Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekroptoza, forma uregulowanej martwicy, kończy się pęknięciem błony komórkowej. Nasze laboratorium i inne odkryły, że przepuszczalność błony lizosomalnej (LMP) jest wczesnym i kluczowym wydarzeniem w tym procesie, poprzedzającym jej pęknięcie. Szybkie LMP uwalnia silne enzymy lizosomalne, szczególnie proteazy, do cytosolu, aktywnie sprzyjając śmierci komórki. Obrazowanie żywych komórek stanowi nieocenione narzędzie do wykrywania ostatniej chwili w czasie rzeczywistym podczas nekroptozy. Kilka fluorescencyjnych barwników jest bardzo skutecznych: (1) barwniki LysoTracker wrażliwe na pH śledzą zmiany pH lizosomów. Spadek sygnału fluorescencyjnego wskazuje na utratę gradientu pH lizosomalnego, co jest głównym objawem dysfunkcji lizosomalnej, która może być prekursorem lub bezpośrednią konsekwencją LMP. (2) Fluoresceinowo znakowane kulki dekstranowe są internalizowane i gromadzą się w lizosomach. Ich uwolnienie do cytosolu sygnalizuje zakończenie LMP i wyciek ładunku. Tutaj zaobserwowaliśmy stopniową utratę fluorescencji lizotrackerowej, z dyfundującą fluorescencją dektranową do cytosolu po indukcji nekroptozy. W ten sposób metodologia obrazowania żywych komórek umożliwia naukowcom precyzyjne śledzenie czasu i zakresu dysfunkcji lizosomalnej, przyczyniając się do pełniejszego zrozumienia mechanizmów nekroptozy i ukazując potencjalne interwencje terapeutyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekroptoza to niezależna od kaspazy forma regulowanej śmierci komórkowej, powiązana z wieloma chorobami zapalnymi, neurodegeneracyjnymi, chorobami płuc, wątroby i serca 1,2,3. Szlak ten jest pośredniczony przez złożoną kaskadę reakcji, które kończą się aktywacją receptorowo-oddziałującej kinazy białkowej 1 (RIPK1), która oddziałuje z receptor-oddziałującą kinazą białkową 3 (RIPK3) za pośrednictwem homotypowego motywu interakcji RIP (RHIM) domen 4,5,6. RIPK3 z kolei rekrutuje mieszane białko kinazowopodobne (MLKL), tworząc nekromom 7,8. Fosforylacja MLKL przez RIPK3 prowadzi do oligomeryzacji i późniejszej polimeryzacji. Polimery MLKL następnie przenoszą się do błon komórkowych, co ostatecznie prowadzi do pęknięcia błony komórkowej i śmierci komórki 9,10,11. Jednak mechanizmy, dzięki którym polimery MLKL przechodzą do przedziałów błony i wywołują jej zakłócenia, nie są w pełni poznane.

Lizosomy to organelle odpowiedzialne za degradację i recykling materiałów komórkowych. W jego lumenie znajdują się proteazy, lipazy, nukleazy i hydrolazy odpowiedzialne za trawienie makrocząsteczek, utrzymując tym samym homeostazę komórkową12,13. Dlatego utrzymanie integralności lizosomalów i prawidłowej funkcji jest niezbędne dla zapewnienia skutecznego oczyszczania komórek, adaptacji do stresu oraz ogólnego przeżycia komórek 14,15,16. Najnowsze badania wskazują na związek między nekroptozą a przepuszczalnością błony lizosomalnej (LMP)17,18,19.

Nasze ostatnie obserwacje wykazały, że LMP jest wczesnym i istotnym zdarzeniem w procesie nekroptozy, poprzedzającym ostateczne pęknięcie błony komórkowej19. Konkretnie, polimeryzacja MLKL na błonie lizosomalnej indukuje szybkie LMP, które uwalnia silne enzymy lizosomalne, szczególnie proteazy, w tym katepsynę B, do cytosolu. Proteazy te następnie rozszczepiają ważne białka, aby sprzyjać śmierci komórki. Co ważne, hamowanie aktywności CTSB silnie chroni przed śmiercią komórek19,20. Dane te sugerują, że LMP jest kluczowym modulatorem szlaku nekroptozy. Dlatego monitorowanie czasu LMP podczas nekroptozy jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów molekularnych i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych.

