Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek w czasie rzeczywistym płynu śródmiąższowego rdzeniowo-wędrowego szczura udowego poprzez umieszczenie sondy mikrodializy

433 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie wprowadza technikę mikrodializy, która umożliwia dokładne pobieranie próbek płynu śródmiąższowego (AISF) w czasie rzeczywistym u znieczulonych szczurów, ujawniając wyraźne zmiany metaboliczne i potwierdzając jej unikalne znaczenie fizjologiczne. W porównaniu z istniejącymi metodami pobierania próbek płynów międzymiąższowych (ISF), to podejście zapewnia zwiększoną rozdzielczość molekularną i stabilność pobierania.

Streszczenie

Płyn śródmiąższowy (ISF) jest kluczowym elementem mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego, ułatwiającym wymianę metaboliczną i komunikację międzykomórkową. Niemniej jednak głębokość anatomiczna i bliskość struktur naczyniowych sprawiają, że adventyjny ISF (AISF) jest szczególnie trudny do pobierania próbek bez wprowadzenia skażenia lub zakłóceń tkanek. W tym badaniu wprowadzamy w czasie rzeczywistym, minimalnie inwazyjną metodę pobierania AISF poprzez mikrodializę u znieczulonych szczurów. Podwójne sondy odcięcia 20 kDa zostały chirurgicznie wszczepione w przystanku tętnico-żylnym udowym oraz żyłę szyjną, aby umożliwić ciągłe pobieranie pobierania ISF i krwi. Perfuzja sztucznym płynem zewnątrzkomórkowym umożliwiła selektywną dyfuzję metabolitów o niskiej masie molekularnej. Dzięki analizie głównych składników (PCA) oraz ortogonalnej analizie rozróżniającej metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) zaobserwowano wyraźną różnicę metaboliczną między AISF a krwią, wskazując 146 istotnie różnicowych metabolitów. Wzorce wzbogacania mleczanem i serotoniny potwierdziły anatomiczną swoistość i funkcjonalność tej metody. Co ważne, AISF została wzbogacona o lokalnie syntetyzowane metabolity, które nie występowały w osoczu, co podkreśla jego unikalne znaczenie fizjologiczne. W porównaniu z obecnymi metodami pobierania próbek płynów śródmiąższowych (ISF), takimi jak mikroigły, pęcherze ssące i odwrócona jonoforeza, mikrodializa zapewnia lepszą rozdzielczość molekularną, większą stabilność pobierania oraz zmniejsza inwazyjną aktywność. Technika ta stanowi wiarygodną platformę do analizy in vivo analitów w płynie śródmiąższowym (AISF) i wykazuje znaczący potencjał w dalszym odkrywaniu i badaniach biomarkerów w dziedzinie patofizjologii naczyniowej.

Wprowadzenie

Płyn tkankowy, zwany także płynem śródmiąższowym (ISF), stanowi kluczowy element mikrośrodowiska komórkowego, a badania naukowe sięgają końca XIX wieku. W 1896 roku Starling wprowadził teorię filtracji i reabsorpcji kapilarnej, która jako pierwsza scharakteryzowała ISF jako jednorodny płyn powstający w wyniku ultrafiltracji osocza, odgrywający kluczową rolę w transporcie składników odżywczych i usuwaniu odpadów metabolicznych1. W ciągu ostatnich dwóch dekad postępy w technologii obrazowania mikroskopowego i biologii molekularnej pogłębiły wiedzę badaczy na temat znacznej różnorodności anatomicznej dystrybucji, składu i funkcji ISF2.

Badania nad płynem śródmiąższowym (ISF) w różnych miejscach anatomicznych wyjaśniły jego odrębne funkcje w różnych tkankach. Na przykład w tkance mózgowej ISF ułatwia usuwanie neurotoksycznych metabolitów, takich jak β-amyloid, podczas snu za pośrednictwem układu glymfatycznego3. Natomiast płyn śródmiąższowy nowotworowy (TIF) przyczynia się do inwazji guza i unikania odporności, promując kwaśne mikrośrodowisko poprzez gromadzenie kwasu mlekowego4. Wyniki te sugerują, że ISF pełni funkcję nie tylko mediatora wymiany metabolicznej, ale także aktywnego regulatora tkankowo-specyficznych procesów patofizjologicznych. W tym kontekście Adventitial Interstitial Fluid (AISF) stanowi unikalne wyzwanie badawcze ze względu na swoją specyficzną lokalizację anatomiczną i złożoność funkcjonalną. AISF znajduje się na styku między adventitia a otaczającymi tkankami5, odgrywając kluczową rolę w interakcji między ścianą naczyniową a układem nerwowym i odpornościowym. Jednak jego głębokie położenie anatomiczne oraz bliskość krwi i płynów limfatycznych stanowiły poważne wyzwania techniczne dla pobierania próbek in situ i analizy składu.

