Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

28 listopada 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia metody eksperymentalne biochemicznie charakteryzujące GFAP i jego mutacje wywołujące choroby, koncentrując się na składaniu, agregacji i modyfikacji potranslacyjnej filamentu. Analizowano białka GFAP o wysokiej czystości, co ujawniło wgląd w mechanizmy choroby Alexandra, które mogą stanowić ramy do badania potencjalnych celów terapeutycznych oraz zrozumienia mutacji GFAP i powiązanych schorzeń.

Streszczenie

Białko kwaśne włókniste glejowo (GFAP) jest kluczowym białkiem włókna pośredniego, kluczowym dla utrzymania integralności strukturalnej i funkcji astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym. Mutacje w GFAP są główną przyczyną choroby Alexandra (AxD), rzadkiej i często śmiertelnej choroby neurodegeneracyjnej, charakteryzującej się podwyższeniem poziomu GFAP oraz nagromadzeniem GFAP w postaci włókien Rosenthala. Przedstawiamy tutaj kompleksowy zestaw eksperymentalnych podejść do biochemicznej charakterystyki GFAP i jego wariantów wywołujących chorobę. Dzięki optymalnej ekspresji i zaawansowanym technikom oczyszczania osiągnęliśmy wysokie wydajności i czystość zarówno białek GFAP typu dzikiego, jak i mutanta. Do oceny wpływu mutacji patogennych na składanie filamentów, rozpuszczalność i agregację zastosowano testy biochemiczne. Dodatkowo badaliśmy rolę aberrancyjnych modyfikacji posttranslacyjnych w agregacji GFAP oraz ich wpływ na właściwości filamentów. Prace te poszerzają nasze zrozumienie roli GFAP w AxD i stanowią podstawę do opracowywania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcje GFAP. Ponadto przedstawione tutaj metodologie stanowią cenne narzędzia do badania biochemicznych konsekwencji mutacji GFAP oraz do rozwoju interwencji w zaburzeniach związanych z GFAP.

Wprowadzenie

Choroba Alexandra (AxD) to zaburzenie genetyczne powstałe w wyniku dominujących mutacji w genie kodującym kwaśne białko włókniste gleja (GFAP)1, białko typu III pośredniego filamentu (IF), występujące głównie u dojrzałych astrocyta. AxD charakteryzuje się upregulacją GFAP2, reaktywną astrogliozą3 oraz nagromadzeniem włókien Rosenthala, które są inkluzjami białkowymi zbudowanymi głównie z GFAP wraz z powiązanymi białkami, takimi jak αB-krystallina4 i ubikwityna5. Mutacje w genie GFAP zakłócają prawidłowy układ filamentu6, prowadząc do nieprawidłowej agregacji, indukcji komórkowych odpowiedzi stresowych7 oraz dalszej destabilizacji poprzez nieprawidłowe modyfikacje posttranslacyjne (PTM), takie jak fosforylacja8, oksydacja9 oraz ubikwitynacja10.

Pomimo centralnej roli GFAP w patologii AxD, mechanizmy molekularne, dzięki którym mutantny GFAP zakłóca składanie filamentów, sprzyja agregacji i wywołuje stres komórkowy, pozostają słabo poznane. Ta luka w wiedzy utrudnia rozwój terapii celowanych w celu zwalczania agregacji i toksyczności GFAP. Badanie właściwości biochemicznych GFAP i jego wariantów związanych z AxD jest kluczowe dla odkrycia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw postępu choroby. Jednak skłonność GFAP do agregacji oraz jego zmienione zachowanie składowe w wariantach chorobowych stanowią unikalne wyzwania dla analizy eksperymentalnej. Kontrolowane badania biochemiczne wymagają oczyszczonego GFAP, pozyskiwanego z modeli zwierzęcych lub poprzez ekspresję rekombinowaną, aby zbadać wpływ mutacji AxD na składanie, agregację i modyfikacje patologiczne filamentu.

Eksperymentalne podejścia przedstawione w tym badaniu oferują kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. Na przykład, choć modelekomórkowe 11 i badania immunohistochemiczne12 dostarczają cennych informacji na temat ekspresji i lokalizacji GFAP, często nie oddają precyzyjnych mechanizmów biochemicznych składania i agregacji filamentów ze względu na złożoność środowisk komórkowych. Dla porównania, opisane tutaj metody, takie jak testy montażu filamentów in vitro , analizy sedymentacji oraz charakteryzacja PTM, umożliwiają kontrolowane badania właściwości biochemicznych GFAP i jego wariantów związanych z chorobą. Te podejścia pozwalają badaczom analizować zachowanie składania i agregacji filamentu w uproszczonym systemie, ułatwiając identyfikację molekularnych mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji GFAP. Wcześniejsze badania wykazały użyteczność takich technik biochemicznych do analizy białek IF, w tym desmin13 i keratyn14, podkreślając ich przydatność w badaniach GFAP.

