Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

528 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69548

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnej izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakem (CAF) oraz fibroblastów niezwiązanych z nowotworem (CF) u tego samego pacjenta z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Wykorzystanie tych materiałów dopasowanych do pacjentów mogłoby uniknąć problemów związanych z zmiennością między pacjentami i zapewnić odpowiednią platformę eksperymentalną dla badań ESCC.

Streszczenie

W przypadku raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) nabycie oporności na leczenie oraz nawroty guza pozostają poważnym wyzwaniem klinicznym. Fibroblasty związane z rakem (CAF), kluczowe składniki mikrośrodowiska guza, są znane z wpływu na progresję ESCC i odpowiedź terapeutyczną. Jednak wiele aspektów roli CAF w nowotworze pozostaje nieznanych, prawdopodobnie ze względu na zmienność między pacjentami u pacjentów ESCC. Uważa się, że różne ludzkie linie komórkowe ESCC dostępne do badań częściowo naśladują charakter ludzkiego raka. Są również rozmnażane in vitro przez lata i dekady w szalce Petriego, co pozwala na adaptację do warunków hodowlanych. Ponadto ludzkie linie komórkowe ESCC wykazują różne zmiany genetyczne i epigenetyczne, charakterystyczne dla pierwotnych pacjentów, co skutkuje zmiennością między pacjentami. Niemniej jednak, długoterminowe hodowle komórek nowotworowych były wykorzystywane w większości wcześniejszych badań do eksperymentów z niedopasowanymi CAF pacjenta. Zmienność między pacjentami w obrębie każdej linii nowotworowej oraz między komórkami nowotworowymi a CAF może zatem powodować obniżoną powtarzalność i wiarygodność wyników. Aby wyeliminować zmienność między pacjentami, z tego samego pacjenta wyizolowano trzy odrębne typy komórek: organoidy nowotworowe i CAF z chirurgicznie rozciętego regionu ESCC oraz odpowiedniki fibroblastów (CF) z sąsiedniego obszaru nienowotworowego jako specyficzne dla pacjenta kontrolne dla CAF. Przedstawiony jest szczegółowy protokół umożliwiający jednoczesną izolację organoidów nowotworowych, CAF i CF. Organoidy nowotworowe dobrze rosły w warunkach trójwymiarowych. CAF i CF pozytywnie barwiły wimentynę, jeden z markerów fibroblastów, wspierając wzbogacenie tych komórek w liniach fibroblastycznych. Opisany protokół pozwala nam ustalić organoidy ESCC oraz fibroblasty dopasowane do pacjenta, zapewniając cenną platformę eksperymentalną, która wyklucza zmienność między pacjentami w badaniu interakcji guz-stromal.

Wprowadzenie

Rak przełyku wiąże się z wysoką częstością występowania i śmiertelnością na całym świecie1. Ogólnie dzieli się go na dwa główne podtypy histologiczne: raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) oraz gruczolakoraka przełyku (EAC)2. ESCC jest bardziej powszechne niż EAC, z szczególnie wyższą zachorowalnością w Azji Wschodniej i Afryce3. Strategie leczenia ESCC są stosunkowo dobrze ugruntowane 4,5. W przypadku wczesnych zmian ograniczonych do warstwy śluzowej wskazana jest endoskopowa resekcja jako metoda lecznicza i minimalnie inwazyjna. U pacjentów z miejscowo zaawansowaną, ale resekcyjną chorobą, połączenie neoadjuwantnej chemoradioterapii i ezofagektomii wykazało skuteczność kliniczną. W przypadkach nieresekowalnych lub przerzutowych chemioterapia ogólnoustrojowa pozostaje podstawą leczenia. Niemniej jednak oporność terapeutyczna i nawroty choroby nadal stanowią poważne wyzwania kliniczne.

Guzy składają się nie tylko z komórek nowotworowych, ale także ze złożonego mikrośrodowiska nowotworowego obejmującego różne typy komórek stromalnych. Wśród nich fibroblasty związane z rakiem (CAF), główne komórkowe składniki mikrośrodowiska guza, odgrywają kluczową rolę w postępie guza i terapeutycznej reakcji 6,7,8,9. W ESCC coraz częściej zgłaszano udział CAF w nowotworach i oporności na leczenie. 10,11,12. Jednak dokładne molekularne mechanizmy CAF leżące u podstaw nowotworów ESCC pozostają w dużej mierze niejasne.