Tradycyjne techniki pobierania próbek ISF, w tym metoda i drenaża chirurgiczna, napotykają poważne wyzwania przy pozyskiwaniu próbek AISF o wysokiej czystości ze względu na ryzyko skażenia krwi i uszkodzenia tkanek. Na przykład chirurgiczne usunięcie nabłonka naczyniowego może spowodować uszkodzenie nerwów obwodowych lub naczyń limfatycznych, prowadząc do mieszania biomolekuł niedocelowych6. Ponadto metody te są ograniczone przez niskie częstotliwości próbkowania, niestabilność, podatność na interferencję oraz słabą powtarzalność, często spowodowaną stanem zapalnym wywołanym podskórnym wszczepieniem7 oraz uszkodzeniem komórek podczas implantacji mięśni. Rozwój mikrodializ stanowi skuteczniejsze podejście do badań ISF. Technika ta umożliwia in situ i dynamiczne wychwytywanie małych cząsteczek, takich jak metabolity i cytokiny, w ISF bez naruszania struktury naczyniowej dzięki zastosowaniu półprzepuszczalnej sondy błonowej. Sondę można precyzyjnie umieścić w przestrzeni nabłonkowej naczyniowej, co zmniejsza ryzyko zakażenia krwią lub płynami limfatycznymi. Dodatkowo umożliwia ciągłe pobieranie próbek, co umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych zmian metabolizmu ISF w różnych warunkach. Zapewnij ciągłe i stabilne monitorowanie tych procesów metabolicznych podczas eksperymentu.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono po zatwierdzeniu przez Komisję Etyki Zwierząt Peking Union Medical College. Wszystkie procedury ściśle przestrzegały ustalonych protokołów. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Zilustruj system pobierania próbek do mikrodializy oraz powiązane instrumenty chirurgiczne, jak pokazano na Rysunku 1.
  2. Przygotuj sztuczny płyn zewnątrzkomórkowy (aECF) zawierający 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl oraz 1,25 mM glukozy i dostosuj pH do 7,4.
  3. Przygotuj dwie sondy mD o usile 20 kDa i wyznacz je jako Sondę 1 (sonda płynu tkankowego) oraz Sondę 2 (sonda krwi). Umieść sondę 1 w sterylnej, filtrowanej wodzie dejonizowanej (dH₂O), a sondę 2 w 1% heparyny sodu, zapewniając, że końcówki sondy pozostają stale wilgotne.
  4. Ustal dwie pary szlaków (Ścieżki 1 i 2) dla "dopływu" i "odpływu". Połącz dwa segmenty rur FEP o średnicy 1 m za pomocą rur PE50, minimalizując martwą przestrzeń. Każdą rurkę dopływu podłącz do strzykawki Exmire o pojemności 1 mL: napełnij strzykawkę 1 dH₂O, a strzykawkę 2 1% heparyną sodu. Podłącz mikrostrzykawki do sond i przygotuj infuzję ECF po umieszczeniu sond w żyłie szyjnej.
  5. Aktywuj pompę mD i ustaw przepływ na 1,5 μL/min, aż płyn wydostanie się z rury wylotowej. Podłącz rurkę wylotową do linii pobierania próbek.
  6. Napełnij dwie mikrostrzykawki filtrowanym aECF i rozpocznij pompowanie z częstotliwością 1 μL/min.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Wybrane dorosłe szczury Sprague-Dawley ważące 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Indukować znieczulenie przy użyciu izofluranu 3% i utrzymywać je przy 1,8%-2,2% izofluranu w mieszance powietrza i tlenu, monitorując aktywność serca (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Potwierdź głęboką anestezję, oceniając brak reakcji bólowej i zauważając obniżone tętno (340-390 uderzeń na minutę). Połóż szczura na termostatycznym kocu i unieruchom kończyny.
  3. Nałóż krem do usuwania owłosienia na szyję i lewą tylną kończynę, rozszerzając się na lewą dolną część brzucha. Depilowane obszary dezynfekuj dwukrotnie jodoforem i usuń resztki jodu za pomocą 75% alkoholu medycznego.

