Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

496 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69547

⸱

20 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Precision Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 2Shandong Provincial Key Medical and Health Laboratory of Ovarian Cancer Multiomics, & Jinan Key Laboratory of Cancer Multiomics, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 3School of Medicine, Wayne State University, 4Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, 5Hunan Clinical Medical Research Center for Cancer Pathogenic Genes Testing and Diagnosis,, 6Department of The 1st General Surgery, The Third Xiangya Hospital, Central South University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Streszczenie

Glejak to pierwotne złośliwe guzy ośrodkowego układu nerwowego o istotnej częstości występowania i śmiertelności. Angiogeneza guza jest cechą rozpoznawczą patofizjologii glejaka i stanowi ważne wydarzenie w środowisku nowotworowym. Nieprawidłowa struktura neowaskularyzacji guza pełni podwójną rolę: jest źródłem składników odżywczych oraz przerzutowym portalem umożliwiającym inwazję komórek nowotworowych do krwiobiegu. Terapia antyangiogeneza to gorący temat w dziedzinie nowotworów. Większość wcześniejszych badań koncentrowała się na czynnikach aktywujących i hamujących angiogenezy guza; Jednak to wyjaśnia angiogenezę guza tylko w bardzo ograniczonym zakresie. Nieprawidłowa ekspresja białek lub modyfikacje potranslacyjne przyczyniają się do nieprawidłowej morfologii naczyń krwionośnych w glejaku. Protokół ten wykorzystywał mikroskopię laserową (LCM) do izolacji i oczyszczania odpowiedniej ilości tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka, co było wykorzystywane do analizy ilościowej proteomiki znakowanej izotopami do identyfikacji różnicowo ekspresowanych białek w tkankach neowaskularnych glejaka w porównaniu z grupą kontrolną. Dane te stanowią kluczową podstawę naukową do wyjaśnienia patologicznych mechanizmów angiogenezy nowotworów, odkrywania celów terapeutycznych antyangiogennych oraz konstruowania biomarkerów opartych na angiogenezie nowotworów.

Wprowadzenie

Glejaki to wysoce heterogeniczne guzy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) pochodzące z komórek glejowych, które zapewniają strukturalne i metaboliczne wsparcie neuronom1, i są histologicznie klasyfikowane na podtypy: astrocytomy, oligodendrogliomy oraz ependymomy2. Według systemu oceniania WHO, glejaki w stopniach I i II to glejaki niskiego stopnia (LGG), zazwyczaj charakteryzujące się powolnym tempem wzrostu i potencjalną długoterminową stabilnością, często podatnymi na chirurgiczne usunięcie ze względu na położenie anatomiczne. Natomiast stopnie III i IV to glejaki wysokiego stopnia (HGG), przeważnie niezróżnicowane i złośliwe, o wysoce inwazyjnych zachowaniach i złym rokowaniu3. Obecne leczenie pozostaje ograniczone i w dużej mierze nieskuteczne; Chociaż maksymalna bezpieczna resekcja w połączeniu z radioterapią/chemioterapią pooperacyjną umiarkowanie poprawia rokowanie, istotne ograniczenia i toksyczność pozostają z powodu rozproszonego, infiltracyjnego wzrostu guzów oraz niewyraźnych granic uniemożliwiających radykalną resekcję 4,5. Glejaki ludzki, zwłaszcza o wysokim stopniu glejaków, to wysoce naczyniowe nowotwory, których wzrost, proliferacja i inwazja silnie zależą od nieprawidłowej neowaskularyzacji, co jest kluczową cechą nowotworową glejaka 6,7. Badanie ukierunkowane na angiogenezę guza ma istotne zasługi naukowe dla przełomów terapeutycznych.