W większości wcześniejszych badań wpływ CAF na komórki nowotworowe oceniano za pomocą różnych linii komórkowych ESCC propagowanych w szalkach Petriego przez wiele lat, a nawet dekad. Takie linie komórkowe dostosowałyby się do warunków hodowli i niewiele przypominałyby oryginalne guzy13. Ponadto linie komórkowe ESCC pochodzą od różnych pacjentów i wykazują różne zmiany genetyczne oraz epigenetyczne, które są wyraźnie odrębne w poszczególnych komórkach ESCC, pełniąc rolę zmienności między pacjentami. Wyniki eksperymentalne z jednej linii komórek nowotworowych często mogą być niezgodne z wynikami z innej linii nowotworowej. Dlatego eksperymenty z wykorzystaniem różnych linii komórkowych ESCC oraz niedopasowanych CAF do pacjenta mogą utrudniać precyzyjne i wiarygodne uwzględnienie interakcji tych komórek.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowano protokół polegający na jednoczesnym izolowaniu organoidów nowotworowych dopasowanych do pacjenta, CAF oraz fibroblastów nienowotworowych (CF) z tego samego preparatu chirurgicznego ESCC. Organoidy pochodzące od pacjentów zazwyczaj odtwarzają kluczowe cechy architektoniczne i fenotypowe pierwotnych guzów, zachowując jednocześnie heterogeniczność molekularną. Ustalone organoidy tworzyły sferoidy w warunkach trójwymiarowej (3D) hodowli i wykazywały stabilną zdolność proliferacji. Zarówno CAF, jak i CF zostały potwierdzone jako wzbogacone w populacjach komórek fibroblastowych z dodatnim uwzględnieniem vimentyny, markera fibroblastu.

Protokół ten zawiera szczegółowe, powtarzalne kroki dotyczące przetwarzania tkanek, dysocjacji enzymatycznej, zasiewania organoidów, izolacji CAF/CF, przepuszczania oraz krioprezerwacji. Aby pomóc naukowcom ocenić przydatność przed wdrożeniem, uwzględniono praktyczne informacje: organoidy zazwyczaj tworzą się w ciągu 3–5 dni, osiągają gotowość do przejścia w ciągu 7–10 dni i mogą być stabilnie rozszerzane o ponad dziesięć fragmentów. CAF i CF mogą być przekazywane przez co najmniej osiem pokoleń. Organoidy i fibroblasty mogą być krioprezerwowane w ciągu około 20 dni. Wskaźniki sukcesu w zakładach sięgają około 70% dla organoidów oraz 80% dla CAF i CF. Ponadto uwzględniono zwalidowany test warunkowany z użyciem podłoża warunkowanego CAF lub CF, co zapewnia solidne podejście do oceny parakrynnych efektów komórek stromalnych na zachowanie organoidów nowotworowych. Łącznie ta dopasowana platforma organoid–stromal nowotworowa oferuje eksperymentalnie dostępny i biologicznie istotny model do badania interakcji między guzem a stromalem ESCC oraz wspierania rozwoju precyzyjnych strategii terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem tkanek ludzkich muszą być wykonywane zgodnie z odpowiednimi instytucjonalnymi zatwierdzeniami bezpieczeństwa biologicznego oraz w certyfikowanej szafie bezpieczeństwa biologicznego. Pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę, a projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań Wydziału Medycyny Uniwersytetu Juntendo. Przegląd procedury od protokołów 2 do 6 przedstawiono na Rysunku 1. Skład i stężenia każdego składnika w ośrodku organoidalnym ESCC (Eso_v1) zostały określone na podstawie badań Kijima i in.14 oraz innych badań15, 16, 17, z jedynie drobnymi modyfikacjami. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Odczynniki i przygotowanie tkanek