3. Umieszczenie sondy w podwójnym miejscu (przygwon udowy i żyła szta)

  1. Użyj sondy z aktywnym oknem dializy 10 mm (CMA-20, odcięcie 20 kDa, średnica wału 0,5 mm), jak pokazano na Rysunku 2A.
  2. Przygotuj igłę prowadzącą i rurkę odrywającą (Rysunek 2B).
  3. Wyprostuj tylną kończynę szczura tak, aby linia łącząca staw kolanowy ze środkiem załamania pachwinowego była prostopadła do osi podłużnej ciała. Zmierz segment o długości 2 cm wzdłuż skóry w okolicy pachwinowej w kierunku tylnej kończyny, aby zdefiniować obszar charakterystyczny dla operacji (rysunek 2C). Zidentyfikuj środek tego obszaru pachwinowego jako punkt pozycjonowania mikrookienka. Zaznacz miejsce przebicia 2 cm bocznie od tego punktu pozycjonowania (rysunek 2D).
  4. Umieść zwierzę pod stereomikroskopem.
  5. Wykonaj nacięcie o średnicy 0,5-0,8 cm w środku załamania pachwinowego, aby ułatwić wizualizację i zapewnić dokładne umieszczenie sondy w błonie okołonaczyniowej. Bezpośrednio rozciąć tkankę podskórną, aby odsłonić tętnicę udową i żyłę, żyłę odpiszczerową oraz żyłę ściany brzucha (Rysunek 2E).
  6. Otocz zewnętrzną warstwę igły w rurkę do rozrywania, aby stworzyć igłę prowadzącą.
  7. Potwierdź, że pod skórą w miejscu nakłucia nie ma naczyń krwionośnych. Wbij igłę pionowo przez skórę, a następnie dostosuj kąt do 45°, aby wejść w przestrzeń tkanek otaczającą żyłę odpiszczelową.
  8. Przesuwaj igłę w kierunku przepływu krwi w żyłę odpiszczerową, utrzymując bliski kontakt ze ścianą naczynia przez cały zabieg. Używaj stereomikroskopu, aby monitorować położenie igły w czasie rzeczywistym i zapobiegać uszkodzeniom naczyń lub zanieczyszczeniu krwi. Następnie skieruj igłę do przystanków żyły udowej (rysunek 2F).
  9. Wyjmij igłę do nakłucia, pozostawiając rurkę odrywającą na miejscu w tkance (Rysunek 2G).
  10. Włóż sondę do cewnika rozrywanego i ostrożnie otwórz cewnik, aby odsłonić miejsce pobierania i pobrać próbkę tkanki (Rysunek 2H). Upewnij się, że sonda jest precyzyjnie umieszczona w przystępie tętnicy udowej i żyły (Rysunek 2I). Przymocuj sondę do skóry przed zszyciem (Rysunek 2J). Wszystkie zabiegi wykonuj w ścisłych warunkach aseptycznych, dbając o to, aby nie zakłócać naczynu naczyń oraz zapobiegać zapaleniu tkanek lub reakcjom ciał obcych, które mogłyby zaburzyć pobieranie płynu tkankowego.
  11. Zweryfikowaj pozycję sondy, fotografując linijkę chirurgiczną razem ze stałą sondą, aby udokumentować naświetloną długość, i przedstawij ten obraz zgodnie z rysunkiem 2I.
  12. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie skórne około 0,5 cm bocznie od linii środkowej szyi, zaczynając 1 cm powyżej wcięcia mostkowego.
  13. Rozcinają tępo przez mięsień mostkowo-naczyniowo-stoi, odsłaniając żyłę szyjną, która leży bocznie od tętnicy szyjnej i jest rozpoznawalna po ciemnoniebieskim zabarwieniu. Użyj nawilżonego patyczka watowego, aby delikatnie oddzielić powięź, uważając, by nie stykać się z nerwem błędnym.
  14. Za pomocą mikroskopijnych kleszczy delikatnie unieś zewnętrzną błonę żyły szyjnej i ostrożnie usuń otaczającą tkankę łączną, aby uzyskać co najmniej 1 cm długości wolnego naczynia. Umieść szew jedwabny 4-0 blisko, aby służył jako zapasowa ligatura (rysunek 2K).
  15. W przypadku nakłucia żylnego wykonaj nacięcie skośne pod kątem 45°, czyli około jednej trzeciej średnicy naczynia. Użyj mikrokleszczy, aby delikatnie otworzyć nacięcie i stworzyć wejście do włożenia sondy.
  16. Ostrożnie włóż końcówkę sondy do żyły i powoli przesuwaj ją na głębokość 3,5-4,0 cm, upewniając się, że czubek dociera do wejścia do prawego przedsionka (Rysunek 2L).
  17. Zabezpiecz sondę, zaciskając bliższą ligaturę jedwabną podwójnym węzłem. Zamknij warstwę mięśniową szwami 4-0 Vicryl, a następnie zszyj skórę szwami przerwanymi. Przymocuj zewnętrzną część sondy do powierzchni skóry, aby zapobiec przesunięciu się.