Dodatkowo, manuskrypt ten dostarcza informacji pomagających czytelnikom ocenić, czy opisane metody są odpowiednie dla ich konkretnych zastosowań. Naukowcy zainteresowani badaniami biochemicznych właściwości GFAP, jego zachowań montażowych (PTM) uznają te techniki za szczególnie przydatne do badania wariantów związanych z chorobą i ich patologicznych skutków. Integrując te podejścia biochemiczne z innymi systemami eksperymentalnymi, takimi jak badania komórkowe czy modele zwierzęce, naukowcy mogą uzyskać pełniejsze zrozumienie dysfunkcji GFAP w AxD i innych powiązanych astrocytopatiach.

Głównym celem tej metody jest przedstawienie eksperymentalnych podejść do analizy biochemicznej GFAP i jego wariantów związanych z AxD, w tym technik oczyszczania białek, testów montażu filamentów in vitro , analiz sedymentacji oraz charakteryzacji PTM. Metody te dostarczają kluczowych informacji na temat molekularnych podstaw dysfunkcji GFAP w AxD, torując drogę do rozwoju terapii. Ponadto zastosowanie tych technik eksperymentalnych poszerzy nasze zrozumienie biochemii GFAP w AxD i przyczyni się do szerszego rozwoju badań IF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zwierzęta użyte w tym badaniu to szczury modelu AxD z mutacją knock-in R237H11. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych Wydziału Nauk o Życiu i Medycynie na Narodowym Uniwersytecie Tsing Hua (NTHU IACUC Approval No. 109088 i 111060) oraz zgodnie z wytycznymi Podręcznika Rolniczego dotyczącego opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Oczyszczanie rekombinowanego GFAP z bakterii (Rysunek 1)

  1. Przetransformuj szczep pLysS E. coli BL21(DE3) wektorem pET 23b zawierającym cDNA WT lub mutanta GFAP.
  2. Hodować bakterie w 1 L medium Luria-Bertani uzupełnionym o 100 μg/mL ampicyliny i 34 μg/mL chloroamfenikolu w temperaturze 37 °C do OD600 ~0,2.
  3. Dodaj izopropylowy β-D-1-tiogalaktopyranozyd (IPTG, 0,5 M) do końcowego stężenia 0,5 mM, aby wywołać ekspresję GFAP w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
  4. Pobieraj bakterie przez wirowanie w stężeniu 6 371 xg przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Bakteria lizowa w 50 mL buforu TEN (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) uzupełniona 0,2 mM fluorkiem phnenylmetanesulfonylowo-fluorowym (PMSF) poprzez homogenizację w homogenizatorze Dounce.
  6. Wiruj w wirówce bakteryjne lizaty bakteryjne w stężeniu 22 045 xg przez 20 minut w 4 °C, a następnie wyciągaj granulek w buforze Triton X-100 (TEN z 1% (v/v) Triton X-100).
  7. Po wirowaniu w tych samych warunkach należy wyciągnąć powstały granulek w buforze o wysokiej zawartości soli (TEN z 1% (v/v) Triton X-100 i 1,5 M KCl).
  8. Po wirowaniu w tych samych warunkach przemyj granulkę buforem TEN.
  9. Rozpuść ostatni granulat w 10 mL buforu mocznika (8 M mocznika, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA i 0,2 mM PMSF) przez mieszanie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  10. Wirówka pobiera mocznik w ilości 80 000x g w ultrawirówce stołowej w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  11. Do frakcji rozpuszczalnej w moczniku dodaj polietyleiminę (1% (v/v)) do końcowego stężenia 0,06% (v/v) i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
  12. Wirować w 80 000 xg w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie dializować frakcję supernatantu względem buforu A (6 M mocznika, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-merkaptoetanolu).
  13. Ładuje się dializy na kolumnę jonizy CM-Sepharozo, wstępnie wyważoną w buforze A w systemie chromatografii NGC.
  14. Białka eluty o gradientie liniowym 0-0,5 M NaCl w buforze A przez 1 godzinę z przepływem 1 mL/min.
  15. Frakcje zawierające GFAP w puli i dializują na buforze B (6 M mocznika, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM EDTA).
  16. Ładuje się dializy na kolumnę wymiany anionowej wstępnie wyrównaną w buforze B. Białka elutyczne o gradientzie liniowym 0-0,5 M NaCl w buforze B przez 1 godzinę z przepływem 1 mL/min.
  17. Przeanalizuj ułamki kolumny za pomocą barwienia SDS-PAGE i błękitu Coomasie. Zbieraj te zawierające oczyszczony GFAP i przechowuj w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Liza bakteryjna może być ułatwiona przez kilka cykli zamrożenia i rozmrażania. Końcowe stężenie polietyleniminy nie powinno przekraczać 0,06% (v/v), powyżej którego wytrącają się także białka. Podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi, takimi jak PMSF i β-merkaptoetanol, kluczowe jest zawarcie jasnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa oraz instrukcji dotyczących utylizacji odpadów niebezpiecznych. PMSF jest wysoce toksyczne i może powodować podrażnienia skóry, oczu oraz dróg oddechowych. Przygotuj roztwory PMSF świeżo w okapie i unikaj bezpośredniego kontaktu. Używaj β-merkaptoetanolu w dobrze wentylowanym miejscu, ponieważ emituje silne, toksyczne opary.