Wiele konwencjonalnych metod wykrywania LMP, takich jak immunobarwienie, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) czy cytometria przepływowa, wymaga stałych próbek lub w inny sposób dostarcza jedynie informacji końcowych 21,22,23, nie oddając dynamicznego procesu zaburzenia lizosomów, szczególnie w kontekście szybkiego postępu nekroptozy. Natomiast metoda obrazowania żywymi komórkami umożliwia wysokorozdzielczą, w czasie rzeczywistym wizualizację LMP podczas nekroptozy. W tym protokole połączyliśmy dwa komplementarne markery lizosomatów oraz wywołaliśmy nekroptozę w komórkach HT-29, aby przeanalizować integralność błony lizosomalnej w czasie rzeczywistym19. Technika ta zapewnia solidną i adaptowalną podstawę do badania ostatniej miesiączki nie tylko w nekroptozie, ale także potencjalnie w innych formach stresu komórkowego, gdzie integralność lizosomów jest naruszona, szczególnie w kontekście chorób lub stosowania terapii ukierunkowanych na lizosomy 24,25,26.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Posiew komórkowy - dzień 0

  1. Umieść 5 000 komórek w 2 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydłą (FBS) oraz 1% penicyliną i streptomycyną (P/S) w sterylnej misce z szklanym dnem.
  2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez noc.

2. Załadunek koralików Dextran – dzień 1

  1. Rozcieńcz zielone kulki dekstranu do 25 μg/mL w świeżym DMEM, uzupełniając 10% FBS i 1% P/S, dodając 20 μL roztworu 2,5 mg/mL.
  2. Usuń stary materiał i zastąp go 2 mL DMEM zawierającego koraliki, uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S.
  3. Inkubuj komórkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5%CO2 , aby umożliwić internalizację kulek do lizosomów.

3. Barwienie lizotrackerem – dzień 2 (dzień eksperymentu)

  1. Przygotuj medium barwiące, dodając 2 μL 1 mM roztworu Lysotracker do 2 mL świeżego DMEM, uzupełnionego o 10% FBS i 1% P/S, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Zamień stare medium na ten roztwór barwiący.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2 godziny, zgodnie z zalecanym czasem inkubacji (30 minut do 2 godzin) podanym w Wytycznych dotyczących stosowania sond molekularnych przez Life Technologies27. W naszych eksperymentach 2 godziny inkubacji w komórkach HT-29 skutkowały silnym barwieniem punktu z silną kolokalizacją z kulkami dektranu, co wskazuje na stabilną fluorescencję barwnika.
    UWAGA: Włącz mikroskop konfokalny 30 minut przed obrazowaniem żywymi komórkami.

4. Układ mikroskopu konfokalnego

  1. Włącz komponenty systemu konfokalnego w następującej kolejności: mikroskop PC; zasilanie skanera; zasilanie laserowe; emisję laserową; Moc Leiki.
  2. Włącz sterowanie środowiskowe: Cube – regulator temperatury; Sterownik mieszanki gazowej Brick -CO2 . Otwórz zasilanieCO2 iO2 .
  3. Ustaw parametry gazu:
    1. Ustaw regulator temperatury (sześcian) na 37 °C.
    2. Ustaw regulator gazu i wilgotności (cegłę) na 5%CO2 i 95% wilgotności.
  4. Złóż komorę obrazującą zgodnie ze Rysunkiem 1.
  5. Ustaw obiektyw konfokalny:
    1. Użyj obiektywu immersyjnego 63x/1.40 NA.
    2. Ustaw lasery wzbudzające na 488 nm (zielony fluorofor) i 555 nm (czerwony fluorofor).
    3. Dla lasera 488 nm wybierz detektor hybrydowy (HyD), a dla lasera 555 nm detektor PMT.
      UWAGA: Fluorescencyjne przesłuchy zostały zminimalizowane dzięki użyciu zdefiniowanych bramek w oprogramowaniu konfokalnym, które potwierdziły brak przesłuchów między kanałami.