Angiogeneza zasadniczo polega na proliferacji, migracji i różnicowaniu komórek śródbłonka śródbłonka pod wpływem określonych bodźców, a badania koncentrują się na regulatorach: (i) induktorach, w tym czynniku wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)8, wazorynie (VASN)9, czynniku indukującym hipoksję 1 (HIF1)10, czynniku transformującym wzrost β (TGF-β)11, endokanu12, czynniku wzrostu pochodzącego z płytek krwi (PDGF)13 oraz czynniku wzrostu naskórka (EGF)14; oraz (ii) inhibitory, w tym angiostatyna15, endostatyna16, receptor aktywujący płytki krwi-1 (TSP-1)17 oraz tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMPs)18. W badaniach klinicznych fazy I/II/III dotyczących guza mózgu większość leków antyangiogennych celuje w sygnalizację VEGF ze względu na jej centralną rolę w angiogenezie, na przykład w przypadku bevacizumabu, przeciwciała monoklonalnego hamującego neowaskularyzację poprzez blokadę VEGF 19,20,21. Jednak ostatnie badania fazy II/III nie wykazały istotnych korzyści z całkowitego przeżycia u pacjentów z zaawansowanym glejakiem otrzymywającym bevacizumab plus lomutynę w porównaniu z samą lomustyną 19,20,21,22. Co istotne, terapia anty-VEGF poprawia nieprawidłowości naczyniowe, ale hamuje angiogenezę bez bezpośredniej cytotoksyczności nowotworowej i może wywołać oporność na leczenie. W konsekwencji celowanie w pojedynczy lub kilka regulatorów angiogennych nie prowadzi do radykalnego leczenia; Skuteczne strategie wymagają jednoczesnego hamowania angiogenezy oraz blokady inwazji i przerzutów guza poprzez szlaki naczyniowe. Wartość diagnostyczna i prognostyczna białek w glejakach jest dobrze udokumentowana, jednak leczenie złośliwych glejaków odnotowało ograniczone postępy na przestrzeni dekad.

Proteomika może globalnie analizować wszystkie białka w próbkach biologicznych, w tym profile ekspresji, modyfikacje posttranslacyjne (PTM) oraz interakcje, korzystając z technik opartych na spektrometrii masowej (MS), w tym podejścia odgórne (TDP) i oddolne (BUP). Rozsiana rozsiana o wysokiej przepustowości umożliwia identyfikację dziesiątek tysięcy białek w jednym cyklu, co sprawia, że jest niezbędna do badania mechanizmów nowotworowych i identyfikacji celów terapeutycznych. Obfitość białka i jego PTM można zidentyfikować w tkankach glejaka oraz biopsjach płynnych, takich jak krew i jej pochodne 23,24,25, płyn mózgowo-rdzeniowy 26 oraz mocz27. W przypadku naczyń nowotworowych nieprawidłowe ekspresje białek i PTM wywołują patologiczne zmiany naczyń. Zmiany białkowe w neowaskularyzacji glejaka można zidentyfikować za pomocą proteomiki, która napędza rozwój protokołu umożliwiającego wiarygodne profilowanie proteomiczne neowaskularyzacji glejaka.

Jednak tkanki neowaskularne są tylko jednym z elementów całej tkanki glejaka. Izolacja i oczyszczanie tkanek neowaskularnych od całych tkanek glejaka jest kluczowym krokiem do dokładnej ilościowej analizy proteomiki angiogenezy glejaka. Mikrodyssekcja laserowa (LCM)28,29,30,31 to skuteczne podejście izolujące i oczyszczające tkanki nowonaczyniowe z całych tkanek glejaka. Bardzo trudno jest uzyskać odpowiednią ilość białek tkanek neowaskularnych do ilościowej proteomii. W 2007 roku zespół badawczy próbował wykorzystać LCM do oddzielenia tkanek neowaskularnych od glejaka IV stopnia w celu analizy proteomicznej, która zidentyfikowała tylko cztery białka z MS32. Następnie, w 2012 roku, nieprzerwanie stosowano LCM do wzbogacania tkanek neowaskularnych glejaka IV stopnia do analizy ilościowej proteomiki, która zidentyfikowała tylko 29 białek z MS33. Te dwa badania proteomiki glejaka i angiogenezy wykazują bardzo niską przepustowość proteomiczną w angiogenezie glejaka angiogenezy, co nie jest w stanie odzwierciedlać złożonego krajobrazu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Protokół ten opracował procedurę umożliwiającą pozyskanie wystarczającej ilości białek neowaskularnych do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy glejaka, tworząc tym samym szeroko zakrojony krajobraz proteomiczny angiogenezy nowotworów. Ma to istotne znaczenie naukowe dla odkrycia skutecznych biomarkerów opartych na angiogenezie oraz terapeutycznych celów/leków przeciw angiogenezie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten dotyczący próbek tkanek ludzkich został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Medycznej Pierwszego Uniwersytetu Medycznego w Shandong (nr R202211090133), a osoby i jego rodziny uzyskały świadomą zgodę. Próbki glejaka użyte w tym badaniu pochodzą z neurochirurgicznych próbek odciętych z oddziału neurochirurgii w Xiangya Hospital Uniwersytetu Central South University, w tym 7 przypadków tkanek astrocytoma stopnia III. Prawidłowe naczynia kontrolne (n = 3) zostały pobrane z mikronaczyń w uszkodzonej tkance mózgowej usuniętej w wyniku urazu mózgu. Wszyscy pacjenci byli po raz pierwszy uczestnicami bez wcześniejszej radioterapii lub chemioterapii przed operacją, a diagnozę postawił u nich oddział patologii Xiangya Hospital na Central South University. Trzy prawidłowe kontrolne tkanki naczyniowe pozyskano podczas neurochirurgicznej resekcji bardzo małych naczyń krwionośnych z prawidłowego uszkodzenia mózgu przez zewnętrzną siłę (bez glejaka) w szpitalu Xiangya. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wykorzystanie LCM do izolacji tkanek neoowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego

  1. Przygotowanie szkiełka LCM: Ręcznie pokryj membranę naftalanu polietylenu (PEN) na wielokrotnego użytku metalowe preparaty i przechowuj preparaty powlekane w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Do bezpośredniego przyklejania zamarzniętych tkanek będą używane gotowe metalowe preparaty.
  2. Przygotuj roztwór barwienia toluidynowego (0,5%): rozpuścić 0,25 g toluidynowego błękitu w 40 mL dH₂O. Dodaj jedną tabletkę inhibitora proteazy i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia. Reguluj objętość do 50 mL z ddH₂O, filtruj i przechowuj w lodzie.
  3. Tkanka procesowa: Utrzymywanie kriostatu w temperaturze roboczej (-25 °C komory/głowica próbki). Pobierz tkankę glejaka z magazynu w temperaturze -80 °C, przenieś na lód, usuń krew za pomocą papieru filtrującego i wybierz odpowiednie bloki tkanek do osadzenia.
  4. Protokół osadzania tkanek: Dysk preparatu wstępnie schładza. Nałóż medium osadzające i szybko wgnij blok tkanki. Zamroź cały blok w temperaturze -25 °C przez 10 minut, aby utwardzić.
  5. Przecinanie tkanek i naczyń przesiewowe: Przecinanie tkanek o grubości 8 μm. Montaż przekrojów tkanek na standardowych preparatach, barwienie tkanek roztworem barwienia na błękit toluidynowy oraz przesiewanie naczyń neowaskularnych pod mikroskopią optyczną.
    UWAGA: Jeśli nie wykryto naczyń, odrzuć 3–5 przekrojów tkanek i powtórzyć cykl barwienia aż do pojawienia się obszarów naczyń nowo-naczyniowych.
  6. Zamontuj tkankę tkanki z dodatnim naczyniem na przygotowanym szkiełku LCM: Przenieś przekroje z dodatnim naczyniem na preparaty LCM pokryte PEN, uszczelnić, oznaczyć i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Mocowanie tkanek na szkiełkach LCM w schłodzonym etanolu 70% (4 °C, 1–2 min); drenaż i barwi na 0,5% błękitu toluidynowego (4 °C, 30 s); Odcedź bejcę, spłukni dwukrotnie w ddH₂O (4 °C; dwie oddzielne kąpiele myjne), odcedź, inkubuj w roztworze inhibitora proteazy (30 s) i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  8. Uruchom instrument LCM wcześniej, nagrzej przez 30 minut, użyj lasera na podczerwień półprzewodnikowy do podgrzania przez kolejne 30 minut, a następnie zainstaluj mikrowirówkę w rurce zbierającej 500 μL.
  9. Załaduj plasterki LCM zamontowane na próbce tkanki (przechowywane w temperaturze -80 °C) na przygotowany instrument LCM i dostosuj ostrość na naczynia neowaskularne w tkankach glejaka przy pomocy kompatybilnego oprogramowania.
  10. Precyzyjnie wyznacz linię znakowania laserowego wzdłuż zewnętrznej krawędzi naczynia neowaskularnego (omijając ścianę naczyniową), użyj lasera do wypalenia i rozdzielenia naczyń nowonaczyniowych, a następnie zbierz je do nasadki rurki EP.
    UWAGA: Użyj drugiego oparzenia laserowego, aby upewnić się, że naczynia neowaskularne całkowicie się odłączyły.
  11. Odwróć i zamknąć pobraną probówkę z naczynia neowaskularnego oraz przechować ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja białek z tkanek neowaskularnych glejaka izolowanego przez LCM oraz ilościowa zawartość białek