2. Montaż in vitro i test sedymentacyjny (Rysunek 2)

  1. Rozcieńczony oczyszczony WT lub mutant GFAP do 0,3 mg/mL w 6 M moczniku w buforze o niskiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA i 14,4 mM β-merkapethanol).
  2. Dializuj próbki przy niskosolnym buforze zawierającym 4 M, a następnie 2 M mocznika przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Próbki dializować przy niskim poziomie soli bez mocznika przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Dializuj próbki na buforze montażowym (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl i 14,4 mM β-merkapetanolu) w temperaturze pokojowej przez 12-16 godzin.
  5. Przelej mieszaniny montażowe na górę poduszki sacharozowej zawierającej 0,2 mL sacharozy 0,85 M w buforze montażowej.
  6. W teście sedymentacji o wysokiej prędkości wiruj mieszaniny w stężeniu 80 000x g przez 20 minut w 20 °C za pomocą stołowej mikro-ultrawirówki.
  7. Skoncentruj niezłożony GFAP w frakcji supernatantowej poprzez wytrącenie metanolu/chloroformu15. Ponownie zawiesz wytrącanie w 0,2 mL buforu próbki Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (w/v) siarczanu sodu dodecylowego (SDS), 12,5% (v/v) gliceroli, 0,01% (w/v) błękitu bromofenolowego oraz 355 mM β-merkaptoetanolu).
  8. Ponownie zawiesij złożony GFAP w ułamku granulatu w buforze próbek Laemmli.
  9. Zarówno frakcje supernatantu, jak i granulek przeprowadź na żelu elektroforezy SDS (SDS-PAGE) o stężeniu 10% (w/v) i barw 10 mL błękitu Coomassie.
  10. W testie sedymentacyjnym o niskiej prędkości mieszaniny wirówki składają się w 3000 xg przez 5 minut w temperaturze 20 °C za pomocą wirówki stołowej.
  11. Dodaj 0,2 mL buforu próbki Laemmliego do nieagregowanych form GFAP w ułamku supernatantowym.
  12. Ponownie zawiesz zagregowany GFAP bezpośrednio w frakcji granulek w buforze próbkowym Laemmli w objętości proporcjonalnej do udziału supernatantu.
  13. Analizuj zarówno frakcje supernatantu, jak i pelletów za pomocą 10% (w/v) żelu SDS-PAGE, a następnie barwienia na błękit Coomassie.
    UWAGA: Metanol i chloroform to toksyczne rozpuszczalniki, które mogą powodować poważne skutki zdrowotne. Unikaj kontaktu ze skórą i wdychania. Ostrożnie obchodz się z okapem, aby zapobiec rozlaniom.