4. Pobieranie próbek i odzyskiwanie sondy

  1. Pobieranie próbek: Oceń związek między dializą tkanek a transferem próbki do probówki. Utrzymuj całkowitą objętość 20 μL między sondą a kolektorem.
    1. Pozwól na 20-minutowy okres, aby próbka przeszła przez sondę i rurkę oraz dotarła do końca rurki w celu pobrania z przepływem 1 μL/min. Zbierz odpowiednią objętość, aby osiągnąć wymagane stężenie do testu. Pobieraj 30 μL dializatu na probówkę.
  2. Przechowywanie próbek: Wstępne schłodzenie probówek polipropylenowych o pojemności 0,5 mL do 4 °C. Bezpośrednio po zebraniu zatkać probówki, zamrozić je na 30 sekund w ciekłym azocie i przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w ciągu 2 minut.
  3. Próbka wyjściowa: Przeprowadz wyrównanie próbki przed rozpoczęciem pobierania próbek. Pobierz trzy próbki na szczura pod narkozą, aby ustalić stabilny poziom wyjściowy.
  4. Usuwanie sondy: Po zakończeniu pobierania próbki usuń sondę z głowy zwierzęcia i umieść ją w fiolce zawierającej 1% heparyny sodu. Uśpij zwierzę przez wdychanie nadmiaru izofluranu.
  5. Konserwacja sondy: Dokładnie przepłucz sondę solą fizjologiczną i przechowuj ją w fiolce zawierającej roztwór solny. Przepłukuj rurki solą fizjologiczną za pomocą strzykawki, aby zapobiec rozwojowi mikroorganizmów. Sondę można ponownie użyć tylko wtedy, gdy utrzymuje ona wystarczający przepływ i membrana pozostaje nienaruszona.

5. Analiza danych

  1. Wykonaj analizę głównych składowych (PCA), ortogonalną analizę dyskryminacyjną cząstkową metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) oraz dodatkowe analizy statystyczne z wykorzystaniem MetaboAnalyst 6.0. Użyj OPLS-DA konkretnie do określenia zmiennej ważności w projekcji (VIP).
  2. Stosuj testy nieparametryczne, w tym oceny wartości P oraz analizę zmian fałdowania, aby zbadać różnicowanie metabolitów. Ustal krytyczne progi do badania różnicowych metabolitów jako VIP > 1, FC ≥ 2, czyli FC ≤ 0,5 oraz P < 0,05.
  3. Notuj zidentyfikowane metabolity za pomocą bazy danych związków KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. Wykonaj ilościową ilościową analizę metabolitów za pomocą spektrometru masowego AB Sciex 6500+ z potrójnym kwadrupolem spektrometru masowego wyposażonego w źródło jonizacji elektrosprayowej (ESI) działającego w trybie jonów dodatnich.
  2. Ustaw parametry instrumentów następująco: gaz kurtynowy 40 psi; gaz kolizyjny, 10 psi; gaz źródłowy jonów 1 (GS1), 50 psi; gaz źródłowy jonowy 2 (GS2), 55 psi; napięcie natrysku jonowego, 4500 V; oraz temperaturę źródła, 550 °C.
  3. Obsługa systemu w trybie monitorowania wielokrotnych reakcji (MRM). Optymalizuj przejścia MRM, potencjały deklasteryzacyjne i energie kolizji indywidualnie dla każdego metabolitu. Przeprowadzaj akwizycję danych za pomocą oprogramowania Analyst 1.7.1 oraz analizę ilościową z użyciem MultiQuant 3.0.3.
  4. Do separacji chromatograficznej użyj kolumny C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) utrzymywanej w temperaturze 45 °C. Fazy ruchome przygotuj jako (A) 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie oraz (B) 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitryle. Ustaw przepływ na 0,35 mL/min i objętość wtrysku na 6 μL. Utrzymuj temperaturę autopróbora na poziomie 4 °C przed analizą.
    UWAGA: W tym badaniu każdy bieg trwał łącznie około 25 minut.