  1. Przygotuj bufor do ekstrakcji białek zawierający 4% siarczan sodu dodecylowy (SDS), 1 mM ditiotreitolu (DTT) oraz 150 mM Tris-HCl (pH 8,0).
    UWAGA: SDS to niebezpieczny pył, który silnie podrażnia oczy, skórę i drogi oddechowe, który musi być ważony w okapie spalinowym; a DTT to środek drażniący, który trzeba ważyć w okapie spalinowym.
  2. Ponownie zawiesij tkanki naczynia neowaskularnego glejaka zebranego przez LCM w buforze ekstrakcyjnym. Sonikat w kąpieli lodowowodziowej przez 1 minutę, aby uzyskać pełną lizę.
  3. Wiruj w 16 000 x g przez 10 minut, a następnie przelej supernatant do nowych rurek mikrowirówek.
  4. Aliquot minimalny supernatant do ilościowego określenia białka. Dodaj DTT do pozostałego supernatantu (końcowe stężenie: 1 mM DTT), delikatnie mieszaj przez pipetowanie, aby uniknąć powstawania bąbelków. Zachowaj i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  5. Wykonaj badanie białka kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Przygotuj roztwór roboczy (Odczynnik A:B = 50:1).
    2. Przygotuj standardową dawkę albuminy surowicy bydłej (BSA) (0,5 mg/mL).
    3. Dodaj odpowiadające im rozwiązania zgodnie z Tabelą 1.
    4. Wymieszaj próbki/standardy z roztworem roboczym i przelej na płytę z 96 dołkami.
    5. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut.
    6. Zmierz absorpcję na poziomie 562 nm.
    7. Oblicz stężenia względem krzywej standardowej.