3. Negatywne barwienie i mikroskopia elektronowa (Rysunek 2)

  1. Rozładowanie świecące z miedzianych siatek Formvar/pokrytych węglem przez 45 sekund przy napięciu 20 mA w systemie czyszczenia wyładowania żarowego.
  2. Dostarcz mieszanki montażowe na siatkę wyładowaną żarowością i pozwól próbkom przywiązać się do folii wsparcia przez 60 sekund.
  3. Usuń nadmiar płynu, sprowadzając krawędź siatki kawałkiem papieru do wsiąkniania.
  4. Przemywaj kratki wodą destylowaną, a następnie bejcuj 20 μL 1% (w/v) octana uranilu przez 60 sekund.
  5. Usuń nadmiar roztworu do bejcowania i pozwól kratce wyschnąć na powietrzu przez 30 sekund.
  6. Zbadaj siatki pod mikroskopem transmisyjnym H-7600 (TEM) w trybie wysokiej rozdzielczości przy napięciu przyspieszającym 100 kV.
    UWAGA: Rozładowanie siatek w parowniku próżniowym przed dodaniem próbki białka poprawia adsorpcję próbki do siatki. Octan uranylu to radioaktywny i wysoce toksyczny związek chemiczny powszechnie stosowany w mikroskopii elektronowej do negatywnego barwienia. Obsługa tego odpadu wymaga ścisłego przestrzegania protokołów bezpieczeństwa oraz instrukcji dotyczących utylizacji odpadów niebezpiecznych, aby zminimalizować ryzyko narażenia dla personelu i środowiska. Przygotowuj roztwory octana uranilu wyłącznie w okapu, aby zapobiec wdychaniu cząstek lub oparów unoszących się w powietrzu.

4. Modyfikacja oksydacyjna (Rysunek 3)

  1. Rozcieńczaj GFAP do 0,3 mg/mL w 6 M moczniku w buforze o niskiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA i 14,4 mM β-merkapethanu) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Dializuj na niskosolonym buforze zawierającym 4 mln mocznika przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Delikatnie mieszaj bufor za pomocą mieszadła magnetycznego, aby utrzymać równomierny rozkład i zapobiec gradientom stężenia.
  3. Po 2,5 godzinie przenieś błonę dializyjną do buforu niskosolnego zawierającego 2 M mocznika na kolejne 2,5 godziny w temperaturze pokojowej, zapewniając delikatne mieszanie przez cały proces.
  4. Dializuj przy niskim stężeniu soli bez mocznika w 4 °C przez 18 godzin.
  5. Próbki zdializowane należy podawać 10 mM H202przez 15 minut, a następnie stosować 10 lub 100 mM ditiotreitolu (DTT) przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Analizuj próbki białek standardowym 10% (w/v) SDS-PAGE bez β-merkapethanolu i barw 10 mL Coomassie Blue.
    UWAGA: Przy stosowaniu H2O2 należy obchodzić się z nim ostrożnie, ponieważ jest silnym czynnikiem utleniającym i może powodować oparzenia. Noszenie środków ochrony osobistej, aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami. DTT może powodować podrażnienia skóry, oczu i układu oddechowego. Podczas pracy z DTT i H202niezbędne jest przestrzeganie odpowiednich protokołówbezpieczeństwa, aby zminimalizować ryzyko.

5. Oczyszczanie GFAP z mózgu szczurów AxD (rysunek 4A,B)

  1. Ekstrakt tkanek mózgowych za pomocą 10 mL buforu TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl i 5 mM EDTA) za pomocą homogenizatora Douce.
  2. Mózg w wirówce homogenizuje się w stężeniu 76 000x g w 4 °C przez 20 minut, a następnie wyodrębnia powstały osad 10 mL buforu Triton X-100 (1% (v/v) Triton X-100 w buforze TEN).
  3. Wirować w 76 000 xg w 4 °C przez 20 minut, a następnie wyciągać powstały pellet za pomocą 10 mL buforu sacharozowego (0,85 M sacharozy i 0,5% (v/v) Triton X-100 w buforze TEN).
  4. Wirować w 76 000 xg w 4 °C przez 20 minut, a następnie wyciągać powstały pellet za pomocą 10 ml buforu o wysokiej jakości soli (1,5 M KCl i 0,5% (v/v) Triton X-100 w buforze TEN).
  5. Wiruj w 76 000 xg w 4 °C przez 20 minut, a następnie ekstrahuj ostatni pellet za pomocą 10 mL buforu mocznika (8 M mocznika, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 5 mM EDTA).
  6. Pobierz frakcję supernatantu i dializuj na buforze kolumny Q (6 M mocznika, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA i 14,4 mM β-merkaptoetanolu).
  7. Załaduj dializy na kolumnę anionową w systemie chromatograficznym NGC.
  8. Elutuj związane białko z gradientem liniowym 0-0,5 M NaCl w buforze Q z przepływem 1 mL/min.
  9. Frakcja zawierająca GFAP w basenie i dializuj na buforze kolumny S (6 M mocznika, 20 mM MES, pH 6 i 14,4 mM β-merkaptoetanolu).
  10. Należy zastosować dializy do kolumny wymiany kationowej, a następnie eluować białka związane z liniowym gradientem 0-1 M NaCl w buforze S z przepływem 1 mL/min.
  11. Przeanalizuj eludowane frakcje za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie na niebieski oraz zbieraj te zawierające oczyszczony GFAP.