Wyniki

Zbiór danych został znormalizowany poprzez zastosowanie transformacji sumowania i logarytmicznych, a następnie przeszedł kompleksowy zestaw analiz statystycznych. Przeprowadzono analizę komponentów głównych (PCA) (Rysunek 3A), która wykazała wyraźne separacje i podkreśliła różnice metaboliczne. Następnie opracowano model Ortogonalnej Częściowej Analizy Najmniejszych Kwadratów Dyskryminantnych (OPLS-DA), którego uzyskane wyniki przedstawiono na Rysunku 3B, co pokazuje skuteczność dyskryminującą tego modelu. W ocenie 618 metabolitów, wykresy wulkaniczne porównujące próbki AISF i krwi wykazały 146 różnicowych metabolitów, przy czym płyn tkankowy wykazywał zarówno obniżoną, jak i zwiększaną regulację metabolitów (Rysunek 3C). Dodatkowo stworzono mapę cieplną zapewniającą porównawczy przegląd 50 najważniejszych różnicowych metabolitów (Rysunek 3D).

Aby ocenić wiarygodność metody pobierania próbek, wykorzystano serotoninę i kwas mlekowy jako dodatnie kontrole, reprezentujące odpowiednio składniki płynów tkankowych i krew. Wyniki były zgodne z ustalonymi wzorcami rozkładu tych składników w różnych płynach ustrojowych, jak przedstawiono na Rysunku 4. Ilustracja uzupełniająca 1 pokazuje stabilność mleczanu i serotoniny w alikwotach mikrodializatu przechowywanych w temperaturze -80 °C.

146 różnicowych metabolitów zostało systematycznie sklasyfikowanych w kilka kategorii: nukleozydy, nukleotydy i ich analogi; kwasy tłuszczowe i ich pochodne; aminokwasy, peptydy i ich analogi; węglowodany i sprzężone węglowodany; kwasy organiczne i ich pochodne; aminy biogenne; puryny i pirymidyny; witaminy i sterydy; a także inne związki (rysunek 5A). Tabela uzupełniająca 1 pokazuje różnice metabolitów wykrytych we krwi. Analizy heatmap dodatkowo wyjaśniają wzorce wzbogacania aminow biogennych i aminokwasów, peptydów oraz ich analogów w różnych płynach ustrojowych (rysunek 5B,C). Analiza różnicowego wzbogacenia metabolitów przedstawiona jest na Rysunku 6. Tabela uzupełniająca 2 przedstawia współczynnik zmienności (CV) dla piętnastu losowo wybranych metabolitów w trzech kolejnych próbkach płynów tkankowych okołonaczyniowych.

