Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

545 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

13 marca 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Streszczenie

Interfejs matczyńsko-płodowy u ludzi reprezentuje unikalne środowisko immunologiczne, w którym komórki układu odpornościowego matki i łożyskowe komórki trofoblastyczne pozabłonkowe (EVT) angażują się w bezpośredni kontakt komórkowy w celu ustanowienia i utrzymania tolerancji immunologicznej. EVT wykazują charakterystyczny immunofenotyp opisany przez ekspresję tolerogennych cząsteczek, w tym HLA-G, PD-L1 i PD-L2, które odgrywają kluczową rolę w modulowaniu reakcji odpornościowych matki. Ponadto, ludzkie EVT wyrażają HLA-C, które może być bezpośrednio rozpoznane przez macierzyste komórki NK i T i sprzyja ich aktywacji. Co ważne, brak jest ortologów HLA-C lub HLA-G w modelach zwierzęcych stosowanych do badań, a łożyskowe komórki mysie nie wyrażają MHC. Dlatego też badanie fenotypowych i funkcjonalnych właściwości ludzkich EVT z tkanki łożyska, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstawy utrzymania ciąży i patofizjologii zapalenia łożyska związanego z ciążowym nadciśnieniem tętniczym, przedwczesnym porodem, ograniczeniem wzrostu płodu i łożyskiem zaciekającym. Protokół ten opisuje kompleksową metodykę izolacji i charakteryzacji pierwotnych ludzkich EVT z tkanki łożyska zdrowych noworodków, a także po przedwczesnym porodzie i ciążowym nadciśnieniu tętniczym. Obejmuje on: (1) rozcinanie tkanki łożyska i błon płodowych; (2) enzymatyczne trawienie i przygotowanie pojedynczych zawiesin komórkowych; (3) oczyszczanie EVT przez sortowanie FACS; (4) charakteryzację fenotypowo za pomocą wielowymiarowej cytometrii przepływowej; oraz (5) krótkotrwałą hodowlę in vitro i kohodowlę z komórkami układu odpornościowego matki przez maksymalnie 96 godzin. Duży nacisk kładzie się na uzyskanie wysoce czystych i żywych EVT nadających się do dalszych zastosowań, takich jak testy funkcjonalne układu odpornościowego, analiza ekspresji białek i genów. Zastosowanie tego protokołu umożliwia uzyskanie solidnej i powtarzalnej platformy do pogłębiania zrozumienia interakcji między EVT a komórkami układu odpornościowego matki oraz ich znaczenia zarówno w ciąży zdrowej, jak i powikłanej.

Wprowadzenie

Łożysko ludzkie zawiera cztery szerokie kategorie rodzajów trofoblastów, komórek macierzystych trofoblastu, syncytiotrofoblastów, cytotrofoblastów kosmkowatych i trofoblastów pozakosmkówkowych (EVT), każda z odrębnymi funkcjami i cechami fenotypowymi. Wśród nich EVT wykazują unikalne cechy immunologiczne, w tym wysokie występowanie cząstek immunosupresyjnych, takich jak HLA-G, PD-L1, PD-L2 i członków rodziny B7, a także polimorficznego HLA-C1,2,3,4,5,6. EVT inwazyjnie penetrują głęboko tkankę maciczną, tętnice spiralne i mięsień macicy, umieszczając je w bezpośrednim kontakcie z komórkami odpornościowymi matki7. EVT charakteryzują się wyraźnym występowaniem polimorficznego HLA-C, kluczowego mediatora interakcji z komórkami T i NK matczynej, które muszą być kontrolowane, aby zachować tolerancję immunologiczną podczas ciąży. Jako jedyna klasyczna cząsteczka MHC ekspresowana przez EVT, HLA-C umożliwia też prezentację antygenu matczynym pamięciowym komórkom T i wspiera ochronę immunologiczną8. Jednak kilka badań wykazało, że EVT bezpośrednio zwiększają regulacyjne komórki T CD4 i stany tolerogenne komórek T CD8 i NK, aby chronić się przed cytotoksycznością i odrzuceniem immunologicznym9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Ponadto niektóre badania zgłaszały zmiany immunologiczne w komórkach odpornościowych matki i EVT łożysk uzyskanych po przedrzucawicy, przedwczesnym porodzie lub poronieniu w porównaniu ze zdrowymi kontrolami14,15,16,17,18,19,20,21. Kilka możliwości może leżeć u podstaw tych zmian immunologicznych, w tym i) wcześniej istniejąca nieprawidłowość komórek T matczynych; ii) upośledzone funkcje immunosupresyjne EVT; lub iii) zakłócone interakcje między dwoma typami komórek. Aby wyjaśnić podstawowe czynniki mechaniczne, ex vivo systemy modelowania eksperymentalnego, które pozwalają na ocenę interakcji komórek odpornościowych matczynych i EVT, są niezbędne.