  1. Przygotuj odczynniki i sprzęt.
    1. Przed rozpoczęciem zabiegu sterylizuj wszystkie narzędzia, w tym nożyczki, kleszcze i pipety.
    2. Przygotuj 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w probówce o pojemności 15 mL.
    3. Przygotuj probówki o niskim przyczepieniu 15 ml i oznaczaj je według pochodzenia próbki (np. probówka do płukania guza (A), probówka do trawienia guza (B), probówka do przepłukania bez nowotworów (C), probówka do trawienia bez nowotworów (D)).
    4. Okładanie pipet roboczych poprzez aspirację i podawanie surowicy płodowej bydła (FBS) 2–3 razy, aby zmniejszyć przyczepność komórek podczas przetwarzania.
      UWAGA: Powłoka FBS zapobiega przyklejaniu fragmentów tkanek do powierzchni plastiku podczas dysocjacji mechanicznej.
  2. Przygotuj roztwory enzymów
    1. Przygotuj roztwór enzymów I do trawienia guza, mieszając 2,7 mL Zmodyfikowanego Medium Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS oraz 1x penicylin-streptomycyny (PS) (dalej DMEM/10% FBS), 0,3 mL kolagenazy 10 mg/mL, 0,15 mL dipazy 10000 PU/mL oraz 0,03 mL 2,5 μg/mL amfotericyny B. Rozgrzej do 37 °C.
    2. Przygotuj roztwór enzymów II do trawienia nieguzowego, mieszając 2,7 mL DMEM/10% FBS, 0,3 mL kolagenazy 10 mg/mL oraz 0,03 mL 2,5 μg/mL amfoterycyny B. Rozgrzać do 37 °C.
      UWAGA: Kolagenaza i dyspaza ułatwiają dysocjację tkanki nowotworowej.
  3. Przygotowanie pożywki hodowli organoidów
    1. Przygotuj pożywkę organoidalną ESCC (Eso_v1 medium) zawierającą 60% podstawowego pożywki organoidalnej, 40% podłoża kondicjonowanego L-WRN18 (patrz krok 1.4), 50 ng/mL EGF (czynnik wzrostu), 1 mM N-acetylo-L-cysteiny (Antyoksydant), 5 mM nikotynamidu (witamina rozpuszczalna w wodzie), 500 nM A83-01 (inhibitor TGF-βR (zapobiegający wzrostowi fibroblastów)), 1x B-27 (suplement hodowli bez surowicy), 1x N-2 (suplement hodowli bez surowicy), oraz 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK).
    2. Przed użyciem wyrównaj podłoże do 37 °C.
      UWAGA: Ośrodek warunkowany L-WRN (supernatant z komórek L-WRN) dostarcza sygnały WNT, R-spondin i Noggina niezbędne do inicjacji organoidów. Y27632 jest obecny w medium przez cały okres hodowli.
  4. Przygotuj medium kondycjonowane L-WRN
    1. Rozmroź fiolkę z komórkami L-WRN i nasiew je na naczyniu o średnicy 100 mm z 10 mL DMEM/10% FBS i hoduj przez 1–2 dni.
    2. Zamień podłoże na 10 mL DMEM/10% FBS zawierającego G418 (ostateczne 500 μg/mL) i hygromycynę B (ostateczne 500 μg/mL) i hoduj do osiągnięcia 80% zbiórki.
    3. Przeprowadzić komórki na dwie naczynia o średnicy 100 mm z 10 mL DMEM/10% FBS (z G418 i hygromycyną B) i hodować do osiągnięcia 100% zbieżności.
    4. Przeprowadzić komórki na pięć miseczek o średnicy 150 mm z 20 ml DMEM/10% FBS (bez antybiotyków) na mikę i hodować do 100% konflugencji.
    5. Z każdej misy o średnicy 150 mm zasysaj i wyrzuć podłoże.
    6. Dodaj 25 ml na każdą miskę z podłożem zbiorczym (organoidalne podłoże bazalne wzbogacone o 5% FBS).
    7. Inkubuj przez 24 godziny.
    8. Zbierz medium ze wszystkich pięciu naczyń (25 mL × 5 = 125 mL) do sterylnej szklanej butelki.
    9. Powtórz kroki 1.4.6–1.4.8, aby uzyskać łącznie 8 zbiorów (docelowa objętość zgromadzona: ~1 000 mL).
    10. Sterylnie filtruj CM za pomocą filtra na butelce.
    11. Podawaj 40 mL do 25 sterylnych probówek po 50 mL.
    12. Przechowywać alikwoty w temperaturze −80 °C.
  5. Przygotuj pożywkę hodowlową fibroblastów
    1. Przygotuj fibroblast-medium-1.
    2. Przed użyciem wyrównaj podłoże do 37 °C.
  6. Przygotuj naczynia do obsługi chusteczek
    1. Rozłóż kilka (od trzech do pięciu) kropli FBS z końcówką P1000 na dwie naczynia o średnicy 100 mm, aby uzyskać powłokę (Dish T dla tkanki nowotworowej, Dish N dla tkanek nienowotworowych).
      UWAGA: Powłoka FBS ułatwia płynniejsze mechaniczne mielenie i zapobiega przyleganiu drobnych fragmentów tkanek do powierzchni naczynia.
  7. Obsługa tkanek i identyfikacja próbek
    1. Potwierdź, że próbki guza i nienowotworowe są transportowane na lodzie.
    2. Umieść chusteczki na misce o średnicy 60 mm zawierającej niewielką ilość DMEM/10% FBS i przechowywaj w lodzie do czasu użycia. Rozpocznij przetwarzanie w ciągu 16 godzin od resekcji chirurgicznej, aby utrzymać żywotność.
    3. Rozpoznaj tkankę nowotworową po jej jędrnej strukturze i nieregularnej morfologii powierzchni, która różni się od tkanek nienowotworowych.