5. Przygotowanie po barwieniu (po inkubacji LysoTracker)

  1. Dokładnie umyj komórki trzy razy 2 mL PBS.
  2. Dodaj 2 mL świeżego DMEM z 10% FBS i 1% P/S.
  3. Nałóż jedną kroplę olejku immersyjnego na obiektyw przed zdjęciem.
  4. Zamontuj antenę na scenie mikroskopu.
  5. Dostosuj intensywność lasera i tło.
    1. Reguluj intensywność lasera do 3%, ale nie więcej niż 5%.
    2. Dostosuj wzmocnienie detektora w oprogramowaniu mikroskopu, aby zoptymalizować sygnał.
    3. Aby zminimalizować tło, dostosuj pasek kontrastu.
  6. Pobierz obrazy bazowe nieleczonych komórek (przed dodaniem T/S/Z), które pełnią funkcję warunku kontrolnego.
  7. Wróć płytę do maski laminarnej i dodaj 1 mL DMEM uzupełnionego o 10% FBS i 1% P/S, zawierającego 100 ng/mL TNF-α (T), 500 nM mimetyku SMAC (S) oraz 100 μM Z-VAD-FMK (Z).
  8. Kontynuuj obrazowanie na mikroskopie konfokalnym.
    UWAGA: T/S/Z zostały celowo dodane w wyższych stężeniach niż standardowe protokoły. Decyzja ta została podjęta, aby przyspieszyć LMP i śmierć komórek, umożliwiając bardziej wiarygodne rejestrowanie wczesnych zdarzeń w obrazowaniu w czasie rzeczywistym.

6. Ustawienia akwizycji obrazu

  1. W oprogramowaniu do akwizycji ustaw parametry następująco: tryb: xyt; format: 512 x 512; prędkość: 400; Zoom: 3; średnia linii: 1; nagromadzenie linii: 3; akumulacja ramek: 1; Interwał czasu: 3 min; Czas trwania: 8 h; Włącz autofokus.
  2. Kliknij Start, aby rozpocząć akwizję w czasie poklatkowym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury opisane w tym protokole umożliwiają pozyskiwanie obrazów żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej do monitorowania ostatniej chwili w czasie rzeczywistym. Rysunek 1 ilustruje schematyczną prezentację protokołu eksperymentalnego, od powłokowania komórek po akwizycję obrazu. W dniu 0 poddano i inkubowano 5 000 komórek HT-29 przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 24 godzinach (Dzień 1) komórki były inkubowane z markerowanymi fluoresceiną kulkami dektranu (25 μg/mL) przez dodatkowe 24 godziny w tych samych warunkach. Te kulki są internalizowane przez endocytozę i transport do lizosomów, gdzie gromadzą się i pojawiają się jako jasne punkty. W dniu 2 (dzień eksperymentu) komórki były traktowane barwnikiem LysoTracker (1 μM) wrażliwym na pH przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5%CO2. LysoTracker koncentruje i wykazuje silną fluorescencję w kwaśnych przedziałach, takich jak późne endosomy i lizosomy. Trzydzieści minut przed obrazowaniem włączono i ustabilizowano system mikroskopu konfokalnego, w tym regulatory temperatury, gazu i wilgotności, zgodnie z krokiem 4 protokołu. Komora obrazowania została złożona, co pokazano na Rysunku 2. Zastosowano lasery 488 nm (zielony) i 555 nm (czerwony).

Po inkubacji LysoTrackerem komórki były starannie myte trzykrotnie PBS, a następnie dodano 2 mL świeżego DMEM z 10% FBS i 1% P/S. Płytka została przeniesiona do mikroskopu, a na obiektyw 63x/1.40 NA naniesiono jedną kroplę oleju immersyjnego. Następnie dostosowano intensywność lasera i poziomy tła, aby zoptymalizować warunki obrazowania, jak opisano w kroku 5.5. protokołu. Nasze początkowe obrazy potwierdziły obecność stabilnych punktów lizotrackera oraz fluoresceinowo znakowanego dekstranu, co wskazuje na nienaruszone lizosomy (Rysunek 3). Obrazy bazowe zostały uzyskane przed T/S/Z i użyte jako kontrola. Nie zastosowano żadnego pojazdu.

Po ustaleniu początkowych ustawień obrazowania i mikroskopii, płytka została zwrócona do laminarnego pokrywa przepływowego, a dodano 1 mL DMEM uzupełnionego o 10% FBS i 1% P/S, zawierającego 100 ng/mL TNF-α (T), 500 nM SMAC mimetycznego (S) oraz 100 μM Z-VAD-FMK (Z). Obrazowanie kontynuowano na mikroskopie konfokalnym przy użyciu parametru akwizycji obrazowania opisanego w kroku 6 protokołu. Jak pokazano na Rysunku 3, filmie uzupełniającym S1 oraz filmie uzupełniającym S2, stopniowy spadek fluorescencji LysoTracker w komórkach leczonych T/S/Z był wczesnym wskaźnikiem zmian lizosomalnych. Utrata ta była następująca, a czasem występowała jednocześnie z wypływem fluoresceinowym znakowanym dektranem z lizosomów do cytosolu (przesunięcie punktacji do dyfuzy), wskazując na LMP. Po 8 godzinach niemal cały sygnał lizotrackera zniknął, jednak wiele komórek nadal zachowywało zielone punkty z cytosolowym zielonym sygnałem, co sugeruje, że utrata gradientu pH lizosomalnego poprzedza całkowite uwolnienie LMP i ładunku.