Metody i podejścia przedstawione tutaj mają kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, które wykorzystują klasyczne linie trofoblastu, modele komórek macierzystych trofoblastu lub organoidalne. Co najważniejsze, klasyczne linie komórek trofoblastu i modele komórek macierzystych trofoblastu nie odtwarzają istotnych cech pierwotnych EVT, w tym ich profili ekspresji MHC3,5,22,23. Po drugie, złożone wymagania środowiskowe dla komórek macierzystych trofoblastu ludzkiego (hTSC) i kultur organoidów, które obejmują kilka inhibitorów molekularnych, bezpośrednio wpływają na funkcje i fenotypy komórek odpornościowych, uniemożliwiając odpowiednią ocenę interakcji EVT i komórek odpornościowych22,24,25,26,27. Wreszcie, różnorodność komórkowa kultur hTSC po różnicowaniu i wewnętrzna natura struktur organoidalnych łożyska, pozwalają na interakcje odpornościowe z rodzajami trofoblastów, które brak mają odpowiednika in vivo, zmniejszając klarowność badań22,27.

Tutaj opisujemy metody do oczyszczania pierwotnych EVT HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska końcowego, umożliwiające hodowlę do 96 h w obecności lub bez populacji komórek odpornościowych. W środowisku nie ma inhibitorów molekularnych, które wpływają na funkcje EVT i komórek odpornościowych, zachowując ich żywotność. To podejście zapewnia wartościową platformę do bezpośrednich ex vivo badań interakcji EVT i komórek odpornościowych w ciąży zdrowo przebiegającej i powikłanej. Oczekuje się, że przyczyni się do odkrycia kluczowych czynników tolerancji immunologicznej matczyno-płodowej i zidentyfikowania celów terapeutycznych do rozwiązania zapalenia łożyska.

Protokół

Komisja Etyki Badań Instytucjonalnego w Cincinnati Children's Hospital zatwierdziła ten protokół badawczy (Zezwolenie nr 2021-0336), który spełnia wymagania dotyczące rozważań bioetycznych, postępowania z informacjami osobowymi, patogenami zakaźnymi i procedur uzyskania zgody na udzielenie informacji zgodnie z prawem amerykańskim. Każde laboratorium powinno uzyskać zgodę zgodną z krajowymi wytycznymi badań przed rozpoczęciem eksperymentu.

Niniejszy protokół koncentruje się na hodowlanośc w pierwotnych HLA-G+ EVT, które utrzymują żywotność do 96 godzin dla wtórnego badania funkcjonalnego poprzez udoskonalenie naszego poprzedniego protokołu2,28. Odnoś się do Hamiltona i wsp.2 w celu ustanowienia linii komórek przypominających HLA-G+ EVT i Ikumi i wsp.28 do zaangażowania dopasowanych limfocytów z macierzyńskiej śluzówki macicy.

1. Przygotowanie laboratorium (dzień 0).

UWAGA: Do obsługi próbek używaj szafki biobezpieczeństwa klasy II (BSL2).