2. Przetwarzanie tkanek, mycie i trawienie enzymatyczne

UWAGA: Ten etap polega na trawieniu podrobnionych fragmentów tkanek guzowych i nienowotworowych różnymi roztworami enzymatycznymi.

  1. Zmielić guz i tkanki nienowotworowe
    1. Przenieś każdą próbkę tkanki (około 5 mm × 5 mm) na odpowiednią miskę pokrytą FBS (Dish T dla tkanki nowotworowej i Dish N dla tkanki nienowotworowej).
    2. Każdą tkankę pokrój na fragmenty o średnicy ~0,5 mm za pomocą sterylnego skalpela.
      UWAGA: Mniejsze fragmenty zwiększają dostępność enzymatyczną i poprawiają efektywność trawienia.
  2. Umyj posiekaną tkankę.
    1. Posmaruj pipetę 10 mL FBS, aby zapobiec przyczepianiu się tkanek.
    2. Dodaj 5 ml PBS do każdego naczynia za pomocą pipety pokrytej FBS i delikatnie ponownie zawiesij posiekaną tkankę.
    3. Przenieś zawiesinę do odpowiedniej rurki do płukania nowotworów (Rurka A) lub Nienowotworowej Rurki do Płukania (Rurka C).
    4. Powtarzaj kroki 2.2.2 i 2.2.3 (całkowita objętość: 10 mL).
    5. Pozwól rurkom stać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej; usuń supernatant, pozostawiając około 0,5–1 mL PBS i tkanki na dnie.
    6. Dodaj 10 ml świeżego PBS z nową pipetą; po pokryciu pipety FBS, mocno napiń zawieszenie, unikając powstawania pęcherzyków.
      UWAGA: Siłowe pipetowanie wspomaga mechaniczną dysocjację oraz usuwanie krwi i śluzu. Unikanie pęcherzyków zapobiega lizie komórek wywołanej ścinaniem. Wszystkie etapy mycia mają na celu usunięcie zanieczyszczeń.
    7. Pozwól rurkom stać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej; usuń supernatant, pozostawiając około 0,5–1 mL PBS i tkanki na dnie.
    8. Powtórz procedurę mycia (kroki 2.2.6 i 2.2.7) dwukrotnie, co daje łącznie trzy mycia.
  3. Przenieś tkanki do rurek trawiennych.
    1. Dodaj 10 ml świeżego PBS z nową pipetą; po pokryciu pipety FBS przenieś tkankę nowotworową do rurki trawiennej guza (Rurka B), a tkankę nienowotworową do rurki trawienniczej bez nowotworów (Rurka D).
    2. Pozwól tubkom stać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, usuń supernatant, pozostawiając około 0,5 mL PBS i tkanki na dnie.
  4. Wykonaj trawienie enzymatyczne.
    1. Trawienie tkanki nowotworowej
      1. Dodaj całą objętość roztworu enzymu I (kolagenaza + dispasz) do rurki trawiennej guza (probówka B).
      2. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2 godziny z delikatnym obrotem.
    2. Trawienie tkanek nienowotworowych
    3. Dodaj całą objętość roztworu enzymu II (tylko kolagenaza) do probówki trawiennej bez nowotworów (Tube D).
      1. Inkubuj w 37 °C przez 4 godziny z delikatnym obrotem.
    4. Kontynuuj do kroku 3 (Przetwarzanie próbki nowotworu) lub kroku 6 (Odpowiednik fibroblastów), w zależności od pochodzenia próbki.
      UWAGA: Rodzaje enzymów używanych do trawienia tkanek nowotworowych i nienowotworowych, a także czas przetwarzania, zostały określone na podstawie wcześniejszej optymalizacji eksperymentalnej. Tkanki nowotworowe często zawierają gęstą macierz zewnątrzkomórkową; Dyspaza w połączeniu z kolagenazą zwiększa zdolności trawienne.

3. Przetwarzanie próbek nowotworowych do izolacji organoidów i CAF

UWAGA: Ten etap polega na izolacji komórek guzowych nabłonka w celu powstania organoidów oraz fibroblastów stromalnych (CAF) z tych samych strawionych próbek nowotworów.

