Protokół ten przedstawia krok po kroku instrukcje stworzenia urazu splotu ramiennego noworodka u szczurów, który będzie wzór w badaniach nad urazem przy porodzie ramiennym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie modelu noworodkowego szczura dla urazu urodzonego splotu ramiennego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie urazów okorodzeniowych splotu ramiennego (BPBI) było trudne ze względu na zróżnicowane objawy kliniczne oraz ograniczone wiarygodne modele zwierzęce. W tym celu opracowaliśmy protokół chirurgiczny, który powtarzalnie wywołuje uraz noworodkowego splotu ramiennego pan-plexal u 5-dniowych szczeniąt szczurów Sprague-Dawley. W tym artykule przedstawiono krok po kroku instrukcje dotyczące podejścia do splotu ramiennego u szczeniaka szczura. Technika ta została zastosowana na 15 szczeniętach szczurów Sprague Dawley. Stosując podejście grzbietowe pod mikroskopią operacyjną, wykonano 5 mm nacięcie grzbietowe, zaczynając u podstawy czaszki w kierunku przejścia kręgowego C7-T1. Tępe rozwarstwienie przeprowadza się do mięśnia czworokształtnego, a następnie przez mięśnie romboidalne i lewatora łopatkowe. Po zidentyfikowaniu anatomicznych punktów orientacyjnych, takich jak kręgosłup i łopatka, kąt górny łopatki został delikatnie cofnięty, aby zobrazować splot ramienny. Splot ramienny był zlokalizowany i wypalony, co potwierdzają obserwowalne drgawki w kończynie górnej. Aby zapobiec regeneracji nerwów, między bliższym i dalszym końcem uszkodzonych nerwów umieszczono mały blok wchłaniającej gąbki żelatynowej pomiędzy bliższym i dalszym końcem uszkodzonych nerwów. Zabieg ten został pomyślnie przeprowadzony u wszystkich 15 szczeniąt szczurów z 87% przeżywalności. Po operacji i w momencie ofiary wszystkie ocalałe szczury wykazały całkowite urazy pan-plexal, co potwierdza skuteczność i powtarzalność tego modelu w badaniach nad urazami porodowymi splotu ramiennego.
Wprowadzenie
Uraz okołoporodowy splotu ramiennego (BPBI) to uraz nerwu pourazowego, który występuje podczas porodu. Siły trakcyjne podczas skomplikowanego porodu, często spowodowane dystocją barku, przedłużającym się porodem lub makrosomią płodu, powodują osłabienie lub paraliż w dotkniętym ramieniu1. Częstość występowania waha się od 1 do 2 na 1 000 żywych urodzeń,2, 3, 4. Podczas gdy większość dzieci odzyskuje pełną funkcjonalność, 30% z nich ma objawy pozostałościowe w dorosłości, takie jak ograniczenia funkcjonalne, nierówności długości kończyn, deformacje oraz przykurcze stawów 5,6,7,8.
Model BPBI wykazuje różne wzorce urazów z implikacją dla leczenia i rokowania. Urazy splotu górnego (C5-C6, porażenie erb) są najczęstsze i w większości wiążą się z pęknięciem, a nie z awulsjami9. Natomiast urazy pan-plexal (C5-T1) często wykazują mieszany wzorzec pęknięć korzenia czaszki i aulucii ogonowych10. Avulsje to urazy przedgangliowe, które zakłócają grzbietowy zwój korzenia bez możliwości samoistnej regeneracji11.
Obecne strategie leczenia klinicznego obejmują fizjoterapię zachowawczą po wczesną mikrochirurgiczną rekonstrukcję nerwów, w zależności od stopnia ciężkości urazu12,13. Pacjenci często potrzebują operacji wtórnych, w tym uwolnienia tkanek miękkich, transferów ścięgien oraz osteotomii, aby poprawić funkcje motoryczne, jakość życia oraz wtórne konsekwencje układu mięśniowo-szkieletowego. Jednak skuteczność tych wczesnych i późnych interwencji różni się w14, 15, 16. Ponadto zmieniony rozwój układu mięśniowo-szkieletowego przyczynia się do ograniczeń funkcjonalnych, nierówności długości kończyn oraz innych deformacji, które obecnie nie podlegają leczeniu, co podkreśla potrzebę dalszych badań17,18. Dlatego nadal istnieje pilna potrzeba wiarygodnego, wykonalnego i powtarzalnego modelu zwierzęcego do zbadania tych urazów.