Rysunek 1
Rysunek 1: Zdjęcia aparatury eksperymentalnej. (A) Chłodzony kolektor frakcji. (B) Pompa strzykawkowa. (C) Mikrostrzykawki. (D) Narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki naczyniowe i pęsety itp. (E) Aparat do znieczulenia. (F) Sondy mikrodializy. (G) sondy mikrodializy, igła prowadząca tkanki oraz rurka do rozrywania. (H) Zestawy igieł z prowadnicą tkanki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Kluczowe etapy badania. (A) Schematyczne przedstawienie przedstawiające diagram ilustrujący położenie miejsca operacji oraz orientację sondy. (B) Identyfikacja krytycznie naczyństw w celu zapewnienia precyzyjnej obserwacji miejsc umieszczania sond. (C) Wprowadzenie igły prowadzącej, która przenika skórę i przesuwa się w przestrzeń tkanek. (D) Wycofanie igieł prowadzących jest wycofowane, pozostawiając rurkę do rozerwania w tkance. (E) Sonda mikrodializy jest wprowadzana do tkanki przez ustalony kanał. (F) Delikatne wyciąganie rurki do rozrywania. Rurka do zerwania jest delikatnie wysuwana po zamocowaniu sondy. (G) Wizualizacja sond umieszczonych w nabłonku naczyń tętniczych i żylnych kości udowej. (H) Oddzielenie tkanki od żyły szyjnej. (I) Umieszczenie sondy w żyłie szyjnej. (J) Sonda mikrodializy jest zamocowana na powierzchni skóry. (K) izolacja żyły szyjnej. (L) Wprowadzenie sondy do żyły szyjnej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Wielowymiarowa analiza statystyczna płynu śródmiąższowego (ISF) i krwi. (A) Dane zostały zmniejszone, aby podkreślić istotne rozdzielenia, wykazując wyraźne różnice między ISF a składnikami krwi. (B) Ortogonalne wyniki analizy dyskryminantnej metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) wskazują odpowiednio wartości R2Y i Q2 0,925 i 0,811. (C) Wykres wulkanu przedstawia 146 różnicowych metabolitów, z czego 85 jest obniżonych i 61 zwiększonych w ISF. (D) Odpowiednio, mapy ciepła kontrastujące 30 najważniejszych metabolitów w ISF i krwi ujawniają wyraźne rozróżnienie między tymi dwoma zestawami składników. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4
Rysunek 4: Prezentacja serii wykresów pudełkowych wyjaśniła poziomy wzbogacenia mleczanu i serotoniny w ISF i krwi. Wszystkie punkty danych reprezentują średnią ± SEM; Dla wszystkich paneli ilościowych pokazane są paski błędu. Panel (A) pokazuje, że próbki ISF wykazują znacząco większe wzbogacenie mleczanu w porównaniu z próbkami krwi. Dla porównania, panel (B) wykazuje, że serotonina jest bardziej wzbogacona w próbkach krwi, które jednocześnie wykazują niższe poziomy mleczanu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5
Rysunek 5: Przedstawiono wykres pierścieni klasyfikacyjnych różnicowych metabolitów oraz mapę cieplną aminokwasów, peptydów i analogów, a także aminy biogenne. (A) Każdy blok koloru odpowiada odrębnej klasie metabolitów. Aminokwasy, peptydy i analogi stanowią największą kategorię, stanowiąc 19,29% całości, następnie nukleozydy, nukleotydy i analogi (15%), kwasy tłuszczowe i pochodne (12,86%), węglowodany i sprzężone węglowodany (7,86%), kwasy organiczne i pochodne (10%), aminy biogenne (7,14%), puryny/piryydydyny (5,71%), witaminy i sterydy (8,57%) oraz inne związki, w tym indolacje, azepiny, pirydyny i benzeny, stanowiące 13,57%. (B) W płynie śródmiąższowym (ISF) poziomy wzbogacające związków takich jak deoksykarnityna i spermydyna z kategorii aminow biogennych są istotnie podwyższone w porównaniu do tych we krwi, podczas gdy poziomy serotoniny (D4), serotoniny, tryptaminy i pokrewnych związków są istotnie obniżone. (C) W ISF większość metabolitów związanych z aminokwasami, peptydami i analogami jest wyraźnie niższa niż tych obserwowanych we krwi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6
Rysunek 6: Analiza wzbogacania zestawów metabolitów (MSEA) prawidłowego płynu śródmiąższowego wykazała, że aktywność metaboliczna jest głównie rozłożona na szlakach związanych z produkcją energii, homeostazą redoks i odwracaniem aminokwasów. Najlepiej wzbogacone szlaki obejmują metabolizm butanoanu, metabolizm puryn oraz metabolizm glutationu, odzwierciedlając utrzymanie zasilania mitochondriów energetycznymi i zdolności antyoksydacyjnej w warunkach fizjologicznych. Dodatkowo reprezentowane są różne szlaki związane z aminokwasami, takie jak metabolizm argininy i proliny, metabolizm tryptofanu oraz metabolizm cysteiny i metioniny, co wskazuje na aktywną interkonwersję aminokwasów i regulację równowagi azotu w mikrośrodowisku zewnątrzkomórkowym. Wyniki te sugerują, że normalny metabolom śródmiąższowy utrzymuje dynamiczną równowagę między procesami bioenergetycznymi, obroną oksydacyjną a metabolizmem aminokwasów, wspierając homeostazę tkanek i stabilność mikrokrążenia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ilustracja uzupełniająca 1: Stabilność mleczanu i serotoniny w alikwotach mikrodializatu przechowywanych w temperaturze -80 °C. Dane są średnie ± SEM (n = 6 replikacji na punkt czasowy). Żaden analit nie odchylił się od wartości wyjściowej o >5% w ciągu 72 godzin. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Różnice metabolitów wykrytych we krwi oraz mikrodializacie płynów międzymiąższowych w stanie adventyjnym. Obejmuje to nazwę metabolitu, zmianę fałdy (FC), wartość P w testie Studenta oraz VIP (OPLS-DA). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Współczynnik zmienności (CV) dla piętnastu losowo wybranych metabolitów w trzech kolejnych próbkach tkanek okołonaczyniowych.Wszystkie CV to <20%. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Płyn międzymiąższowy (ISF) to wodne mikrośrodowisko otaczające każdą komórkę tkanki i stanowiące około 75% przedziału płynu zewnątrzkomórkowego 8,9. Wytwarzany przez filtrację kapilarną osocza, ISF nie posiada komórkowej i wysokiej zawartości białka we krwi, ale zachowuje elektrolity, małe substancje rozpuszczonei wodę. Ta kompozycja stawia ISF jako kluczowy interfejs między światem naczyniowym a komórkowym. Funkcjonalnie ISF jest dynamicznym medium transportowym. Dostarcza tlen, glukozę, aminokwasy i mikroelementy z krwiobiegu do komórek, jednocześnie zbierając dwutlenek węgla, mocznik i inne odpady metaboliczne, aby wrócićdo krążenia. Płyn ten pełni także funkcję smaru i bufora, stabilizując ciśnienie śródmiąższowe osmotyczne, pH oraz równowagę jonową11. Poza metabolizmem, ISF wspiera nadzór immunologiczny, przenosząc leukocyty, przeciwciała i cytokiny przez przestrzenie tkankowe oraz działa jako autostrada komunikacyjna dla hormonów i sygnałów parakrynowych12,13. W porównaniu z krwią, ISF jest zasadniczo filtratem wolnym od komórek i niską zawartością białka14. Krew, ograniczona do drzewa naczyniowego, zawiera czerwone i białe krwinki, płytki krwi oraz wysokie stężenia albuminy i czynników krzepnięcia. Poziom tlenu i składników odżywczych jest najwyższy we krwi i stopniowo niższy w ISF ze względu na pobieranie przez komórki, podczas gdy produkty przemiany odkładają się w ISF przed wejściem do powrotu limfatycznego lub żylnego10. Brak dużych białek i komórek w prawidłowym ISF minimalizuje ciśnienie onkotyczne i umożliwia szybkie rozwarcie dyfuzji, ale stany zapalne mogą tymczasowo zmienić ten profil15.