  1. Ustaw dwa kąpiele wodne o 39 °C i 37 °C. Ustaw skondycjonowany inkubator CO2 w 37 °C.
  2. Przygotuj 1x PBS, Medium myjące A, Medium myjące B, Medium hodowlany EVT A, B i C (Tabela 1 i Tabela 2).
  3. Odtapiaj 15 mL 10 mg/mL roztworu DNase I (Tabela 1) i 500 mL 0,25% Trypsyny/EDTA w kąpieli wodnej w 37 °C.
  4. Umieść pojemnik wypełniony roztworem biocydalnym/wirusobójczym (np. 10% bielacza) w szafie BSL2 do zbierania płynnych odpadów. Ustaw pojemnik na odpady z workiem do odpadów biologicznie niebezpiecznych w szafie BSL2.
  5. Przygotuj podkładki pochłaniające, sterylne narzędzia do sekcji (kleszcze z zakrzywionymi końcówkami i nożyczki 6 3/4"), sterylne metalowe filtry, stojaki na probówki i sterylne 50 mL stożkowe probówki w szafie BSL2.
  6. Przygotuj trzy 50 mL stożkowe probówki (dwie z 1x PBS każda i jedną z Medium myjącym A na zbiórkę kawałków tkanki łożyskowej podczas sekcji.

2. Pobieranie próbek (dzień 0)

UWAGA: Użyj ludzkich łożysk z błonami płodowymi uzyskanych drogą cięcia cesarskiego między 24 a 42 tygodniem ciąży. Łożysko dostarczone naturalnie może dać mniej EVT.

  1. Zacznij przetwarzać łożysko natychmiast w szafie BSL2, najlepiej w ciągu 1-2 godzin od porodu, aby zmaksymalizować wydajność żywych komórek. Zachowaj łożysko w temperaturze pokojowej przez cały czas.
  2. Sprawdź łożysko i, jeśli to konieczne, zarejestruj jego rozmiar, wagę i ogólny wygląd morfologiczny.

3. Sekcja tkanki (dzień 0)

  1. Sekcja błony
    1. Umieść łożysko zwrócone stroną płodową do góry (część wstawiania pępowiny widoczna). Usuń amnion, który jest warstwą błony najbliżej strony płodowej, poprzez ręczne ściągnięcie od bocznej błony w kierunku ujścia pępowiny; wyciąć i wyrzucić amnion.
    2. Przeciąć błonę choriodecydualną na paski o długości 2 cali, zaczynając od podstawy łożyska w górę, pozostawiając pas błony choriodecydualnej przymocowanej do łożyska.
    3. Umieść pasek błony choriodecydualnej dwoma palcami zwróconymi stroną śluzówkową do góry i delikatnie zeskrob śluzówkę maciczną z chorionu za pomocą sterylnych kleszczy z zakrzywionymi końcówkami.
      UWAGA: Pracuj efektywnie i nie pozwól, aby błona chorionu wyschła.
    4. Zbierz błonę chorionu do 50 mL stożkowej probówki z 20 mL Medium myjącego A.
    5. Zbierz śluzówkę maciczną do izolacji limfocytów śluzówkowych w 50 mL stożkowej probówce z 20 mL PBS i postępuj zgodnie z protokołem opisanym przez Ikumi i wsp. w zakresie izolacji limfocytów28.
    6. Wytnij błonę chorionu nożyczkami w probówce 50 mL, aż stanie się mniejszymi kawałkami o powierzchni mniejszej niż 2 mm2.
      UWAGA: Idealna ilość osadzonej błony po wycięciu to 30 mL.
    7. Wyrzuć Medium myjące A i przemyj PBS-em kilkakrotnie, aż nadstanie staje się czysty.
  2. Sekcja łożyska
    1. Umieść łożysko zwrócone stroną macierzystą do góry i usuń skrzepy krwi. Przetnij kawałki łożyska (długość 2 cm, szerokość 2 cm, głębokość 0,5 cm) używając sterylnych nożyczek, unikając części martwicy, skamielin lub niedokrwienia.
    2. Umieść kawałek śluzówki podstawowej na palcach zw

Wyniki

Oczekiwane plony komórek

Z 15 mL ścięgna gruczołowego oczekuje się, że plony HLA-G+ EVT wynoszą 0,1-0,3 × 106 komórek z pierwszego trawienia i 0,1-0,6 × 106 komórek z drugiego trawienia (łącznie 0,2-0,8 × 106 komórek). Z 30 mL błony kosmówkowej oczekuje się, że plony HLA-G+ EVT wynoszą 0,4-1,0 × 106 komórek z pierwszego trawienia i 0,4-1,5 × 106 komórek z drugiego trawienia (łącznie 0,8-2,5 × 106 komórek). Oczekuje się, że proporcja caspase 3/7- 7-AAD- żywych EVT w izolatów wynosi 90-95%.