Modele gryzoni są powszechnie stosowane w modelach urazów splotu ramiennego, przy czym myszy są najczęstszym wyborem ze względu na opłacalność i łatwość obsługi. Jednak stworzenie powtarzalnego noworodkowego splotu ramiennego może być anatomicznie trudne ze względu na ich niewielki rozmiar. Duże modele zwierzęce, takie jak króliki, świnie i naczelne, oferują kilka zalet w tworzeniu modeli, ale kosztują znacznie wyższe19. Szczury natomiast są większe i genetycznie bardziej podobne do ludzi niż myszy, a jednocześnie pozostają znacznie bardziej opłacalne i dostępne niż większe modele zwierzęce. Dlatego nadal istnieje potrzeba posiadania możliwego i powtarzalnego zwierzęcia do badania BPBI. Badanie opisuje krok po kroku model tworzenia BPBI pan-plexal u noworodków, który może być wykorzystywany do badania mechanizmów urazów, interwencji leczniczych oraz krótko- i długoterminowych konsekwencji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zabiegi na zwierzętach były wykonywane za zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC A0007335). Technika ta została zastosowana u 15 szczeniąt szczurów Sprague-Dawley w celu oceny wykonalności i długoterminowych wyników funkcjonalnych.
1. Hodowla zwierząt
- Trzymać wielorodną ciężarną szczura Sprague Dawley (wiek ciążowy: 14 dni) w skrzynce hodowlanej (1354 cm2) zawierającej ściółkę na bazie papieru celulozowego, wzbogaconą materiałem lęgowym i wzbogaceniami klatkowymi; utrzymuj temperaturę pokojową na poziomie 21 °C, wilgotność względną 28% i cykl światła/ciemności 12:12 godzin. Zapewniaj szczurom jedzenie i wodę ad libitum.
- Czyszczenie klatek co tydzień; Nie ruszaj klatki przez 48 godzin po porodzie. Aby wspierać przyzwyczajenie się i zmniejszyć stres, zapewniaj wsparcie słuchowe poprzez delikatne obsługiwanie i mowę. W późnej ciąży zadbaj o to, by tama była przyzwyczajona do badacza poprzez codzienne, delikatne dotykanie i kondycjonowanie węchowe, wkładając do klatki waciki o zapachu etanolu i betadyny.
- Po porodzie młodych umieść smakołyki w klatce, nie przeszkadzając tamy przez 48 godzin ani nie otwierając klatki.
2. Przygotowanie materiałów
- Upewnij się, że wszystkie wymagane narzędzia chirurgiczne są przygotowane przed zabiegiem (patrz Tabela materiałów). Wszystkie materiały chirurgiczne sterylizuj za pomocą autoklawu parowego w temperaturze 121 °C przez 1 godzinę.
- Stwórz łóżko chirurgiczne z ekspandowanego polistyrenu. (Rysunek 1)
3. Przygotowanie chirurgiczne
- Wykonuj operacje na szczeniętach szczurów w wieku 5 dni [w wieku od 3 do 9 dni].
- Wprowadź znieczulenie, umieszczając szczura w komorze indukcyjnej z 2% izofluranem w 2 L/min tlenu, aż osiągnie się etap znieczulenia średniego lub głębokiego. Potwierdź odpowiednią znieczulenie delikatnym uszczypnięciem palca za pomocą szczypiec. Połóż szczeniaka szczura na podgrzanej poduszce grzewczej. Utrzymuj znieczulenie przy stężeniu 1,5-2% izofluranu w tlenie i stale monitoruj częstość oddechu.
- Określ odpowiednią dawkę środka przeciwbólowego na podstawie wagi szczeniaka. Podawaj buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (1 mg/kg s.c.) w celu łagodzenia bólu.
- Przygotuj miejsce operacji aseptycznej, nakładając trzy naprzemienne dawki betadyny i etanolu.
- Ułóż znieczulonego szczeniaka w pozycji brzucha na gotowym łóżku chirurgicznym, z nosem i pyskiem bezpiecznie umieszczonym w stożku nosa parownika izofluranowego (Rysunek 1B).
- Aby zminimalizować ruch podczas zabiegu, przyklej głowę szczeniaka szczura taśmą do waporyzatora izofluranowego i zakryj dolną część ciała, tuż poniżej górnych kończyn, folią zabezpieczającą.