Jednak badania ISF pozostają ograniczone z powodu braku prostych, szybkich i wiarygodnych metod pobierania próbek. Obecne metody obejmują plastry mikroigły (MN), pęcherze ssące, odwróconą jotoforezę, ablację termiczną oraz mikrodializę. Plastry MN tworzą mikrokanały do ekstrakcji ISF przez skórę, przy czym warianty z powłoką rdzeniową wyciągają ISF w mniej niż 30 sekund, a osmotyczne hydrożelowe MN w około 3 minuty. Można je łączyć z czujnikami do analizy na plam, ale są ograniczone objętością i wymagają równowagi między siłą a obrzękiem. Pęcherze ssące zapewniają czysty ISF przy minimalnym zanieczyszczeniu krwi, ale są inwazyjne, bolesne i powolne 16,17,18. Odwrotna jonoforeza (RI) wykorzystuje niskie prądy elektryczne do transportu naładowanych analitów, takich jak jony glukozy i litu, na powierzchnię skóry w celu nieinwazyjnego monitorowania. Jednak stoi przed wyzwaniami takimi jak niska przepustowość, zmienność między osobami oraz potencjalne podrażnienia skóry19,20. Aplikacja transskórna (TA) zakłóca warstwę rogówki poprzez lokalne ogrzewanie, umożliwiając ISF pasywne wchodzenie w mikrokanały hydrofilowe. Chociaż jest prostsza w konstrukcji urządzenia, zbiera mniej niż 5 μL płynu, co wymaga bardzo czułej detekcji i starannego zarządzania termicznego, aby uniknąć spaleń21,22. Dla porównania, mikrodializa (MD), która opiera się na dyfuzji między wszczepionymi półprzepuszczalnymi sondami, oferuje unikalną selektywność molekularną dzięki membranom z regulacyjną masą cząsteczkową (MWCO), takimi jak 10 kDa dla glukozy i 100 kDa dla białek i cytokin23,24. Technika ta wspiera ciągłe i minimalnie inwazyjne pobieranie próbek. Jednak MD jest operacyjnie złożona, wymaga kalibracji in vivo i wykazuje zmienne tempo odzysku dla gatunków hydrofobowych. Warto zauważyć, że MD jest jedyną techniką zdolną do selektywnej izolacji dużych biomolekuł pod kątem selektywności rozmiaru25. Porównawcze badania dializatu zebranego w pobliżu naczyń w porównaniu z krwią wykazują odrębne profile mleczanowe i serotoninowe, potwierdzając stabilność i specyficzność podejścia MD.