  1. Filtruj i zbieraj komórki pochodzące z nowotworów.
    1. Umieść sitko ogniwa 100 μm na stożkowej rurce o pojemności 50 mL.
    2. Zwilż sitko, przepuszczając przez nie 3 mL DMEM/10% FBS.
      UWAGA: Wstępne zwilżanie zmniejsza utratę komórek, zapobiegając przyleganiu do suchych włókien siatkowych.
    3. Przelej całą zawartość rurki do trawienia guza (Tuba B) na sitko za pomocą końcówki P1000 pokrytej FBS, aby usunąć niestrawione fragmenty tkanki.
    4. Dodaj dodatkowe 6 ml DMEM/10% FBS, aby przepłukać resztki przez sito.
    5. Usuń sitko i zwróć filtrat do rurki B (można też użyć nowej niskoprzyczepnej rurki 15 mL).
  2. Przemyj i skoncentruj filtrat.
    1. Wiruj rurkę w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
    2. Usuń supernatant za pomocą jednorazowej pipety.
    3. Dodaj 10 ml DMEM/10% FBS, delikatnie wymieszaj przez inwersję i ponownie wiruj w 300 × g przez 5 minut.
    4. Ostrożnie zasysaj supernatant, zachowując granulkę.
    5. Zmniejsz pozostałą objętość do 40 μL za pomocą pipety P200.
  3. Alokować komórki do hodowli organoidów i CAF.
    1. Przeznacz 30 μL na zasiewanie organoidów.
    2. Przeznacz 10 μL na siew CAF.
      UWAGA: Ten stosunek empirycznie zapewnia wystarczające populacje nabłonka i fibroblastu do równoległego rozszerzania.

4. Siewnictwo organoidów (kultura 3D)

UWAGA: Ten krok ma na celu ustanowienie organoidów ESCC z zawiesiny komórkowej pochodzącej od nowotworów.

  1. Przygotuj kopuły matrycy z błony podstawnej.
    1. Podgrzej standardową płytkę z 24 dołkami do 37 °C.
      UWAGA: Wstępne podgrzewanie płyty przyspiesza krzepnięcie kopuł matrycy błony podstawowej.
    2. Wymieszaj 30 μL zawiesiny pochodzącej z nowotworu z 90 μL lodowatej matrycy błony podstawnej (stosunek 1:3).
    3. Na cztery otwory należy nałożyć 30 μL na kopułę.
    4. Pozwól kopułom zastygnąć przez 15 minut w inkubatorze CO₂.
  2. Dodaj pożywkę hodowlę organoidów
    1. Przygotuj pożywkę organoidalną z gotowymi suplementami (FGF10, SB202190 oraz antybiotykami, takimi jak 1× amfocerycyna B i 100 μg/mL Primocin, jeśli stosuję).
      UWAGA: Studnia 1: Eso_v1; Studnia 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Studnia 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Studnia 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (końcowe stężenia).
    2. Delikatnie dodaj 1 ml medium do każdej dołki wzdłuż ściany.
    3. Inkubować w standardowych warunkach hodowli CO₂.
    4. Zmieniaj medium co 3–5 dni.
      UWAGA: Wstępne mieszanie suplementów eliminuje konieczność pipetowania małych objętości bezpośrednio na delikatne kopuły matrycy membrany podstawowej. Antybiotyki dodaje się tylko w ciągu pierwszych 6 dni po ustanowieniu organoidów. Warunki hodowli (FGF10 +/-, SB202190 +/-) są określane na podstawie tempa wzrostu i morfologii (najlepiej kulistej).
  3. Monitoruj powstawanie organoidów.
    1. Codziennie obserwuj kopuły za pomocą odwróconego mikroskopu.
      UWAGA: Oczekiwana morfologia: Dzień 3–5 → widocznych sferoidów; Dzień 7–10 → gęste sferoidy gotowe do przejścia.
    2. Przepuszczenie organoidów po osiągnięciu rozmiaru około 100–200 μm lub wykazanie stłoczenia kopuły o poziomie 90% lub więcej.

5. Rozsiew CAF

UWAGA: Ten krok ma na celu utworzenie CAF z zawiesiny komórkowej pochodzącej z nowotworów.

  1. Nasiaj CAF na talerz pokrytym kolagenem.
    1. Przygotuj naczynie o średnicy 60 mm pokryte kolagenem, zawierające 1,5 mL fibroblastu medium-1.
    2. Dodaj 10 μL filtratu nowotworowego przeznaczonego na zasiew CAF.
    3. Dodaj antybiotyki, takie jak 1× amfocerycyna B oraz 100 μg/mL Primocin.
    4. Inkubować w standardowych warunkach hodowli CO₂.
    5. Zmieniaj medium co 3–5 dni.
      UWAGA: Empirycznie fibroblast-medium-1 jest często bardziej odpowiedni niż inne podłoża do początkowego powstawania i wzrostu CAF i CF. Antybiotyki dodaje się tylko w ciągu pierwszych 6 dni.
  2. Monitorowanie wzrostu CAF
    1. Obserwuj wygląd morfologii wrzeciona przypominającej fibroblasty od około 3–5 dni.
    2. Fibroblasty przejściowe z łącznością 90%–100%.
      UWAGA: Jeśli dojdzie do skażenia komórek nabłonkowych, fibroblasty można selektywnie izolować poprzez dostosowanie czasu trypsynizacji, ponieważ fibroblasty odłączają się szybciej niż komórki nabłonkowe podczas przechodzenia.