4. Podejście chirurgiczne splotu ramiennego
- Wykonaj nacięcie skórne o średnicy 5 mm za pomocą ostrza nr 11, zaczynając u podstawy czaszki i rozciągając się do przejścia kręgowego C7-T1 (Rysunek 1C).
- Ostrożnie kauteryzuj tętnice powierzchniowe, unikając krawędzi skóry.
- Wykonaj tępe rozwarstwienie aż do osiągnięcia mięśnia czworocznego.
- Przecień przez czworak czworoboczny oraz mięśnie romboidalne i lewatora łopatki za pomocą kauteryzacji. Umieść kleszcze kauteryjne prostopadle do tkanki, aby uniknąć uszkodzeń termicznych krawędzi skóry.
- Delikatnie cofnij górny kąt łopatki, aby odsłonić splot ramienny. Zidentyfikuj i izoluj splot ramienny za pomocą tępego rozwarstwienia (Rysunek 1D i Rysunek 2A).
- Kauteryzuj zidentyfikowane nerwy splotu ramiennego za pomocą elektrokauteru dwubiegunowego ustawionego na 15 i potwierdź pomyślne uszkodzenie, obserwując drgawki mięśni kończyn górnych.
- Umieść mały kawałek wchłaniającej gąbki żelatynowej (około 2 mm na 2 mm) między bliższym a dalszym segmentem splotu ramiennego, aby zapobiec regeneracji nerwów (Rysunek 2B).
- Zamknij skórę za pomocą szwu 7-0 w ciągłym wzorze szwów i nałóż klej tkankowy weterynarzyjski, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się rany (Rysunek 3).
5. Zarządzanie pooperacyjne
- Połóż szczeniaka szczura na grzewcy z materiałem do gniazdowania z klatki zapory szczurów (Rysunek 4). Monitoruj częstość oddechu i ruchy szczeniaka, aż wróci do normalnych wzorców oddechowych.
- Aby zapobiec odrzuceniu przez matkę, delikatnie pocieraj szczeniaka szczurem materiałem do gniazdowania w klatce domowej, zanim odłożysz je z powrotem do matki.
- Przez pierwsze 48 godzin po operacji kontroluj szczeniaka szczura 3 razy dziennie. Jeśli zauważone są objawy bólu lub brak plam mlecznych, należy podać suplementację przeciwbólową (buprenorfina 0,05 mg/kg s.c.).
- Uważnie monitorować powikłania pooperacyjne, w tym dehiscencję rany, infekcję rany, zmniejszone czucie kończyn z możliwością automutilacji oraz kanibalizm matki.
- Waż szczeniaka szczura codziennie. Jeśli szczeniak szczura wykazuje utratę masy ciała lub brak przyrostu masy ciała przez 2 kolejne dni, należy to uznać za brak rozkwitu i przejść do eutanazji poprzez zastrzyk pentobarbitalu (390 mg/mL) dootrzewnej.
- Ocena funkcji motorycznej 1 dzień po operacji i cotygodniowa kontrola funkcji ruchowej za pomocą skali ruchu kończyn: 0 = funkcja nieobecna, 1 = funkcja częściowa, 2 = normalna funkcja symetryczna.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skuteczność techniki chirurgicznej można ocenić na podstawie braku ruchu w dotkniętej kończynie, obecności przykurczów, ograniczonego zakresu ruchu oraz, po poświęceniu, stopnia zaniku mięśni, skrócenia kończyn oraz różnic morfologicznych w kościach i mięśniach w porównaniu z kończyną niedotknioną. W tym badaniu uwzględniono łącznie 15 szczeniąt szczurów. W okresie przeżycia dwa z młodych szczurów nie rozwijały się pooperacyjnie z powodu słabego przyrostu masy ciała. Samookaleczenia zaobserwowano u 2 z 13 ocalałych szczu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje rozwój urazu splotu ramiennego u noworodka szczura, aby prowadzić badania nad krótkoterminowymi i długoterminowymi skutkami BPBI, zbadać opcje leczenia oraz zrozumieć konsekwencje.
Wcześniej opisano wykorzystanie nieinwazyjnego modelu gryzonia do badania urazu splotu ramiennego; jednak modele te nie zostały specjalnie dostosowane do odwzorowania konkretnego typu uszkodzenia nerwu21,22. Skupiając się na szczeniętach...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.