3. Wykorzystanie ilościowej proteomiki do analizy przygotowanych białek neowaskularnych

  1. Przygotuj próbki tryptycznych peptydów wyekstrahowanych białek neowaskularnych.
    1. Do każdej pobranej próbki białka (guza; kontrola) dodaje się lodowato zimny aceton (próbka: aceton = 1:5, v/v), dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę. Wirować w temperaturze 12 000 x g (4 °C) przez 15 minut. Usuń supernatant w celu usunięcia odczynników do ekstrakcji białek (SDS, DTT i Tris-HCL) i ponownie zawiesij pellet w buforze rozpuszczalnym 20 μL z 1 μL 1% SDS.
      UWAGA: Używaj acetonu przy odpowiedniej wentylacji, podczas gdy nosisz okulary ochronne, trzymaj się z dala od źródeł zapłonu i utylizuj odpady w specjalnym, iskrzącym pojemniku.
    2. Dodaj 2 μL odczynnika redukującego (DTT) do każdej próbki, dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę. Dodaj 1 μL odczynnika blokującego cysteinę (jodoacetamid), a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Dodaj trypsynę (białko: trypsyna = 20:1, v/v) do każdej próbki. Mieszanie wirów i inkubacja w 37 °C przez noc.
  2. Do oznaczania przygotowanych tryptycznych peptydów używaj odczynników Izobaric Targ for relative and absolute quantification (iTRAQ).
    UWAGA: W tym protokole do oznaczania tryptycznych próbek peptydów (guz; kontrola) używa się sześcio-plexowych odczynników iTRAQ (tagi plex 113, 114, 115, 116, 117 i 118), każdy typ próbki jest oznaczany trzykrotnie (Tabela 2).
    1. Każdą rurkę z odczynnikiem iTRAQ rekonfunduj z 50 μL izopropanolem.
    2. Dodaj próbki peptydów tryptycznych do odpowiednich probówek z odczynnikiem, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    3. Zakończ reakcje, dodając ultraczystą wodę o objętości 3× objętości, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Równo łącz oznaczone sześć próbek, dokładnie mieszaj i liofilizuj.
  3. Użyj silnej wymiany kationowej (SCX) do frakcjonowania próbki tryptycznej peptydu znakowanej iTRAQ.
    1. Rekonstytuować liofilizowane peptydy w roztworze A o pojemności 2 mL (10 mM KH₂PO₄, 25% ACN, pH 2,7). Załaduj na funkcjonalizowaną kolumnę wymiany kationowej sulfoetyloetem (4,6 × 100 mm, 5 μm, 200 Å).
    2. Eluty o stałym przepływie 1 mL/min przy użyciu roztworu B (500 mM KCl, 10 mM KH₂PO₄, 25 % ACN, pH 2,7): 0 %→10 % (2 min) → 10 %→20 % (25 min) → 20 %→45 % (5 min) → 50%→100% (5 min). Monitoruj ciśnienie 214 nm przez cały proces, pobieraj co minutę na probówkę, co daje łącznie 30 frakcji.
    3. Każdą frakcję skoncentruj przez wirowanie próżniowe, a następnie rekonfunduj za pomocą 40 μL kwasu trifluorooctowego o stężeniu 0,1% (v/v) (TFA). Wszystkie 30 frakcji przechowywanych jest w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      UWAGA: TFA jest wysoce żrące i toksyczne, powoduje poważne uszkodzenia skóry i oczu oraz podrażnia układ oddechowy; należy go obsługiwać w okapie z odpowiednią ochroną osobistą, w tym rękawiczki odporne na kwasy, gogle i fartuch laboratoryjny, a odpady muszą być zbierane jako odpady kwaśne.
  4. Do analizy każdej frakcjonowanej próbki peptydu używaj LC-MS/MS.
    1. Do odsolania użyj wkładu do ekstrakcji fazy stałej C18 (standardowa gęstość, średnica warstwy 7 mm, objętość 3 mL).
    2. Użyj kolumny do chromatografii cieczowej odwróconej fazy C18 (LC) (długość 10 cm, 75 μm i.d., żywica 3 μm) do eluowania 10 μL każdej frakcji za pomocą roztworu C (0,1 % kwasu mrówkowego) i gradientu roztworu D (80 % acetonitrylu i 0,1 % kwasu mrówkowego) w tempie 250 nL/min przez 140 minut.
    3. Wprowadzanie peptydów rozdzielonych LC do spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości do analizy MS/MS online.
    4. Konwertuj surowe pliki widma (.raw) wygenerowane przez Q Exactive do formatu .mgf za pomocą Proteome Discoverer 1.4, a następnie przesyłaj te pliki .mgf do serwera MASCOT 2.2, wbudowanego modułu oprogramowania do wyszukiwania w bazie danych.
      UWAGA: Baza danych Uniprot (łącznie 146 704 sekwencje; pobrana 20 lipca 2025 z http://www.uniprot.org) jest używana z szczegółowymi parametrami wyszukiwania (Tabela 3).
    5. Pobierz powstałe pliki wyszukiwania (.dat) z serwera MASCOT i powrót do Proteome Discoverer 1.4. Dane do filtracji przy progu fałszywego wykrywania (FDR) <0,01 w celu uzyskania identyfikacji o wysokiej pewności.
    6. Zidentyfikuj sekwencję aminokwasów białek na podstawie danych MS/MS, ilościowo określ obfitość białek za pomocą intensywności jonów reporterowych iTRAQ.
    7. Oblicz eksperymentalną powtarzalność, aby określić wartość graniczną białek różnicowo ekspresowanych (DEP) wraz z istotnością p<0,05.
      UWAGA: W tym badaniu wartość odcięcia jest określana jako zmiana foldu (FC) > 1,4, co skutecznie usuwa błędy systematyczne.
  5. Przeanalizuj funkcjonalne cechy glejaka neowaskularnego DEP.
    1. Uzyskaj dostęp do DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, wersja 6.7; https://david.ncifcrf.gov/) stronie głównej oraz wybierz Start Analysis w menu pasku, aby rozpocząć analizę.
    2. Wybierz lewy panel służy jako interfejs do przesyłania; Wprowadź ID białek lub genów do pola wejścia Step 1 zgodnie z żądaniem (korzystając z funkcji kopiowania-wklejania).
    3. W kroku 2 wybierz typ identyfikatora odpowiadający przesłanym białkom; w tym badaniu wykorzystano UniProt Accession.
    4. W kroku 3 wybierz listę genów lub ustawienia tła: Analiza wzbogacania genów wymaga wyboru zestawu genów tła. System domyślnie przyjmuje cały genom gatunku lub użytkownicy mogą przesłać niestandardową listę białek/genów jako tło.
    5. Kliknij na Listę przesłaj, aby przesłać zgłoszenia i rozpocząć analizę.
      UWAGA: Wyniki analizy są wyświetlane po prawej stronie panelu "Podsumowanie adnotacji". Użytkownicy mogą wybierać wyniki według potrzeb analitycznych; badanie to konkretnie wykorzystało listę GOTERM_BP_FAT do analizy procesów biologicznych związanych z DEP.
    6. Uzyskaj procesy biologiczne (BP), komponenty komórkowe (CC), funkcje molekularne (MF) oraz szlaki KEGG dla glejaka neowaskularnego DEP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Uzyskano wystarczającą ilość próbek białek izolowanych przez LCM do ilościowej proteomiki