6. Rozstawienie CF

UWAGA: Ten etap ma na celu uzyskanie dopasowanych do pacjenta CF z sąsiednich tkanek nienowotworowych.

  1. Umyj i przygotuj trawienie nienowotworowe.
    1. Wirówka w probówce trawiennej bez nowotworów (probówka D) na 300 × g przez 5 minut.
    2. Usuń supernatant za pomocą jednorazowej pipety.
    3. Dodaj 10 ml DMEM/10% FBS, delikatnie wymieszaj przez inwersję i ponownie wiruj w 300 × g przez 5 minut.
    4. Ostrożnie zasysaj supernatant, zachowując granulkę.
    5. Powtórz kroki 6.1.3 i 6.1.4 jeszcze raz.
  2. Nasiewaj CF na naczynie pokryte kolagenem
    1. Przełóż całą zawiesinę na talerz o średnicy 60 mm pokrytą kolagenem, zawierającą 1,5 mL fibroblastu medium-1.
    2. Dodaj antybiotyki, takie jak 1× amfocerycyna B oraz 100 μg/mL Primocin.
    3. Inkubować w standardowych warunkach hodowli CO₂.
    4. Zmieniaj medium co 3–5 dni.
      UWAGA: Antybiotyki są dodawane tylko w ciągu pierwszych 6 dni.
  3. Monitoruj wzrost mukowiscydozy.
    1. Obserwuj morfologię wrzeciona przypominającego fibroblast, zaczynając od 3–5 dni.
    2. Fibroblasty przejściowe z łącznością 90%–100%.

7. Przekazywanie organoidów i krioprezerwacja

  1. Przechodzenie organoidów.
    UWAGA: Celem tego etapu jest rozszerzenie organoidów, gdy osiągną odpowiednią gęstość.
    1. Aspiruj starą podłożę i przemyj każdy dołek 1 mL PBS.
    2. Dodaj 0,5 ml podgrzanej trypsyny jako organoidu do każdego dołku.
    3. Pipetuj energicznie końcówką P1000, wykorzystując jej krawędź do rozbicia kopuły matrycy membrany podstawowej.
      UWAGA: Mechaniczne ścinanie pomaga rozkładać gęstą matrycę błony podstawnej, poprawiając dostęp enzymatyczne.
    4. Inkubuj przez 10–15 minut w inkubatorze CO₂, aż wszystkie grudki żelowe się rozpuszczą. Rozdziel organoidy na 20–50 skupiska komórek.
      UWAGA: Unikaj pełnej dysocjacji pojedynczej komórki, ponieważ zmniejsza ona żywotność.
    5. Zbierz zawieszenie do niskomocnej rurki 15 mL.
    6. Przepłucz dołek cztery razy 0,5 mL DMEM/10% FBS i przelej wszystkie płukania do tej samej niskoprzylegającej rurki.
    7. Wiruj probówkę na 300 × g przez 5 minut.
    8. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulkę w minimalnym DMEM/10% FBS; reguluj objętość zawieszenia do 80 μL.
    9. Wymieszaj 80 μL zawiesiny organoidalnej z 240 μL lodowato zimnej matrycy błony podstawowej (stosunek 1:3).
    10. Umieść mieszankę na podgrzanej płytce z 6 dołkami (37 °C), z 4–6 kopułami na odwór.
    11. Pozwól kopułom zastygnąć przez 15 minut, a następnie dodaj 3 mL Eso_v1 medium (skład optymalny w początkowej hodowli na etapie 4,2) na odwiert.
    12. Zmieniaj medium co 3–5 dni.
      UWAGA: Organoidy są przechodzine, gdy osiągają średnicę około 100–200 μm lub gdy stłoczenie kopuły przekracza 90%. Nie jest wykonywane liczenie komórek. W rutynowych podkulturach organoidy dzieli się w stosunku 1:4 do 1:10. Szybka regeneracja sferoidów spodziewana jest w ciągu 48–72 godzin.
  2. Krioprezerwacja organoidów
    1. Każdą studnię przemyj 3 ml PBS.
    2. Dodaj 1,5 mL trypsyny jako organoidu do każdego dołka, intensywnie pipetuj i inkubuj przez 10 minut.
    3. Zbierz całe zawieszenie do niskomocowatej rurki 15 mL i opłukaj odkrycie cztery razy.
    4. Wiruj rurkę w 300 × g przez 5 minut i usuń supernatant.
    5. Ponownie zawiesij granulek w 2 ml 90% FBS/10% DMSO.
    6. Ilość 0,5 mL do każdego kriovialu.
    7. Umieść fiolki w mroźnym pojemniku i przechowuj je na noc w temperaturze −80 °C.
    8. Przelej fiolki do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.
      UWAGA: Organoidy są zaliczane, gdy osiągają średnicę około 100–200 μm lub gdy stłoczenie kopuły przekracza 90%.
  3. Odzyskiwanie zamrożonych organoidów
    1. Szybko rozmroz kriovial w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Przelej zawartość do 5 mL DMEM/10% FBS w probówce 15 mL.
    3. Wiruj probówkę na 300 × g przez 5 minut.
    4. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 40–60 μL DMEM/10% FBS.
    5. Wymieszaj zawiesinę z lodowatą matrycą membranową bazalnej w stosunku 1:3.
    6. Mieszankę nakładaj na podgrzaną płytę z 6 dołkami (37 °C) w 4–6 kopułach na odwór.
    7. Pozwól kopułom zastygnąć przez 15 minut, a następnie dodaj 3 mL Eso_v1 medium (skład optymalny w początkowej hodowli na etapie 4,2) na odwiert.