Podziękowania
Serdecznie dziękujemy dr Felicji Boynton, DVM, oraz dr Chrisowi Gow, DVM, za ich fachowe wsparcie w zakresie obsługi szczurzych szczeniąt i tam, opieki okołooperacyjnej i pooperacyjnej nad szczeniętami, które znacząco przyczyniły się do optymalizacji tego protokołu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 mL strzykawki Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Powłoka 7-0 Vicryl (Polyglactin 910) | Ethicon | J576G | |
| 70% izopropylalkohol | Vet-One | 13985-598-01 | |
| Absorbowalna gąbka żelatynowa | Surgifoam | ETH1972 | |
| Roztwór betadyny 5% mikrobiocyd antyseptyczny z povidonem-jodem | PBS Zdrowie Zwierząt | 11205 | |
| Materiał lęgowy | Łóżko Gniazda | BRN8SR | |
| Sznury dwubiegunowe | ASSI | ASSI. ATK26426 | |
| Buprenorfina (zasada 0,5 mg/mL) o przedłużonym uwalnianiu | Wedgewood Connect | 49426-0517-1 | |
| Wzbogacenie klatki | Twist 'n Rich | 10003949 | |
| Ściółka na bazie celulozy | Alpha Dri | NC2193839 | |
| Ekspandowany polistyren (styropian) | Fisher | 22-130-407 | |
| FREER skin hook | Wolniejsze | MI2152 | |
| Gillies Skin Hook półostry | DTR | GHB2001 | |
| Izoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine | E-Z Systems | EZ-190F | |
| Izofluran, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | |
| Kleszcze Jewelers Bipolar Non-Stick, 11 cm, prosta końcówka, 0,25 mm, średnica końcówki | ASSI | ASSI. BPNS11223 | |
| Styl bagnetu z mikronożyczkami | ASSI | ASSI. SNS21 | |
| Mikroskop (chirurgiczny) | Leica | M525 F40 | |
| Mikrochirurgiczne kleszcze Dumont #4 Dumont Swiss wyprodukowane 1708-4TM-PO | Ambler Chirurgiczny | 31-906 | |
| Mikrochirurgiczny uchwyt na igły | ASSI | B-14-8 | |
| Stożek nosa, 9mm, Mysz, długość 2cm | VetEquip | 921609 | |
| Fiolka do pentobarbitalu i eutanazji (390 mg/mL) 250 mL | Fatalny plus | 9373 | |
| Folia foliowa do jedzenia | Press 'n Seal | Naciśnij 'n-70-1-no3 | |
| Igły jednorazowe, 30 G | BD | 14-821-13A | |
| Stół operacyjny podgrzewany dla małych zwierząt (regulowany) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| Ostrze ze stali nierdzewnej nr 11 | Bard Parker | 371211 | |
| Sterylny ręcznik na zasłonę | Dynarex Corporation | 4410 | |
| Klej tkankowy | Vetbond 3M | NC9259532 | |
| Patyki watowe i aplikatory do drewnianej rączki | Fisher | 22-363-157 |
Bibliografia
- Johnson, G. J., Denning, S., Clark, S. L., Davidson, C. Pathophysiologic origins of brachial plexus injury. Obstet Gynecol. 136 (4), 725-730 (2020).
- Abzug, J. M., Mehlman, C. T., Ying, J. Assessment of current epidemiology and risk factors surrounding brachial plexus birth palsy. J Hand Surg Am. 44 (6), e1-e515 (2019).
- Foad, S. L., Mehlman, C. T., Ying, J. The epidemiology of neonatal brachial plexus palsy in the United States. J Bone Joint Surg Am. 90 (6), 1258-1264 (2008).
- Walsh, J. M., et al. Neonatal brachial plexus injury: Comparison of incidence and antecedents between 2 decades. Am J Obstet Gynecol. 204 (4), e1-e324 (2011).
- Pondaag, W., Malessy, M. J., van Dijk, J. G., Thomeer, R. T. Natural history of obstetric brachial plexus palsy: A systematic review. Dev Med Child Neurol. 46 (2), 138-144 (2004).
- Foad, S. L., Mehlman, C. T., Foad, M. B., Lippert, W. C. Prognosis following neonatal brachial plexus palsy: An evidence-based review. J Child Orthop. 3 (6), 459-463 (2009).