Pierwotna kultura EVT HLA-G+

Analiza cytometrii przepływowej markerów pochodzenia (HLA-G, HLA-C, EGFR) i markerów śmierci komórkowej wykazała, że ten protokół zapewnia żywą pierwotną kulturę EVT do dnia 4 (96 h po posadzeniu posortowanych EVT) (Rysunek 1B-D). Pokazano reprezentatywne obrazy mikroskopu świetlnego pierwotnych chorionowych i d.basalis HLA-G+ EVT po 24, 48 i 72 h kultury (Rysunek 2A-F).

Kokultura pierwotnych HLA-G+ EVT z limfocytami T

Ten protokół poprawił żywotność pierwotnych EVT 96 h po izolowaniu z łożyska, co jest poprawą w porównaniu z naszym poprzednim raportem1,2,10. Dlatego umożliwia analizę odpowiedzi EVT po kokulturze z wstępnie stymulowanymi limfocytami, co naśladuje ostre zapalenie na granicy macierzyńsko-płodowej. EVT wyrażają polimorficzne HLA-C, jak również immunosupresyjne cząsteczki ko-hamujące, takie jak PD-L1, PD-L2, PVR (znane również jako CD155), B7H3 i HLA-E, zgodnie z wynikami barwienia cytometrii przepływowej pozakomórkowej (Rysunek 3A,B). EVT zwiększyły ekspresję HLA-C, jak również PD-L1, PD-L2 i HLA-E, ale nie zwiększyły ekspresji PVR i B7H3, gdy były kokulturowane z aktywowanymi limfocytami przez 72 h zgodnie z sekcją protokołu 8 (Rysunek 4A,B). Ponadto nie zaobserwowano wzrostu śmierci EVT, co wykazano za pomocą barwienia 7AAD i caspase 3/7 (Rysunek 4C,D).

Rysunek 1
Rysunek 1. Strategia bramek dla sortowania komórek EVT i wykresów cytometrii przepływowej po kulturze posortowanych EVT. (A) Reprezentatywna strategia bramek dla sortowania EVT ścięgna gruczołowego i EVT kosmówkowych. R1 to brama dla żywych komórek na wykresie Forward-Side Scatter. R2 to brama dla wykluczenia leukocytów CD45+. R3 to brama dla HLA-G+EGFR+EVT. R4 to 7-AAD-caspase3/7- żywe EVT. Chociaż brama R4 nie jest konieczna do sortowania, jest tu pokazana, aby wykazać żywotność pierwotnych EVT. (B) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej posortowanych HLA-G+EGFR+EVT, po 96 h kultury in vitro. (C,D) Częstotliwości caspase 3/7- 7-AAD- żywych EVT podczas sortowania (dzień 0) i 96 h kultury (dzień 4). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2
Rysunek 2. Morfologia EVT podczas kultury in vitro. Reprezentatywne obrazy mikroskopu świetlnego kosmówkowych EVT po (A) 24 h, (B) 48 h i (C) 72 h kultury oraz EVT ścięgna gruczołowego po (D) 24 h, (E) 48 h i (F) 72 h kultury. Skala pozioma = 50 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3
Rysunek 3. Feno

Dyskusja

Kluczowe kroki w protokole

Aby uzyskać żywe EVT, kluczowe jest rozpoczęcie izolacji komórek z łożyska natychmiast po porodzie i wykonanie wszystkich procedur od izolacji do sortowania w temperaturze pokojowej. Ponieważ EVT są większe i bardziej adhezywne w porównaniu z limfocytami, należy podjąć następujące środki ostrożności, aby uniknąć zatykania się podczas sortowania: i) przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 µm przed sortowaniem, ii) użyć medium zawierającego DNase do zawiesiny komórek, iii) unikać nadmiernego koncentratu zawiesin komórek (idealnie ~1 × 10⁶ komórek/mL), oraz iv) użyć wielkości dyszy co najmniej 100 µm. Sorter Jet-in-Air (np. Bigfoot, MoFlo) osiąga wyższy wydajność żywych EVT w porównaniu z sorterami komórek opartymi na technikach płynowych (np. sortery BD, Sony Nano).