Aby uzyskać wiarygodne profile proteomiczne białek różnicowo ekspresowanych w tkankach neowaskularnych glejaka (glejaka), badanie to wybrało najczęstszy podtyp glejaka – astrocytoma stopnia III oraz izolowane tkanki nowonaczyniowe (LCM) ze względu na dostępność wzbogaconych naczyń nowonaczyniowych. Ponadto proteomika ilościowa wymaga ≥400 μg białka na próbkę. Badanie to wykorzystało techn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

LCM w połączeniu z ilościową proteomiką znakowania izotopowego zidentyfikowało pierwszy na dużą skalę profil proteomiczny angiogenezy glejaka

Angiogeneza guza jest kluczową patologiczną cechą glejaków, ściśle związaną z ich wysoką inwazyjną i opornością terapeutyczną 6,7. Tradycyjne terapie antyangiogenne (takie jak inhibitory VEGF) wykazują ograniczoną skuteczność kliniczną z powodu monotonii docelowej i oporności kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Chińskie Narodowe Fundusze Naukowe na rzecz Przyrody (81272798 do X.Z. oraz 82203592 przez N.L.), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong (ZR2022QH112 do N.L.), Specjalne Fundusze Inżynieryjne Prowincji Taishan Taishan (NO.tstp20221143 do X.Z.), Chiński Narodowy Program Talentów Zagranicznych Ekspertów (H20240743; Ekspert zagraniczny: X.Z.), oraz Pierwszy Projekt Badawczy Naukowy Uniwersytetu Medycznego w Shandong w rozwijających się strategicznych dziedzinach (202403).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płyta 96-studniowaThermo Fisher Scientific (USA)468667Materiały jednorazowe
AcetonReagent NanJing (Chiny)C0720114023Odczynnik
AcetonitrylMerck (Chiny)CN34892Odczynnik
Zestaw do testowania białek BCAAbcam (Wielka Brytania)ab102536Odczynnik
Standardem albuminy surowicy bydłej (BSA)Solarbio (Chiny)PC0001-1Odczynnik
Rurka wirówkowa (50ML)Kirgen (Chiny)KG2811Materiały jednorazowe
Mikrotom kriostatuLeica (Niemcy)Około 1900 rokuWyposażenie
CysteinaAladyn (Chiny)C108238Odczynnik
DL-Dithiothreitol(DTT)Amresco (USA)D8220Odczynnik
Kolumna HPLC z odwróconą fazą EASY-Spray C18Thermo Scientific (USA)ES800AMateriały jednorazowe
Elektroniczna wagaSartorius (USA)BSA224SWyposażenie
Ośrodek osadzającyLeica (Niemcy)39475237Materiały jednorazowe
Kartridże Empore SPE C18Sigma-Aldrich (USA)66872-UMateriały jednorazowe
Metr EppendorfKirgen (Chiny)KG2211Materiały jednorazowe
Papier filtrującyCytiva (USA)Klasa 42Materiały jednorazowe
Kwas mrówkowyAladyn (Chiny)F112032Odczynnik
Szklana zlewkaSHUBO (Chiny)1015479Materiały jednorazowe
Cylindr z graduacją szklanąSHUBO (Chiny)1601Materiały jednorazowe
‌ Chromatografia cieczy o wysokiej rozdzielczości – spektrometria masThermo Scientific (USA)Q-ExactiveWyposażenie
Izolowany pojemnikFhefon (Chiny)LCZYX-12Materiały jednorazowe
Mikroskop odwrócony Leica (Niemcy)XDS-1Wyposażenie
JodoacetamidSolarbio (Chiny)I8010Odczynnik
IzopropanolAladyn (Chiny)I112018Odczynnik
odczynniki iTRAQSigma-Aldrich (USA)4381663Odczynnik
KClBeyotime (Chiny)ST1596Odczynnik
KH2PO4Shanghai YuanYe (Chiny)S24278Odczynnik
Mikrodyssekcja laserowego przechwytywaniaLeica (Niemcy)LMD 6000Wyposażenie
Szkiełko mikroskopii laserowegoLeica (Niemcy)3800040Materiały jednorazowe
Jednorazowe ostrza Leica o profiluLeica (Niemcy)14035838926Materiały jednorazowe
Pojemnik z ciekłym azotemKEYICRYO (Chiny)YDS-3Wyposażenie
Magnetyczny mieszadło płyt grzewczychShanghaiSILE (Chiny)LAB-0002-0068-SHSLWyposażenie
Czytnik mikropłytTECAN (Szwajcaria)INFNITE F200Wyposażenie
PEN  MembranaLeica (Niemcy)11505189Materiały jednorazowe
Miernik pHSartorius (USA)PB-10Wyposażenie
PipetaEppendorf (Niemcy)3123000268Wyposażenie
PipetaEppendorf (Niemcy)3123000241Wyposażenie
PipetaEppendorf (Niemcy)3123000225Wyposażenie
PoliSULFOETHYL APolyLC Inc (USA)104SE0303Materiały jednorazowe
Inhibitor proteazyRoche (Szwajcaria)05892791001Odczynnik