8. Przepuszczanie fibroblastów i krioprezerwacja

  1. CAF i CF przechodzące
    UWAGA: Celem tego etapu jest rozszerzenie fibroblastów, gdy osiągną odpowiednią gęstość.
    1. Umyj naczynie 2 mL PBS.
    2. Dodaj 0,4 mL trypsyny o stężeniu 0,25%.
    3. Inkubuj przez 5 minut w inkubatorze CO₂, monitorując odłączenie pod mikroskopem.
    4. Zneutralizuj trypsynę DMEM/10% FBS i przenieś całą zawiesinę komórkową na antenę o średnicy 100 mm zawierającą 10 mL medium.
      UWAGA: Fibroblasty są przepuszczane, gdy osiągają łączność 90%–100%. W przypadku rutynowych subkultur dzieli się je w stosunku 1:3. Empirycznie proliferacja fibroblastów zwalnia lub ustaje, gdy gęstość komórek jest niska.
  2. Krioprezerwacja fibroblastów
    1. Przemyj komórki 5 mL PBS.
    2. Dodaj 1 ml trypsyny o stężeniu 0,25%, a następnie inkubuj przez 5 minut w inkubatorze CO₂.
    3. Zneutralizuj trypsynę DMEM/10% FBS i przelej całą zawiesinę ogniwową do probówki 15 mL.
    4. Wirówka na 300 × g przez 5 minut.
    5. Ponownie zawiesij granulkę komórkową w 2 mL 90% FBS/10% DMSO.
    6. Ilość 0,5 mL do każdego kriovialu.
    7. Umieść fiolki w pojemniku do zamrażania i przechowuj w temperaturze −80 °C przez noc.
    8. Przelej fiolki do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.

9. Test z podłożem warunkowym

UWAGA: Celem tego etapu jest ocena parakrynowych efektów fibroblastów na organoidy nowotworowe ESCC za pomocą medium warunkowanego (CM). Ten test dostarcza powtarzalnego modelu interakcji stromal–guz, gdy bezpośrednia kokultura nie jest jeszcze zoptymalizowana.