Rysunek 1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu eksperymentalnego.(Stworzono w BioRender.com) Początkowo poddano 5 000 komórek (0 h) i inkubowano przez 24 godziny; następnie dodawano i inkubowano kulki Dextran (25 μg/mL) przez dodatkowe 24 godziny. Po 48 godzinach dodano LysoTracker (1 μM) i inkubowano przez 2 godziny. Komórki były myte trzykrotnie PBS (krok 1), a następnie dodano 2 mL świeżego DMEM z 10% FBS i 1% P/S (krok 2). Ustawienia mikroskopii zostały dostosowane (krok 3), a komórki poddano leczeniu TNF-α (T), mimetycznym SMAC (S) oraz inhibitorowi pan-kaspazy Z-VAD-FMZ (krok 4), przed pobraniem obrazów żywych komórek (krok 5). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Schemat ustawienia komory obrazującej. (A) uchwyt na próbkę, (B) komorę inkubacyjną gazu oraz (C) górną pokrywę. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy komórek HT29 przed i po leczeniu T/S/Z. Komórki były barwione czerwonymi koralikami Lysotracker i zielonymi kulkami Dextran oraz traktowane TNF-α (T), SMAC mimetycznym (S) oraz inhibitorem pan-kaspaz Z-VAD-FMZ (Z). Skala: 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Film uzupełniający S1: Time-lapse komórek HT29 inkubowanych zielonymi kulkami Dextran i traktowanych T/S/Z. Komórki były monitorowane przez ponad 6 godzin, aby ocenić odpowiedź komórkową. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający S2: Timelapse komórek HT29 inkubowanych LysoTracker red i leczonych T/S/Z. Komórki były monitorowane przez ponad 6 godzin, aby ocenić odpowiedź komórkową. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykazał, że połączenie LysoTracker oraz fluoresceinowych markerowanych kulek dektranowych umożliwia jednoczesne monitorowanie lizosomalnego pH i uwalniania ładunku w czasie rzeczywistym. Reprezentatywne wyniki (Rysunek 3, Dodatkowy film S1 oraz Dodatkowy film S2) potwierdzają, że nieleczone komórki utrzymują stabilny sygnał punkty dla obu markerów. Natomiast leczenie T/S/Z wskazuje na postępującą utratę intensywności lizotrackera oraz przesunięcie dekstanu z rozkładu punktowego na rozproszony cytosol, co jest zgodne z ostatnią dawką (LMP).

Kluczowym pierwszym krokiem w tym protokole jest wybór komórek do akwizycji obrazu. Nasze wcześniejsze dane pokazują, że leczenie T/S/Z powoduje śmierć około 80% komórek HT-29 w ciągu 24 godzin, podczas gdy pozostałe 20% przeżywa19 godzin. Ponieważ LMP nie występuje na początku eksperymentu, komórki są początkowo dobierane na podstawie morfologii i ich podwójnego dodatniego sygnału zarówno dla koralików LysoTracker, jak i Dextran. Chociaż ta metoda nie może przewidzieć, które konkretne komórki poddadzą się LMP, konsekwentnie zaobserwowaliśmy, że około 60% monitorowanej populacji ostatecznie wykazuje LMP podczas 8-godzinnego okresu obrazowania. Innym wyzwaniem jest natura obrazowania sekwencyjnego. Niewielki przesunięcie pozycji Z komórki, które występuje podczas akwizycji co 3 minuty, uniemożliwia ciągłe śledzenie tego samego sygnału punkty przez cały eksperyment. Ponadto komórki migrują i ulegają zmianom morfologicznym w odpowiedzi na leczenie T/S/Z28. W konsekwencji niemożliwe jest śledzenie dynamiki poszczególnych lizosomów przez cały okres obrazowania. W długoterminowym obrazowaniu żywych komórek istotny jest potencjalny wkład fototoksyczności jako mediatora śmierci komórki. Ciągłe wzbudzanie podczas przedłużonych sesji może generować reaktywne formy tlenu i upośledzać żywotność komórek29, potencjalnie zakłócając prawdziwą odpowiedź nekrototyczną. Aby zminimalizować ten efekt, zastosowaliśmy niską moc lasera i krótkie czasy naświetlania. Ponadto podano pięciokrotne stężenie T/S/Z, aby przyspieszyć proces śmierci komórki. Nie możemy jednak całkowicie wykluczyć wkładu stresu wywołanego światłem do obserwowanych zmian lizosomowych.