Badania na zwierzętach wykazały, że ISF, regulowany synergistycznie przez serce i płuca, może przepływać w awentycie związanej z dużymi tętnicami, żyłami i nerwami obwodowymi 5,9. Zazwyczaj ISF zawiera metabolity pochodzące bezpośrednio z osocza oraz lokalnie syntetyzowane w tkankach 26,27,28. Jest więc prawdopodobne, że zidentyfikowane nakładania się i różnice metabolitów w AISF i osocze odzwierciedlają zaangażowanie układu krążenia ISF w transport i oczyszczanie składników odżywczych oraz metabolitów w tkankach wzdłuż naczyń. Technika oparta na mikrodializach wprowadzona tutaj do pobierania próbek AISF znacząco wzbogaci badania nad ogólnoustrojową krążeniem ISF w regulacji metabolizmu w wielu narządach i tkankach w całym ciele.

Membrana 20 kDa z wężową masą molekularną (MWCO) wykorzystana w tym badaniu jest optymalnie zaprojektowana do ilościowego odzysku małych metabolitów, w tym glukozy, mleczana, pirotrowiana i aminokwasów. Jednak konsekwentnie pobiera niedopróbowanie lub całkowicie wyklucza liczne biologicznie istotne makrocząsteczki, takie jak cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu i enzymy zewnątrzkomórkowe. Przeglądy kliniczne i metodologiczne wykazały, że standardowe cewniki 20 kDa są skuteczne w zbieraniu małych hydrofilowych metabolitów, jednak wykazują one słabe wskaźniki regeneracji białek i mediatorów zapalnych29. W związku z tym konieczne są membrany o wyższych MWCO (np. 100 kDa) lub alternatywne strategie próbkowania do dokładnej ilościowej analizycytokiny 30,31. Dlatego przyszłe badania prowadzone przez naszą grupę będą wykorzystywać membrany z większymi MWCO do charakteryzacji makrocząsteczkowego składu obwodowego płynu śródmiąższowego. W tym badaniu dializy pobierano pod znieczuleniem ogólnym. Mikrodializa została wcześniej zweryfikowana u obudzonych, swobodnie poruszających się zwierząt, a kilka technik mikroperfuzji "otwartego przepływu" zostało zaadaptowanych do zastosowań w modelach świadomych32. Jednak dostosowanie naszego projektu sondy i protokołu implantacji do zastosowań u zwierząt czujnych będzie wymagało rozwiązania wyzwań związanych z mocowaniem, stresem zwierząt, stabilnością sondy, artefaktami ruchu oraz długoterminową przechodnością. Obecnie pracujemy nad lekkim systemem obracania się na linach i planujemy świadome pobieranie próbek w kolejnych badaniach.

Oświadczenia

Nie ma żadnych finansowych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te zostały sfinansowane przez Narodowy Program Badań Kluczowych Chin (2025YFC3507601) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Instytutów Badań Opieki Społecznej (nr ZZ-YC2023007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System monitorowania EKGAD Instruments, AustraliaPowerLabWyposażenie
KleszczeF.S.T(Fine Science Tools) Niemcy11252-00Narzędzia chirurgiczne
Heparyna sodowaSigma-Aldrich, USA9041-08-1Materiał
Wysokowydajna chromatografia cieczowa w tandemowym spektrometrze masowym (HPLC-MS/MS)SCIEX, USAExionLC-20ACWyposażenie
Standardowe nożyczki IRISF.S.T(Fine Science Tools) Niemcy14060-09Narzędzia chirurgiczne
IzofluranRWD Life Science, PRCR510-22-10Materiał
System znieczulenia o niskim przepływieKent Scientific, USASomnoSuiteWyposażenie
Mikrodializa Płyn Perfuzyjny T1Mikrodializa CMA, SzwecjaP000034Materiał
Sonda mikrodializy, 20 EliteMikrodializa CMA, Szwecja8010436Materiał
Strzykawki do mikrodializy 1 mL GazoszczelneMikrodializa CMA, Szwecja8309020Materiał
Chłodzony kolektor frakcjiMikrodializa CMA, Szwecja470Wyposażenie
Rozdzielona rurka dla sond CMA 20Mikrodializa CMA, Szwecja8309019Materiał
Mikroskop stereoskopowyOlympus, JaponiaSZ61Wyposażenie
Pompa strzykawkowaCMA MD AB, Szwecja800310Wyposażenie

Bibliografia

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Płyn śródtkankowy błony zewnętrznejtętnica udowa szczuraprofilowanie metaboliczneanaliza głównych składowychmetabolity o niskiej masie cząsteczkowejposzukiwanie biomarkerówpatofizjologia naczyniowa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.