Ten protokół pokazuje wstrzyknięcie do żyły skroniowej w celu dostarczenia dożylnego komórek raka u dzieci noworodkom myszy, umożliwiając precyzyjne, możliwe do powtórzenia modelowanie wczesnych reakcji immunologicznych przeciwko rakiem. Metoda ta umożliwia ocenę wpływu interwencji, takich jak immunomodulacja czy terapia, kiedy są one zastosowane w okresie noworodkowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model noworodka dożylnego przeszczepu do oceny działań odpornościowych we wczesnym okresie życia przeciwko komórkom nowotworowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Więcej niż połowa wszystkich pediatrycznych nowotworów zaczyna się w macicy, a progresja choroby przetrwa przez okres noworodkowy. Chociaż immunoterapie oferują teraz nowe opcje leczenia dla wielu dzieci z rakiem, jak wczesne życie odporności wpływa na progresję raka i reakcję na terapię, pozostaje niedokładnie zrozumiane. Wypełnienie tej luki będzie wymagało oceny interwencji terapeutycznych w okresie noworodkowym, kiedy reakcje odpornościowe różnią się zasadniczo od tych w późniejszym dzieciństwie i dorosłości.
Tutaj opisujemy model transplantacji noworodkowej, który integruje się z bioluminescencyjnym obrazowaniem in vivo, aby zbadać wpływ wczesnego życia modulacji odporności na pediatryczne nowotwory.
Wstrzyknięcie do żyły szyjnej komórek z znacznikiem lucyferazy pochodzących z dwóch nowotworów rozpoczętych w macicy osiągnęło powtarzalne wszczepienie guza u 1–2-dniowych syngeneicznych odbiorców, bez zgonów związanych z zabiegiem i wysokie powodzenie procedury, jak potwierdzono przez bioluminescencyjne obrazowanie. Wykorzystując modulację odporności napędzaną infekcją jako zmienną eksperymentalną, pokazujemy następnie, że infekcja dootrzewnowa mysiej cytomegalowirusem pięć dni po przeszczepie powoduje znaczne zmniejszenie obciążenia ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL), ale nie neuroblastoma (NB). Ta platforma umożliwia badanie różnic specyficznych dla raka w odpowiedzi na wczesne życie modulację odporności i podkreśla znaczenie kontekstu guza podczas modelowania interakcji odporność-rak we wczesnym życiu.
W sumie, ta metodologia zapewnia wszechstronną i wysoce powtarzalną platformę do badania mechanizmów odpornościowych noworodkowych, istotnych dla immunosurylei raka, modulacji odporności napędzanej infekcją i interwencji terapeutycznej. Poza ALL i NB, to podejście może być dostosowane do dodatkowych pediatrycznych nowotworów złośliwych i strategii immunomodulacyjnych, wspierając badania mechanizmowe i oceny przedkliniczne wczesnych życiowych interwencji przeciwnowotworowych.
Wprowadzenie
Ostatnie osiągnięcia w immunoterapii znacznie poprawiły wyniki u niektórych pacjentów z rakiem, jednakże ich optymalne zastosowanie u małych dzieci wymaga dokładnego zrozumienia, w jaki sposób rozwijający się układ odpornościowy identyfikuje i niszczy komórki rakowe. Podczas gdy około 50% dziecięcych nowotworów powstaje w macicy, w tym ostra białaczka limfoblastyczna komórek B (B-ALL) i neuroblastoma (NB), rosnące dowody sugerują, że wydarzenia powłodowe krytycznie wpływają na ewolucję choroby i wyniki kliniczne1,2.
Odpowiedzi immunologiczne noworodków różnią się ilościowo i jakościowo od tych u dorosłych3. W przypadku braku w pełni rozwiniętej adaptacyjnej odporności, ochrona noworodków polega w dużej mierze na przeciwciałach matczynych i komórkach immunologicznych wrodzonych. Te wrodzone efektory są jednak funkcjonalnie mniej skuteczne niż ich odpowiedniki u dorosłych ze względu na komórkową hiporeaktywność i zwiększone aktywowanie ścieżek immunosupresyjnych, co sprawia, że noworodki są szczególnie podatne na infekcje4,5,6. Jednakże wpływ tych cech na zdolność niedojrzałego układu odpornościowego do wywołania skutecznych odpowiedzi przeciwnowotworowych jest słabo zrozumiały.
Modelowanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej we wczesnym życiu wymaga precyzyjnego i powtarzalnego podawania komórek nowotworowych i modulatorów odporności lub patogenów w krótkim oknie powłokowym, kiedy funkcja immunologiczna jest ograniczona. Wstrzyknięcie do żyły skroniowej jest metodą noworodkowego dożylnego (IV) podawania, która najlepiej spełnia te wymagania i oferuje wysoką skuteczność procedury, niską śmiertelność, minimalny stres związany z manipulacją i zgodność z kolejnymi interwencjami, takimi jak wyzwanie infekcją lub podawanie terapeutyczne7,8,9,10.
W niniejszym badaniu opracowaliśmy i zmodyfikowaliśmy wcześniej zweryfikowane techniki noworodkowego dożylnego podawania oraz wszechstronność bioluminescencyjnego obrazowania in vivo, aby opisać model przeszczepu do badania wpływu infekcji we wczesnym życiu na progresję komórek nowotworowych u dzieci. To podejście umożliwia dożylne podanie komórek B-ALL lub NB z oznaczeniem luciferase do 1-2-dniowych szczeniąt, po którym następuje modulowanie odporności przez podanie dootrzewnowe (i.p.) cytomegalowirusa mysiego (mCMV) w 7 dniu po urodzeniu (P7). Progresję nowotworu następnie oceniano 10 dni po infekcji (P17).
Mimo że dostęp do żyły skroniowej jest ograniczony do ograniczonego okna powłokowego (P0–P3), ta metoda zwiększa powtarzalność i kontrolę eksperymentalną, oferując wszechstronną platformę do badania wpływu wczesnoodległowych mechanizmów odpornościowych na immunonadzór nowotworów, interakcji infekcja-rak i reakcji na immunoterapię. Dodatkowo, to podejście wspiera efektywne osiedlanie przeszczepionych komórek, umożliwiając w ten sposób powtarzalne utworzenie modeli chorobowych dla badań mechanotycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury (Rysunek 1) przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (protokół A23-0169).
1. Generowanie komórek białaczki opatrzone luciferase
- Izolacja komórek białaczkowych z myszy Eµ-Ret z białaczką
- Znieczulić myszy w 1 L komorze indukcyjnej z 5 % izofluranu i 1 L·min-1 tlenu do osiągnięcia głębokiego poziomu znieczulenia (utrata odruchu prawidłowego położenia i powolne, regularne oddychanie).
- Po potwierdzeniu głębokiego znieczulenia przerwać podawanie izofluranu i podawać dwutlenek węgla (CO₂) z wysokim przepływem (3–4 razy szybciej niż standardowa stopniowa wymiana; np. 6-8 L·min dla 10 L komory) bez przenoszenia zwierzęcia między komorami. Podtrzymać ekspozycję na CO₂ przez co najmniej 5 min po zaprzestaniu oddychania, aby zapewnić śmierć.
- Wywietrzyć i usuwać odpadowe gazy przed otwarciem komory.
- Potwierdzić śmierć poprzez brak bicia serca i oddychania, a następnie wykonać uduszenie szyjne jako wtórną metodę fizyczną zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
- Przenieść tuszę do szafy biobezpieczeństwa, potwierdzić śmierć, zarejestrować płeć i masę ciała oraz spryskać zewnętrzną część 70 % etanolem.
- Wykonać nacięcie środkowe brzucha, odłożyć skórę i ścianę otrzewną, a następnie wyciąć śledzionę do 5 mL sterylnego PBS.
- Wyciąć kości udowej i piszczelową z obu nóg, usunąć nadmiar tkanki i wyciąć śledzionę w sterylnych warunkach. Natychmiast przenieść śledzionę do 5 mL sterylnego, zimnego buforu fosforanowego (PBS) w celu zachowania żywotności komórek.
- Przetworzyć śledzionę.
- Homogenizować tkankę śledziony w 1 mL buforu lizy krwinek czerwonych (RBC) (użyć 2 mL dla śledzion o masie większej niż 200 mg). Inkubować przez 2–3 min w temperaturze pokojowej.
- Wygasić lizę dodając 10 mL PBS + 2 % fetalnego surowicy bydlęcej (FBS) (bufor FACS), przefiltrować przez sitko o średnicy 40 µm i wyśrodkować przez 5 min w 350 × g w 4 °C.