Ważną zaletą tego protokołu obrazowania żywych komórek jest jego zdolność do monitorowania zmian pH lizosomalnych i LMP w czasie rzeczywistym, rejestrując dynamiczne zdarzenia pomijane przez analizy końcowe, takie jak TEM, cytometria przepływowa i immunobarwienie. Chociaż TEM oferuje wysokorozdzielcze wglądy strukturalne, nie jest w stanie oddać temporalnego postępu LMP. Alternatywne metody z żywymi komórkami, takie jak testy relokacji akrydynypomarańczowej 30 czy formacja galektyny-punkty31, są również cennymi narzędziami do monitorowania integralności lizosomów, ale każda z nich ma ograniczenia stosowane w izolacji. Test pomarańczy akrydynowej informuje o redystrybucji barwnika z kwaśnych organelli do cytosolu, co jest wpływane zarówno przez zmiany pH lizosomów, jak i przepuszczalność błon, przez co nie koreluje bezpośrednio z uwalnianiem ładunku. Podobnie formowanie galektyny-puncty odzwierciedla ekspozycję glikanów luminalnych na cytosol i tym samym oznacza uszkodzenie błony lizosomalnej31,32, ale nie rozróżnia częściowej permeabilizacji od całkowitego pęknięcia lizosomalnego.

Główną zaletą tego protokołu jest połączenie LysoTracker i kulek dektranowych, co umożliwia jednoczesne badanie zakwaszenia lizosomalnego i wycieku ładunku. Zapewnia to unikalny, podwójny odczyt zarówno funkcjonalności lizosomów, jak i integralności strukturalnej. Zanik LysoTracker działa jako wskaźnik zmiany pH lizosomowego, podczas gdy uwalnianie dektranu bezpośrednio raportuje fizyczny wyciek zawartości lizosomalnej. Stosując te dwa markery razem, znacząco poprawiamy wykrywalność zarówno częściowej, jak i pełnej LMP. Dlatego ta strategia obrazowania żywych komórek jest szeroko stosowalna. Naukowcy mogą dostosować go do użycia z innymi typami komórek i różnymi sondami fluorescencyjnymi, aby badać integralność lizosomalną w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym w zaburzeniach farmakologicznych lub genetycznych. Ta zdolność jest kluczowa dla pogłębiania wiedzy o mechanizmach nekroptozy oraz identyfikacji potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w laboratorium dr Zhigao Wanga są wspierane przez granty NIH R35GM158455 i R01GM147474.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa HT-29ATCCHTB-38Komórki raka jelita grubego
Naczynie o szklanym dnie 35 mmMatTek CorporationP35G-1.5-14-C-GRD
Inkubator CO2PHCBIMCO-170AICUVL
Mikroskop konfokalnyLeicaSP8WLL
Zielone koraliki DextranThermoFisherD1820Dektran, fluoresceina, 10 000 MW, anion, lizyna – można naprawić
Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) firmy DulbeccoCorning  10-013-CV
Serum bydła płodu (FBS)Cytiva SH30910.03
LysoTracker Red DND-99InvitrogenL7528
Typ HF z zanurzaniem olejowymNauki o mikroskopii elektronowej16915-01
Penicylina i streptomycyna (P/S) Sigma-AldrichP4333
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)Corning21-040-CV
Mimetyk Smac (S)BV6, ApexBio, katalogB4653Końcowa koncentracja, 1 mM
The Brick Usługi obrazowania życia13685Regulator CO2 do mieszanki gazowej
KostkaUsługi obrazowania życiaCBO2AMikroskopy komorowe z kontrolą temperatury
Czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-&alfa; - T)Peprotech30001A100UGKońcowe stężenie, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Końcowa koncentracja, 20 mM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Necroptosis MechanismsLysosomal DysfunctionFluorescent ProbesLysoTracker DyesDextran BeadsConfocal MicroscopyTime Lapse ImagingCell Death Induction

Powiązane artykuły