Wirówka chłodzonaBeckman (USA)AllegraTM X-22RWyposażenie
LodówkaMEILING (Chiny)BCD-180KCTWyposażenie
Siarczan dodecylosiarczan sodu (SDS)Amresco (USA)1027P033Odczynnik
Słoik do barwieniaBeyotime (Chiny)FG005Materiały jednorazowe
Łypacz ze stali nierdzewnejMuzixing (Chiny)XYS-101Materiały jednorazowe
PoradyKirgen (Chiny)KG1313Materiały jednorazowe
Roztwór barwienia błękitu toluidynowegoSigma-Aldrich (USA)198161-5G/198161-25GOdczynnik
Kwas trójfluoroctowyAladyn (Chiny)T103293Odczynnik
Tris-HClAmresco (USA)T8230Odczynnik
Roztwór trypsyny-EDTASolarbio (Chiny)T1300Odczynnik
Zamrażarka o ultra-niskiej temperaturzeSanyo (Japonia)MDF-382EWyposażenie
Ultraczystość oczyszczacza wodyELGA (Wielka Brytania)PureLAB flexWyposażenie
Zakłócacz ogniw ultradźwiękowychQSONICA (USA)Q500Wyposażenie
Liofilizacja próżniowaThermo (USA)SNL 315SVWyposażenie
Mieszacz wirowyTechnologia kryształowa i Przemysł (USA)HYQ-3110Wyposażenie
Inkubator kąpieli wodnejInstrument technologiczny Shanghai Yiheng (Chiny)HWS-26Wyposażenie
Papier wagowyCole-parmer (USA)133802Materiały jednorazowe

Bibliografia

  1. Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
  2. Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
  3. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  4. Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
  5. Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
  6. Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
  7. Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
  8. Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
  10. Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
  11. Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
  12. Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
  13. Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
  14. Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
  15. Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
  16. Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
  17. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  18. Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
  19. Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
  20. Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
  21. Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
  22. Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
  23. Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
  24. Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
  25. Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
  26. Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
  27. Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
  28. Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
  29. Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
  30. Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
  31. Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
  32. Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
  33. Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
  34. Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
  35. Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
  36. Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
  37. Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
  38. Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
  39. Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
  40. Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
  41. Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
  42. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
  43. Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
  44. Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Angiogeneza glejakalaserowa mikrodysekcjaunaczynienie guzaróżnicowa ekspresja białekanaliza LC-MS/MSsieć oddziaływań białkowychbiomarkery nowotworoweterapia antyangiogenna
Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.