- Resuspendować pellet śledziony w 5 mL buforu FACS.
- Przetworzyć szpik kostny.
- Wyciąć oba epifiza i spłukać każdą kość za pomocą 1 mL buforu FACS za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 29-gauge do 15 mL probówki.
- Wyśrodkować zawiesinę komórek, odrzucić nadstan i resuspendować komórki w 1 mL buforu RBC, inkubaować przez 2 min w RT, następnie wygasić lizę dodając 10 mL buforu FACS, przefiltrować przez sitko o średnicy 40 µm i wyśrodkować przez 5 min w 350 × g w 4 °C.
- Odrzucić nadstan i resuspendować pellet szpiku w 1 mL buforu FACS poprzez pipetowanie w górę i w dół.
- Delikatnie mieszać i przefiltrować przez sitko o średnicy 40 µm, jeśli to konieczne.
- Resuspendować 0,5 × 10^6 komórek białaczkowych w 200 µL środowiska hodowlany komórek (np. Dulbecco's Modyfikowany Ośrodek Eagle'a (DMEM)) uzupełnione o 20 % FBS i interleukinę-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
Punkt przerwy: Trzymaj zawiesiny komórek na lodzie do 2 h przed barwieniem.
- Lentiwirusowa transdukcja komórek białaczkowych:
- Zasiewać komórki stromalne pochodzenia szpiku kostnego od myszy w liczbie 1 × 10^5 komórek na dołek w 24-dołkowej płytce 24 h przed transdukcją, aby osiągnąć przyleganie i 70–80% konfluencji.
- Zasiewać komórki białaczkowe (0,5 × 10^6 komórek w końcowej objętości 200 µL) w niepotraktowanej tkankowo 24-dołkowej płytce.
- Dodać samoinaktywujący (SIN) wektor lentiwirusowy kodujący podwójny reporter składający się z czerwonej świetlnej chrząszcza (CBR) luciferase i zwiększonej zielonej białka fluorescencyjnego (eGFP), napędzanego przez konstytutywny promotor ubiquitinu, przy wskaźniku wielokrotności infekcji (MOI): 10–20, tytrze wirusowym: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (jednostek transdujących na mililitr) w końcowej objętości transdukcji 200 µL wraz z polibreną (8 µg·mL-1; Sigma, H9268-5G).
UWAGA: Polibren jest cytotoksyczny w wysokich stężeniach. Nie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstrzyknięcie do żyły skroniowej umożliwia skuteczną inkorporację komórek białaczki i nerwiaków u noworodków
Aby zamodelować wpływ wczesnożyciowej infekcji na progresję raka u dzieci, komórki B-ALL z oznaczeniem luciferase pochodzące od dorosłych myszy leukemicznych Eµ-Ret lub komórki NB pochodzące od mierzących się z śmiercią myszy Th-Mycn były wstrzykiwane dożylnie przez żyłę skroniową do 1-2 dniowych syngeneicznych młodych, potwierdzając udaną inkorporację pięć dni po przeszczepie za pomocą BLI ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zrozumienie, jak wczesny rozwój układu odpornościowego wpływa na progresję raka, jest niezbędne do opracowania odpowiednich strategicznie działań immunomodulacyjnych w zależności od wieku. W niniejszym badaniu opisujemy powtarzalną platformę transplantacyjną dla noworodków, która umożliwia precyzyjną kontrolę czasową wszczepienia komórek nowotworowych i modulację odporności w krytycznym okresie niedojrzałości układu odpornościowego po urodzeniu. Łącząc dostarczanie dożylne za pośrednictwem żyły skroniowej z BLI, model te...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To dzieło było wspierane przez granty operacyjne Kanadyjskich Instytutów Badań Zdrowia dla G.S.D.R. (MOP-126122). A.F. był laureatem stypendium po doktoranckim z Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program (MC3RP).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100µL, Microliter Syringe, Luer Tip | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G Needle | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X imaging system | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-mouse B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-mouse CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-mouse CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-mouse Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | Also called BP1 |
| anti-mouse TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-mouse/human CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura software | Spectral Instruments Imaging | - | version 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Cleaning solution | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL contains 6000 beads |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo software | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism software | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 Cold light source | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Research Grade | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG mice | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101301 | - |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | - |
Bibliografia
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
- Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
- Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