  1. Przygotowanie podłoża kondycjonowanego CAF/CF
    1. Hodować tę samą liczbę CAF lub CF w 3 mL DMEM/10% FBS na talerzach 60 mm aż do 80%–90% konfluencji.
    2. Umyj komórki raz 2 mL PBS.
    3. Dodaj 3 mL DMEM/2% FBS.
    4. Inkubuj przez 48 godzin w inkubatorze CO₂.
    5. Zbierz supernatant do probówki 15 mL.
    6. Wirówka w dawce 2000 × g przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
    7. Pobierz 2,5 mL supernatantu do nowej probówki 15 mL.
    8. Kondicjonowane medium zaniedbać na porcje 100–500 μL i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotowanie medium do analizy organoidów
    1. Przygotuj ośrodek organoidowy ESCC zgodnie z krokiem 1.3.
    2. Wymieszaj posiłek organoidowy i podłoże kondicjonowane w stosunku 1:1 (50% v/v).
  3. Hodowla organoidów nowotworowych za pomocą medium do testu organoidalnego.
    1. Po przejściu organoidów, opisanym w kroku 7, organoidy nasienne trafiają do pojedynczej kopuły matrycy błony podstawowej o pojemności 20 μL na odwiert, na wcześniej podgrzanej płycie 48-dołkowej (37 °C).
    2. Po zastygnięciu kopuły dodaj 0,3 mL medium do testu organoidowego do każdego dołku.
    3. Wymieniaj podłoże do badania organoidowego co 3–7 dni.
    4. Oceń morfologię i rozmiar organoidów nowotworowych.
      UWAGA: Wszystkie materiały pochodzące od człowieka traktowane są jako potencjalnie zakaźne. Zawsze noszony jest odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym rękawice, maseczki i okulary ochronne. Kolagenaza, dipasz i dimetylosiarczek (DMSO) mogą powodować podrażnienia skóry, oczu i dróg oddechowych; dlatego unika się bezpośredniego kontaktu i wdechu. Wszystkie procedury enzymatyczne dotyczące tkanek ludzkich wykonywane są zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa. Ciekłe odpady zawierające ludzkie tkanki są zbierane w szczelnie zamkniętych pojemnikach na zagrożenia biologiczne i poddawane autoklawowi przed utylizacją. Odpady chemiczne, w tym roztwory DMSO i enzymatyczne, są utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Wszystkie urządzenia wielokrotnego użytku są płukane 70% etanolem i autoklawowane przed ponownym użyciem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pobrano próbki tkanek z obszaru guza oraz sąsiedniego obszaru nieguzowego, położonego 3 cm od guza, chirurgicznie usuniętych u pacjenta z ESCC, który nie otrzymał neoadiuwantowej chemioterapii. Organoidy nowotworowe i CAF izolowano z obszaru guza, natomiast CF z obszaru nie-nowotworowego. Tkanki chirurgiczne były mielone na kawałki o wielkości około 0,5 mm (Rysunek 2A), następnie enzymatycznie leczone, po czym organoidy nowotworowe i fibroblasty izolowano osobno. Organoidy i fibroblasty potr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Poprzednie raporty wykorzystywały organoidy nowotworowe oraz dopasowane do pacjenta CAF do badania roli CAF w proliferacji i oporności na leki w ludzkich rakach jelita grubego, piersi, trzustki oraz głowy i szyi 20,21,22,23,24. Badania te wykazały, że CAF wpływają na proliferację i oporność na leki. Z drugiej strony, według obecnej wiedzy, nie ma opublikowanyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te zostały wsparte przez Juntendo University Young Investigator Award (2024 i 2025) dla P. Z. oraz granty na badania naukowe od Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii (23K07362, 21K08693). Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Katedr Patologii i Onkologii oraz Chirurgii Przełykowej i Gastroenterologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antena 100 mmTPP93100
100x penicylina-streptomycyna (PS)Nacalai26253-84
Rurka 15 mlFastGeneFG2001
Płytka hodowla komórek z 24 dołkamiTPP92024
Płytka hodowla komórkowa z 48 dołkamiTPP92448
Tubka 50 mlFastGeneFG2004
Antena 60 mmTPP93060
Płyta hodowla komórek 6-dołkowaTPP92006
A83-01Kajmany9001799
Zaawansowane DMEM/F12 Gibco12634010Podstawowe ośrodek organoidalny = Zaawansowane DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anty-mouse IgGInvitrogenA11029
Amfocerycyna BThermoFisher15290018
Przeciwciało przeciw Vimentynie (V9)Santa CruzSC-6260Rozcieńczenie 1/500 do zastosowania
B-27ThermoFisher17504044
Filtr na pokrywkę butelkiSartorius180F15
Sitnik komórkowy, 100 & mikro; m poreBD Falcon352360
Kolagenaza, typ ISIGMAC0130
Dysze 60 mm powlekany kolagenemIWAKI4010-010
Dimetylsulfotlenek (DMSO)Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) firmy DulbeccoNacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Serum bydła płodu (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Medium wzrostu fibroblastów 2PromoCellC-23020Fibroblastowe medium-1 = Fibroblastowe medium wzrostu 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Fibroblasty medium-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
HigromycynaInvivogenANT-HG-1
System IncuCyteEssen BioScience
Komórki L-WRNATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Macierz błony podstawowej = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-acetylo-L-cysteinaWako017-05131
NikotynamidTCIN0078
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenANT-PM-05
Rekombinowany ludzki EGFPEPROTECHAF-100-15
Rekombinowany ludzki FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Skalpel, nr 11Pióro8-3086-02
STEMFULLSumitomo bakeliteMS-90150Rurka o niskim przyczepaniu 15 mL = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Trypsyna dla organoidów = TrypLE Express
TrypsynaNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Bibliografia

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Organoidy ESCCmikrośrodowisko guzamarkery fibroblastówfibroblasty dopasowane do pacjentahodowla trójwymiarowaoddziaływania guz-stroma
Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.