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą

Nadmierny lub niedostateczny proces trawienia po pierwszym trawieniu EVT z decydualnej bazalnej

Efektywność trawienia tkanki decydualnej bazalnej różni się między łożyskami. Nadmiernie strawione tkanki tworzą duże, lepkie agregaty, które są trudne do przepuszczenia przez metalowe sita. Zazwyczaj dodanie 10-30 mL Medium do płukania B pomaga rozproszyć te agregaty podczas filtracji. Jeśli to nie rozwiąże problemu, dodaj 1-2 mL DNase bezpośrednio do tkanek. Jeśli pierwsze trawienie wynika w nadmiernym strawieniu, zmniejsz stężenie Koktajlu Enzymów do Trawienia Tkanki z 80% do 70% na drugie trawienie. Po filtracji pierwszego trawienia objętość pozostałej tkanki powinna zmniejszyć się do mniej niż połowy. Jeśli objętość pozostałej tkanki nie ulegnie zmianie, zwiększ stężenie Koktajlu Enzymów do Trawienia Tkanki z 80% do 90-100% na drugie trawienie. Tkanki błony kosmówkowej są jednolicie strawione w łożyskach. Dlatego dostosowywanie stężenia koktajlu enzymów do trawienia tkanki jest generalnie niepotrzebne.

W przypadku trawienia większych objętości tkanki niż te opisane w powyższym protokole

W przypadku trawienia więcej niż 30 mL błony kosmówkowej lub więcej niż 15 mL tkanki decydualnej bazalnej, użyj dodatkowych butelek z Koktajlem Enzymów do Trawienia Tkanki. Zwiększenie objętości tkanki w pojedynczej butelce zwykle prowadzi do niedostatecznego trawienia.

Ograniczenia metody

Mniejszy wydajność EVT jest oczekiwany w przypadku łożysk dostarczonych naturalnie. EVT nie może być krioprezerwowane przed lub po sortowaniu, ponieważ są wrażliwe na stres zamrażania i rozmrażania, co znacznie ogranicza ich żywotność i funkcjonalność. Dlatego ten protokół nie zawiera żadnego punktu zatrzymania.

Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących metod

Wcześniej opisaliśmy protokół do ustanowienia linii komórek podobnych do EVT-jakich HLA-G+ z łożysk końcowych za pomocą Medium do hodowli tkankowej B i płytek pokrytych kolagenem. Jednak kilka inhibitorów w medium i kolagenie potencjalnie wpływa na funkcjonowanie limfocytów T w systemie współhodowlanym2. Inne wcześniejsze doniesienia, które nie używały Medium do hodowli tkankowej B, pozwoliły na ocenę limfocytów T w współhodowli, ale nie EVT z powodu zmienności komórek1,10. Zaletą obecnego protokołu jest minimalizowanie wpływu medium hodowlanego, jednocześnie umożliwiając hodowlę żywych pierwotnych EVT. Ten protokół zapewnia platformę eksperymentalną do badania funkcji immunologicznych EVT i ich funkcjonalnych zmian w odpowiedzi na otaczające komórki odpornościowe – obszar, który był słabo zbadany.

Oświadczenia

Nie ma żadnego konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Sherry Thornton oraz Research Flow Cytometry Core z Działu Reumatologii w Cincinnati Children's Hospital Medical Center za całą pomoc w zakresie cytometrii przepływowej i sortowania komórek; wszystkim pielęgniarkom i lekarzom z uczestniczących szpitali za wysiłki w zbieraniu materiałów łożyskowych; wszystkim członkom laboratorium Tilburgs oraz wykładowcom immunologii z CCHMC za pomocne dyskusje; Ta praca została wsparta przez NIH R01HD116852 (T.T.); Cincinnati Children's Research Foundation (T.T.); Burroughs Wellcome Fund Next Gen Pregnancy Award #NGP10115 (T.T.); oraz grant współpracy March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. jest wspierany przez granty JSPS KAKENHI Numery 22KK0287 i 25K12697.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Bibliografia

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja HLA Gtkanka o yskainterfejs matczyno p odowytolerancja immunologicznacytometria przep ywowasortowanie FACScharakterystyka fenotypowainterakcja kom rek odporno ciowychtrawienie enzymatyczne

Powiązane artykuły