskiej objętości łez lub obniżonej tolerancji na odczucia ciała obcego (Rysunek 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd workflow oparty na Phenol Red Thread (PRT) dla lipidomiki łez u ludzi. Płyn łzowy jest pobierany od osób stosujących podejście PRT, co umożliwia regularne pobieranie próbek przy minimalnym dyskomfortie. Przetwarzanie próbek obejmuje sekwencyjną ekstrakcję dwufazową MTBE/metanolu, stężenie pośredniczone metodą SpeedVac oraz rekonstrukcję ekstraktów lipidowych łzowych do chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Profile lipidomiczne są następnie pozyskiwane za pomocą LC-MS/MS i poddawane adnotacjom oraz identyfikacji za pomocą oprogramowania LipidSearch. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) Hongkońskiego Politechnika. Uczestnicy udzielili pisemnej świadomej zgody przed udziałem w badaniu. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zbieranie ludzkiego płynu łzowego na bazie fenolowej czerwonej nici (PRT)

  1. Noś rękawiczki i dezynfekuj stanowisko pracy, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.
  2. Upewnij się, że paczka PRT jest zapieczętowana i nie jest przeterminowana, zanim ją otworzysz.
  3. Trzymaj nić za koniec naprzeciwko zgiętego haczyka. Zawsze unikaj dotykania wygiętej części PRT.
  4. Poproś badanego, aby spojrzał na górny kierunek nosa.
  5. Delikatnie opuścić dolną powiekę badanego i włóż PRT z wygiętym hakiem umieszczonym w dolnej spojówce skroniowej podbródkowej, blisko zewnętrznej kantusa oka badanego (Rysunek 2).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Pozycja czerwonej nici fenolowej podczas zbierania łz. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Poproś badanego, aby delikatnie zamknął oczy i lekko pochylił głowę do przodu, aby zapobiec dotykowi skóry twarzy przez PRT.
    UWAGA: Wchłonięta łza stopniowo indukuje czerwony front barwnikowy, wskazujący na próbkowany obszar PRT ze względu na pH-wrażliwą czerwień fenolową. Aby zapewnić wystarczającą ilość płynu łzowego do analizy lipidomicznej, zaleca się pobranie objętości łzowej równoważnej 50 mm PRT, zazwyczaj zakończonej w ciągu 2 minut.
  2. Delikatnie opuszczaj dolną powiekę badanego i wyciągnij próbkowany PRT. Unikaj dotykania obszaru próbkowania.
  3. Zapisz długość pobranego obszaru PRT i przenieś PRT do nowej probówki za pomocą sterylnych kleszczy.
    UWAGA: Jeśli długość próbkowanego PRT wynosi <50 mm, prosimy o odpoczynek przez 1-3 minuty i powtórzenie pobierania tym samym okiem. Przenieś każdą próbkę PRT do osobnej probówki.
  4. Odpowiednio oznacz i zakręć probówki.
  5. Dokładnie wyczyść rękawiczki i kleszcze metanolem oraz czyste papierowe chusteczki, aby usunąć resztki łez lub zanieczyszczenia, a następnie pozwól im wyschnąć.
  6. Powtórz kroki 1.2-1.10 dla drugiego oka.
  7. Zamknąć probówki parafilmem i natychmiast przechować ją w temperaturze -20°C do tymczasowego przechowywania lub -80°C do przechowywania długoterminowego. Unikaj niepotrzebnych cykli zamrożenia i rozmrażania oraz chroń próbkowany PRT przed światłem.

2. Przetwarzanie próbkowanego PRT

  1. Przed obróbką PRT umyć mikronożyczki metanolem.
  2. Usuń wygięty koniec haka (czyli pierwsze 3 mm) PRT (rysunek 3).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Wygląd fizyczny nici fenolowej (PRT). (A) Nieużywany PRT z wygiętym końcem haczyka. (B) Użyto PRT z przeciętym wyznaczonym fragmentem i pobranym do ekstrakcji lipidów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Pokrój próbkowany obszar PRT (czyli obszar powyżej przedniej części barwnika fenolowego) na kawałki o grubości 2 mm i przełóż je do czystej mikrowirówki o pojemności 1,5 mL odpornej na rozpuszczalnik organicznej.

3. Dwufazowa separacja MTBE/metanol do ekstrakcji lipidów z pobranego PRT

UWAGA: MTBE i metanol są łatwopalne i lotne. Używaj w dobrze wentylowanym miejscu lub w okapie wyparowym. Unikaj otwartych płomieni i iskier. Noś rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Myj ręce po dotyku.