6. Analiza ubikwitynacji GFAP przez immunoblotting (Rysunek 4C)

  1. Uruchom oczyszczony GFAP na żelu SDS-PAGE 10% (z w/v).
  2. Przenieś białka z żelu do błony nitrocelulozowej.
  3. Zablokuj błonę, inkubując ją 10 mL 3% (w/v) procerum bydła w soli fizjologicznej z buforem Tris (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) zawierającej 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubuj błonę 5 μL anty-GFAP i 5 μL przeciwciał przeciwciał pierwotnych przeciwciał antyubikwityny, rozcieńczonych w 5 mL TBST w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj błonę trzy razy metodą TBST.
  5. Inkubuj błonę 5 μL przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi, rozcieńczonych w 5 mL TBST, w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Umyj błonę trzy razy metodą TBST.
  6. Rejestruj obrazy za pomocą systemu detekcji obrazu fluorescencyjnego.
  7. Przeanalizuj in vitro montaż natywnych GFAP za pomocą TEM i testów sedymentacyjnych (Rysunek 5), stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 2.1–2.13 oraz 3.1–3.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać, jak mutacje powodujące AxD wpływają na właściwości montażowe GFAP, wyprodukowaliśmy białka rekombinowane u bakterii, wykorzystując system ekspresji oparty na PET. Szczegółowo opisujemy protokoły wyrażania i oczyszczania GFAP, używając WT GFAP jako przykład. Po indukcji IPTG (Rysunek 1A, ścieżka 2), GFAP został oczyszczony w trzyetapowym procesie obejmującym przygotowanie ciała inkluzyjnego (Rysunek 1B) oraz chromatografię jonową, użyciem kolumny CM (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten ustanawia kompleksowe ramy eksperymentalne dla biochemicznej charakterystyki GFAP i jego mutantów związanych z chorobą. Dzięki zapewnieniu niezawodnego i ustandaryzowanego podejścia, ta metoda jest cennym zasobem, który poszerza naszą wiedzę o biologicznych rolach GFAP i jego patologicznych implikacjach, szczególnie w kontekście AxD. W tej sekcji omawiamy kilka kluczowych aspektów protokołu, w tym potencjalne modyfikacje i strategie rozwiązywania problemów, ograniczenia metody, jej znaczenie w porównaniu z i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) za dostarczenie szczurów R237H, które są znane z okazji. Sugestie i wsparcie prof. Albee Messinga (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) w tym badaniu są bardzo doceniane. Prace te były wspierane grantami Ministerstwa Nauki i Technologii (111-2320-B-007-008 oraz 112-2320-B-007-006 dla N.-H. L. i M.-D.P.). Dziękujemy również BioTEM z Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua (MOST-104-2731-M-007-002) za wykorzystanie sprzętu w tym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% roztwór akrylamidu/Bis 37,5:1Biorad1610158
Persiarczan amonu (APS)Biorad1610700
AmpicylinaUSB11259
Przeciwciała przeciw GFAPTechnologia sygnalizacji komórkowej12389
Przeciwciało antyubikwitynaMilliporeST 1200Klon FK2
Wirówka XP Avanti J-26SBeckman
ChloroamfenikolUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Barwnik Coomassie BlueUSB32826
Siatka miedzianaTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultracentrfugeHitachiNA
Homogenizator douncyWheaton
DTTURDTT
Szczep pLysS E. coli BL21(DE3)Agilent
EasiGlowTed Pella
Odczynnik ECLPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
Kolumna HiRes SCytiva2927 5877
Kolumna HiTrap QCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB medium (LB Agar)USB75851
LB medium (LB Broom)BD Difco244620
MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
System chromatografii NGCBioRad
Ultrawirówka Optima XE-90Beckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
poliehtyleneiminaSigma-AldrichP3143
WirnikBeckman
Wirnik S55SHitachi
Wirnik S80AT3Hitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 kozy antymysze IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 kozy antykrólikowe IgG BioRad12004161
SacharozaSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Transmisyjny mikroskop elektronowy H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Octan uraniluNauki o mikroskopie elektronowym  22400
mocznikHoneywell15604H

Bibliografia

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mutacje GFAPchoroba Alexandradysfunkcja astrocyt wsk adanie filament wagregacja bia ekmodyfikacje potranslacyjnetransmisyjna mikroskopia elektronowaoczyszczanie bia ekelektroforeza SDS PAGE
Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.