- Hoeksma, A. F., ter Steeg, A. M., Nelissen, R. G., van Ouwerkerk, W. J., Lankhorst, G. J., de Jong, B. A. Neurological recovery in obstetric brachial plexus injuries: An historical cohort study. Dev Med Child Neurol. 46 (2), 76-83 (2004).
- Pondaag, W., Malessy, M. J. The evidence for nerve repair in obstetric brachial plexus palsy revisited. Biomed Res Int. 2014, 434619(2014).
- Executive SHORT ABSTRACT: Neonatal brachial plexus palsy. Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists Task Force on Neonatal Brachial Plexus Palsy. Obstet Gynecol. 123 (4), 902-904 (2014).
- Zlotolow, D. A., Chen, C. J., Crowe, C. S., Park, E., Kozin, S. H. A novel intraoperative classification for brachial plexus birth injury based on operative findings in 162 patients. J Hand Surg Eur Vol. , (2025).
- Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-Replacing old paradigms: A review. JAMA Pediatr. 172 (6), 585-591 (2018).
- Bauer, A. S., et al. Microsurgery for brachial plexus injury before versus after 6 months of age: Results of the multicenter treatment and outcomes of brachial plexus injury (TOBI) study. J Bone Joint Surg Am. 102 (3), 194-204 (2020).
- Muhlestein, W. E., et al. Impact of timing of primary nerve surgery on shoulder, forearm, and elbow recovery in neonatal brachial plexus palsy. Neurosurgery. , (2023).
- Hulleberg, G., Elvrum, A. K., Brandal, M., Vik, T. Outcome in adolescence of brachial plexus birth palsy: 69 individuals re-examined after 10-20 years. Acta Orthop. 85 (6), 633-640 (2014).
- Sarac, C., et al. What range of motion is achieved 5 years after external rotationplasty of the shoulder in infants with an obstetric brachial plexus injury. Clin Orthop Relat Res. 478 (1), 114-123 (2020).
- Adidharma, W., et al. Shoulder release and tendon transfer following neonatal brachial plexus palsy: Gains, losses, and midline function. Plast Reconstr Surg. 146 (2), 321-331 (2020).
- Ruoff, J. M., van der Sluijs, J. A., van Ouwerkerk, W. J., Jaspers, R. T. Musculoskeletal growth in the upper arm in infants after obstetric brachial plexus lesions and its relation with residual muscle function. Dev Med Child Neurol. 54 (11), 1050-1056 (2012).
- Gosk, J., Wnukiewicz, W., Urban, M. The effect of perinatal brachial plexus lesion on upper limb development. BMC Musculoskelet Disord. 15, 116(2014).
- Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: A systematic review. Neural Regen Res. 15 (3), 491-502 (2020).
- Nikolaou, S., Peterson, E., Kim, A., Wylie, C., Cornwall, R. Impaired growth of denervated muscle contributes to contracture formation following neonatal brachial plexus injury. J Bone Joint Surg Am. 93 (5), 461-470 (2011).
- Yang, J., et al. Development of a novel experimental rat model for brachial plexus avulsion injury. Neuroreport. 26 (9), 501-509 (2015).
- Spinner, R. J., et al. Model for avulsion injury in the rat brachial plexus using passive acceleration. Microsurgery. 20 (2), 94-97 (2000).
- Hayek, A., Kuehn, C. A method for preventing maternal cannibalism after neonatal rat surgery. Lab Anim Sci. 32 (2), 171-172 (1982).
- Libbin, R. M., Person, P. Neonatal rat surgery: Avoiding maternal cannibalism. Science. 206 (4414), 66(1979).
- Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Lab Anim Sci. 42 (5), 508-513 (1992).
- Koplovitch, P., Minert, A., Devor, M. Spontaneous pain in partial nerve injury models of neuropathy and the role of nociceptive sensory cover. Exp Neurol. 236 (1), 103-111 (2012).
- Zeltser, R., Beilin, B. Z., Zaslansky, R., Seltzer, Z. Comparison of autotomy behavior induced in rats by various clinically-used neurectomy methods. Pain. 89 (1), 19-24 (2000).
- Griggs, R. B., Bardo, M. T., Taylor, B. K. Gabapentin alleviates affective pain after traumatic nerve injury. Neuroreport. 26 (9), 522-527 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