  1. Umieść próbki w lodzie.
  2. Do każdej próbki i wiru dodaj 232 μL metanolu lodowatego (klasy MS) przez 15 sekund.
  3. Sonikuj próbki w wstępnie schłodzonym ultradźwiękowym czystku przez 15 minut.
  4. Do każdej próbki i wiru należy dodać 774 μL MTBE (klasy HPLC) oraz 194 μL wody dejonizowanej do każdej próbki i wiru na 15 sekund. Uzyskany stosunek objętości MTBE:metanol:woda w próbce powinien wynosić 4:1,2:1 (v/v/v).
  5. Ponownie sonikatuj próbki w wstępnie schłodzonej ultradźwiękowej czystce przez 15 minut.
  6. Inkubuj próbkę w termomieszaczu przez 8 godzin w temperaturze 4 °C, z potrząsaniem z prędkością 1200 obr./min.
  7. Pozwól mieszance stać w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Wiruj powstałe mieszaniny w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Po wirowaniu mieszaniny są rozdzielane na dwie fazy (rysunek 4).
    UWAGA: Po zakończeniu separacji fazowej zbadaj próbkę pod kątem dwóch odrębnych warstw: górna faza organiczna (bogata w MTBE) powinna wyglądać na przezroczystą z lekką mleczną nieprzezroczystością, natomiast dolna faza wodna wykazuje żółte zabarwienie wynikające z obecności wskaźnika fenolu czerwonego. Kontynuuj tylko wtedy, gdy te charakterystyki fazowe są zaobserwowane, jak pokazano na Rysunku 4.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Separacja fazowa ekstrakcji lipidów z użyciem MTBE-metanol-wody: górna faza organiczna i dolna faza wodna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Ostrożnie pobrać 700 μL górnej frakcji organicznej zawierającej lipidy i przenieść ją do schłodzonej nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
  2. Niższą fazę wodną zawierającą pozostałości MTBE i metanolu należy odrzucić jako niebezpieczne odpady chemiczne. Zbieraj odpady w oznaczonych, szczelnie zamkniętych pojemnikach i utylizuj je zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych oraz lokalnymi przepisami. Nie wlewaj rozpuszczalników do odpływu.
  3. Susz ekstrakty lipidowe za pomocą chłodzonego koncentratora SpeedVac przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby zapewnić całkowite wyschnięcie, okresowo sprawdzaj suchość próbki od 2 godzin. Przedłuż czas schnięcia w miarę potrzeby, aż próbki całkowicie wyschną.
  4. Przechowuj suszone ekstrakty lipidowe w temperaturze -20 °C do przechowywania krótkoterminowego lub w -80 °C do przechowywania długoterminowego.

4. Rekonstrukcja wyodrębnionego lipidu łzowego do analizy LC-MS/MS

  1. Suszone ekstrakty lipidowe rekonfunduj 50 μL zimnej mieszaniny metanolu (MS) i chloroformu (HPLC) jako rozpuszczalnika (1:1, v/v) jako rozpuszczalnika (1 μL rozpuszczalnika na 1 mm użytego PRT), a następnie sonifikuj w schłodzonym ultradźwiękowym czyszczadle przez 15 minut.
  2. Wirówka odtworzonych ekstraktów lipidowych w dawce 14 000 × g i 4 °C przez 10 minut.
  3. Ostrożnie przelej 40 μL supernatantu do szklanej fiolki z autosamplerem z zamontowaną szklaną wkładką.
  4. Szczelnie zakręć fiolkę bezszczelinową przegrodą otwartą i przygotować do analizy LC-MS/MS.

5. Pozyskiwanie próbek przez LC-MS/MS

  1. W chromatografii cieczowej ustaw temperaturę komory kolumny i próbki odpowiednio na 50 °C i 4 °C.
  2. Przy każdym wstrzyknięciu załaduj 5 μL próbki na kolumnę LC w fazie odwrotnej (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) i frakcjonuj lipidy z przepływem 0,3 mL/min w 24-minutowym gradiencie separacji.
    1. Stosuj fazę mobilną A składającą się z mieszaniny acetonitrylu (klasa MS) w stosunku 60:40: wody (v/v) z 5 mM formiatu amonu (klasa MS) i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego (klasa MS) oraz fazy mobilnej B zawierającej izopropanol 90:10 (klasa MS):acetonitrylu (v/v) z 5 mM formiatu amonu i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego.
    2. Użyj następującego gradientu: 0-2 min: 40% B; 2-2,5 min: 40% B; 2,5-3 min: 58% B; 3-18 min: 99% B; 18-20 min: 99% B; 20-20,1 min: 40% B; 20,1-24 min: 40% B.
  3. W spektrometrze mas Orbitrap ustaw napięcie natryskowe na +3,5 kV dla trybu dodatniego lub -2,5 kV dla trybu ujemnego.
  4. Sreguluj przepływ gazu w otoczce do 45 Arb, a przepływ gazu pomocniczego do 10 Arb.
  5. Ustaw przepływ gazu zamiatającego na 2 Arb.
  6. Ustaw temperaturę rurki przenoszącej jony na 300 °C, a temperaturę waporyzatora na 320 °C.
  7. Użyj trybu pozyskiwania danych zależnego od danych (DDA).
  8. Dla MS1 ustaw rozdzielczość na 120 000, zakres skanowania na 100-2000 m/z, standardowy cel AGC, czas automatycznego wtrysku, dynamiczne wykluczenie na 6 s, a próg intensywności na 5,0e4.
  9. Dla MS2 ustaw rozdzielczość na 15 000, zakres automatycznego skanowania, standardowy cel AGC, czas wtrysku dynamicznego, okno izolacji przy 1,6 m/z, typ energii zderzenia jako dysocjacja kolizyjna o wyższej energii (HCD) oraz znormalizowaną energię kolizji (NCE) do wartości stopniowych 15, 30 i 40.
  10. Analizuj surowe dane za pomocą oprogramowania LipidSearch lub innych kompatybilnych platform.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobrano próbki łez złożone od 16 zdrowych ochotników podczas trzech niezależnych wizyt w odstępie dwóch tygodni (R1, najstarsza partia; R2, R3 pobierane kolejno dwa tygodnie po każdej). Korzystając z LipidSearch z rygorystycznymi kryteriami (tj. stosunek sygnału do szumu ≥100, stopień C lub wyższy oraz intensywność jonów ≥30 000), zidentyfikowaliśmy odpowiednio 773, 890 i 1 025 unikalnych gatunków lipidowych w R1-R3 (Rysunek 5A). Dodatni tryb jonów zidentyfikował 1 302 gatunki lipidów z 26,0...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zalety pobierania łez i ekstrakcji lipidów na bazie PRT
Workflow lipidomics łez oparty na PRT przedstawiony tutaj zapewnia minimalnie inwazyjną i praktyczną metodę pobierania próbek do kompleksowego profilowania lipidów łz. W porównaniu z paskami Schirmera, które wymagają długotrwałego kontaktu i większych objętości próbek, próbkowanie PRT jest szybkie, można wykonać w ciągu 2 minut, jest dobrze tolerowane przez różne populacje, w tym te o zmniejszonej objętości łez lub zwiększonej czułości oczu, a ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez inicjatywę InnoHK oraz rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu oraz Centrum Badawcze SHARP Vision na Hongkońskim Uniwersytecie Politechnicznym. Autorzy z wdzięcznością dziękują również za wsparcie techniczne ze strony University Research Facility in Chemical and Environmental Analysis (UCEA) oraz University Research Facility in Life Sciences (ULS) Hongkońskiego Politechniki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitryl (ACN), stopień LC-MSRCI LabscanLM1005
ACQUITY UPLC CSH C18 KolumnaWaters Corporation186005297130 & Aring;, 1,7 & mikro; m, 2,1 mm x 100 mm
Format amonowy, klasa LC-MSSigma-Aldrich55674
Szklana fiolka z automatycznym próbkowaniemWell Rich Scientific2ML-9-V10022 mL przezroczystego szkła 12*32mm płaska podstawa 9-425 fiolki z gwintem śrubowym i etykietą (Z podkładką do pisania)
Niebieska 9-425 otwarta żebrowana śruba i nakrętka;Well Rich Scientific9-SP1003z 9mm, białym PTFE/czerwonym silikonowym septą 1mm
Chloroform, klasa HPLCReagenty Duksan1271
Elektrony Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mLEppendorf30120086
Kwas mrówkowy (FA) i Klasa LC-MSThermoFisher ScientificA117-50
Szklana mikro-wkładkaWell Rich Scientific2ML-N2002250 &mikro; Wkładka L, przezroczyste szkło, stożkowa podstawa z polisprężyną, rozmiar: 5,8*28,5 mm
Izopropanol, klasa LC-MSRCI LabscanLM1162
Oprogramowanie LipidSearchThermoFisher ScientificOPTON-30879Wersja 5
Metanol,  Klasa LC-MSRCI LabscanLM1115
Nić fenolowa czerwona   (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Chłodzenie w wirówceThermoFisher Scientific75007200
Chłodnicze koncentratory odśrodkowe CentriVap i chłodnice CentriVapLabconco16108335
Mikrorurki z nakrętkąThermoFisher Scientific3488
Tert-butylowy eter metylowy (MTBE), stopień HPLCReagenty Duksan1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Ultradźwiękowy środek do czyszczeniaCrest UltrasonicP500D-45
Vortex MixerBenchmarkBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles