Method Article

Opracowanie i walidacja metodologii ustalania modeli otyłych szczurów z typową stłuszczeniową trzustką

DOI:

10.3791/69553

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to oferuje powtarzalną i standaryzowaną metodę mająca na celu ustalenie modeli otyłych szczurów wykazujących prostą otyłość, często charakteryzującą się stłuszczeniem trzustki. Zawiera również szczegółowe protokoły pobierania próbek tkanki trzustki oraz immunohistochemii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość stała się dominującą globalną epidemią zdrowia, a niemal połowa światowej populacji jest obecnie klasyfikowana jako osoby z nadwagą lub otyłością. Kluczową cechą patologiczną u osób otyłych jest odkładanie lipidów pozamacicznych w tkankach nietłuszczowych, w tym trzustce – schorzenie zwane steatozą trzustki lub stłuszczeniem trzustki. W modelach gryzoni indukowanych dietą wysokotłuszczową (HFD), steatoza trzustki konsekwentnie poprzedza steatozę wątroby, co podkreśla szczególną podatność trzustki na gromadzenie się lipidów. To wczesne zaangażowanie stawia trzustkę jako kluczowy organ do zrozumienia zaburzeń metabolicznych w otyłości. Chociaż szczury otyłe (DIO) wywołane dietą powtarzają kluczowe aspekty postępu choroby u ludzi, dobrze scharakteryzowane modele zwierzęce, które wiarygodnie wykazują ten fenotyp trzustki, pozostają rzadkie w literaturze.

Istotnym aspektem metodologicznym w modelowaniu otyłości człowieka jest moment wprowadzenia HFD. Wiele istniejących modeli inicjuje HFD w okresie odstawiania od piersi, co może wprowadzać zakłócające efekty programowania metabolicznego, które nie odzwierciedlają w pełni ludzkiej otyłości, a ta rozwija się głównie po fazie rozwoju. Dla porównania, niniejsze badanie ustanawia ustandaryzowany protokół, w którym HFD wprowadza się po odstawianiu od mleka. To podejście dokładniej naśladuje typową ludzką trajektorię pojawiania się otyłości w dorosłości, unika wczesnych adaptacji metabolicznych i prowadzi do bardziej fizjologicznie istotnego postępu w kierunku steatozy trzustki.

Badania te dostarczają szczegółowych i powtarzalnych ram do stworzenia modelu otyłości szczura charakteryzującego się wyraźną patologią stłuszczenia trzustki. Metodologia obejmuje tygodniową fazę aklimatyzacji, 14-tygodniowy okres indukcji HFD rozpoczynający się po odstawieniu oraz systematyczne pobieranie tkanek. Opisane są dwa szlaki przetwarzania tkanek: zamrożenie snap-freezing do analiz molekularnych (np. western blotting) oraz perfuzyjne utrwalanie paraformaldehydu do ocen morfologicznych (np. IHC, H&E). Model ten oferuje solidną platformę do badań mechanistycznych dotyczących zaburzeń metabolicznych trzustki związanych z otyłością.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prosta otyłość definiowana jest jako otyłość występująca niezależnie od innych współistniejących chorób, głównie przypisywana zaburzeniom energii wynikającym z niezdrowego stylu życia, takiego jak nieprawidłowe nawyki żywieniowe i niewystarczająca aktywność fizyczna1. Otyłość znacząco przyczynia się do wzrostu częstości chorób niezakaźnych wśród młodszych populacji, charakteryzujących się wysokim wskaźnikiem rozpowszechnienia, wczesnym początkiem i powikłaniami wielosystemowymi, co czyni ją kluczowym globalnym wyzwaniem zdrowia publicznego2. Stłuszczona trzustka to stan charakteryzujący się osadzeniem lipidów pozamacicznych w tym nietłuszczowym narządzie podczas zaburzeń metabolicznych. Tłuszczowa trzustka odzwierciedla kluczową współpracę między tkanką tłuszczową a patofizjologią trzustki. Nadmierne nagromadzenie tłuszczu trzustkowego wypiera prawidłowe tkanki acynarne i wysepkowe, powodując podwójne zaburzenia funkcjonalne zarówno w funkcjach egzokrynnych, jak i endokrynnych 3,4. Ten proces patologiczny zakłóca stosunki α/β-komórki, sprzyja dediwersencjacji β-komórek z utratą funkcji wydzielania insuliny5 oraz pośredniczy w bezpośrednim lipotoksycznym uszkodzeniu komórekβ-6. Równocześnie proliferacja α komórek i zaburzenia uwalniania insuliny pogłębiają niestabilność glikemiczną, przyspieszając postęp cukrzycy typu 2 (T2DM) i powiązanych powikłań7.

Badanie patogenezy stłuszczonej trzustki ujawnia nowe mechanizmy leżące u podstaw progresji choroby metabolicznej8. Podczas gdy wcześniejsze badania nad otyłością podkreślały steatozą wątroby, pojawiające się dowody wskazują, że deponowanie lipidów trzustki jest wcześniejszym zdarzeniem w zaburzeniach metabolicznych9. Ta zmiana paradygmatu umożliwia stworzenie modelu patologii dwunarządowej dla prostej otyłości, integrującego steatozą trzustki i wątroby10. Badanie ich wzajemnych rozmów może wyjaśnić kluczowe ścieżki chorobowe obejmujące zaburzenia metabolizmu lipidów, otyłość, insulinooporność i cukrzycę, dostarczając świeżych wglądów w mechanizmy choroby11. W procesie patologicznym trzustki początkowym objawem jest znaczne odkładanie tłuszczu trzustkowego, któremu towarzyszy znaczne rozszerzenie adipocytów trzustkowych. Występuje to głównie w brzusznej części głowy, szyi i ciała trzustki, a także w obszarach międzymiąższowych między komórkami acinarnymi a wysepkami. Równocześnie obecny jest przewlekły, niski stan zapalny trzustki, podczas gdy funkcje endokrynologiczne i egzokrynowe pozostają w dużej mierze nienaruszone na tym etapie12,13. Rozległa infiltracja tłuszczowa dodatkowo osłabia funkcję β komórek trzustki poprzez lipotoksyczność i hamuje aktywność insuliny. W tej fazie komórki acynarowe są stopniowo zastępowane przez adipocyty, co przyczynia się do rozwoju T2DM14,15. Chociaż cukrzyca nie jest niezależnym czynnikiem ryzyka raka trzustki, pacjenci z wywiadem ostrego zapalenia trzustki i cukrzycy wykazują znacząco podwyższone ryzyko rozwoju raka trzustki16.

Makroskopowe analizy anatomiczne określają nasilenie i wzorce infiltracji steatozy trzustki, natomiast oceny IHC na poziomie mikroskopowym charakteryzują morfologię komórek acynarycznych, położenie jądrowe, częstotliwość wakuolizacji oraz dynamikę populacji komórkowej17. To podejście multimodalne, obejmujące obserwację anatomiczną całkowitą aż po IHC o rozdzielczości komórkowej, umożliwia kompleksowe zaawansowanie patologii trzustki w przebiegu choroby. Niniejsze badanie opisuje ustandaryzowany protokół obejmujący tygodniową aklimatyzację, 14-tygodniową indukcję otyłości u dorosłych szczurów oraz zoptymalizowane przetwarzanie tkanek trzustkowych do analizy morfologicznej, ustanawiając solidne ramy do badania zaburzeń metabolicznych związanych ze steatozą.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura leczenia zwierząt została zatwierdzona przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Nankinie (202006A016) i była zgodna z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments), wytycznymi etycznymi, wytycznymi dotyczącymi funkcjonowania Ustawy o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku oraz powiązanymi wytycznymi, Dyrektywą UE 2010/63 dotyczącą ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Wszystkie zwierzęta doświadczalne zostały znieczulone zgodnie z zatwierdzonymi procedurami znieczulenia gryzoni przed sekcją. Procedura była podzielona na trzy wyraźne części.

1. Ustalenie modelu otyłego szczura

  1. Zwierzęta doświadczalne i grupy
    1. Wybrane samce szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 4 tygodni (80-120 g) z diety wrażliwej na wysokotłuszczową odmianę (HFD).
    2. Przyzwyczaj wszystkie szczury do diety podtrzymującej przez tydzień, a następnie losowo podziel je na dwie grupy: grupę kontrolną i grupę modelową.
    3. Po tygodniu zamień dietę podtrzymującą na HFD dla grupy modelowej, zachowując grupę kontrolną na oryginalnej diecie. Utrzymuj obie grupy na diecie przez 14 tygodni. Skład HFD jest szczegółowo opisany w Tabeli 1, a standardowa formuła paszy konserwacyjnej w Tabeli 2.
  2. Warunki żerowania i parametry eksperymentalne
    1. Parametry środowiskowe: temperatura 22 ± 2 °C, wilgotność 50 ± 10%, 12-godzinny cykl światła/ciemności oraz swobodny dostęp do wody i jedzenia.
  3. Wskaźniki monitoringu
    1. Rejestruj masę ciała i spożycie jedzenia co tydzień o ustalonej porze.
      UWAGA: Robienie tego wieczorem może zminimalizować stres i dostosować się do dziennych/nocnych wzorców aktywności18.
    2. Na podstawie zarejestrowanych danych narysuj krzywą wzrostu masy ciała.
    3. Zdefiniuj skuteczne modelowanie otyłości jako sytuację, gdy masa ciała przekracza 20% grupy kontrolnej dopasowanej do wieku.
SkładnikZawartość (g/kg)Główne składniki odżywcze dostarczane
Zwykła pasza proszkowa365Podstawowe źródło składników odżywczych węglowodanów, białek roślinnych, tłuszczów, kompleksów witaminowych, minerałów itp
Smalec310Nasycone kwasy tłuszczowe, nienasycone kwasy tłuszczowe
Kazeina250Aminokwasy niezbędne
Cholesterol10Cholesterol
Mieszanka celulozy i minerałów60Błonnik, wapń, fosfor, sód itd
DL-metionina-metionina/aminokwasy metioninowe3Aminokwasy niezbędne
Drożdże1Witaminy z grupy B, β-glukan itd
NaCl1NaCl

Tabela 1: Specjalna formuła HFD do ustanowienia DIO w modelach szczurów. Tabela szczegółowo opisuje specyficzny skład HFD użytego w tym badaniu dla grupy modelowej, który był stosowany od końca okresu aklimatyzacji aż do pobrania tkanek.

SkładnikTreśćJednostka
Wilgoć12.196%
Surowe białko (CP%)18.272%
Energia strawna (DE)3.186Mcal/kg
Energia metabolizowalna (ME)2.939Mcal/kg
Energia netto (NE)2.228Mcal/kg
Ekstrakt eterowy (EE%)4.417%
Włókno surowe (CF%)3.677%
Wapń (Ca%)0.991%
Całkowity fosfor0.681%
(Łączny P%)
Fosfor niefitan0.19%
Sól0.407%
Lizyna1.118%
Lizyna przyswajalna0.813%
Metionina0.53%
Threonine0.779%
Tryptofan0.221%
Miedź (Cu)22.06mg/kg
Żelazo (Fe)173.69mg/kg
Mangan (Mn)102.1176mg/kg
Cynk (Zn)60.3687mg/kg

Tabela 2: Standardowa formuła paszy konserwacyjnej u szczurów. Tabela przedstawia formułę standardowej paszy utrzymajowej, która była dostarczana wszystkim szczurom podczas fazy aklimatyzacji oraz grupie kontrolnej przez cały czas trwania badania.

2. Pobieranie tkanek

  1. Przygotowanie przedoperacyjne
    1. Leczenie na czczo: 12-godzinne ograniczenie żywienia przed eutanazją, aby zminimalizować zakłócenia zawartości jelita w analizach biochemicznych.
    2. Znieczulenie: Podawanie izofluranu przez inhalację w znieczuleniu głębokim (stężenie indukujące 4%, stężenie utrzymujące 1,5-2%). Aparat do znieczulenia był wyposażony w waporyzator izofluranu, a stężenie znieczulenia utrzymywano na poziomie 1,5-2. Jako punkt odniesienia do przygotowania, fizyczne zużycie ciekłego izofluranu wynosiło około 0,5 mL-0,8 mL na szczura przez cały zabieg.
    3. Monitorowanie głębokości znieczulenia: Stale monitoruj częstość oddechu i odruchy rogówki. Utrzymuj utrzymujący stan znieczulenia przez cały zabieg, aby zapobiec pośmiertnej autolizie trzustki.
    4. Kontroluj niewystarczającą anestezję: Jeśli głębokość znieczulenia jest niewystarczająca lub świadomość nawraca, natychmiast zwiększ stężenie izofluranu, aby uzupełnić znieczulenie i ponownie sprawdź parametry życiowe przed kontynuacją.
      UWAGA: Znieczulenie izofluranowe to metoda zgodna z wymogami etycznymi Centrum Eksperymentalnego Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie. Dodatkowo, istniejące dowody sugerują, że izofluran może oferować wyższy profil bezpieczeństwa niż ketamina u gryzoni19.
  2. Pozyskiwanie świeżej tkanki
    1. Dezynfekcja skóry: Szybko spryskuj 75% etanolem na całe ciało (1-2 sekundy), aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów narządów jamy brzusznej.
    2. Pozycja fiksacji: Ustaw szczura na plecach na stole do sekcji i mocno przymocuj wszystkie cztery kończyny taśmą.
    3. Laparotomia: Chwyć skórę brzucha kleszczami i nożyczkami wykonać poprzeczne nacięcie wzdłuż dolnej krawędzi brzegu żebrowego. Użyj tępego rozwarstwienia, aby oddzielić powięzi podskórnej od tkanki łącznej.
    4. Identyfikacja trzustki: Delikatnie przesuń jelito w lewo, aby zobaczyć żołądek, śledzionę i dwunastnicę. Śledziona jest przyczepiona do ogona trzustki, a żołądek znajduje się blisko trzustki.
    5. Szybka sekcja: Delikatnie unieś śledzionę kleszczami i izoluj trzustkę, stopniowo przecinając jej przystawy śledziony, żołądka i krezki dwunastnicy. Ze względu na delikatną strukturę unika bezpośredniego zaciskania miąższa trzustki i chroni przewody trzustkowe/naczynia krwionośne, aby zapobiec pęknięciu tkanek.
    6. Zachowanie tkanek: Szybko przepłucz rozciętą trzustkę lodowatym PBS (1× fosforanem buforowana sól fizjologiczna, pH 7,4) lub solą fizjologiczną, aby usunąć pozostałą krew. Natychmiast przenieś trzustkę do 2 mL probówki zamrażającyej, zanurz w ciekłym azocie w ciągu 30 sekund i przechowywaj ją długoterminowo w temperaturze -80 °C.
    7. Eutanazja i utylizacja tuszin Po zebraniu tkanek uśpię wszystkie szczury eksperymentalne przez zwichnięcie szyjki macicy. Zgodnie z przepisami Centrum Eksperymentalnego Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie, zwłoki zwierząt klasyfikowane są jako patologiczne odpady biomedyczne (Kod odpadów: 831-003-01). Wszystkie zwłoki zwierząt należy zamknąć w hermetycznych workach zgodnie z przepisami i przechowywać je równomiernie w wyznaczonych zamrażarkach. Centralizowane, ekologiczne utylizowanie będzie prowadzone przez uniwersytet. Pod żadnym pozorem nie należy wyrzucać padłych ciał arbitralnie.
      UWAGA: Unikaj ekspozycji na temperaturę pokojową, aby zapobiec enzymatycznej degradacji biomolekuł20,21.
  3. Pobieranie tkanek perfuzyjne (pozostałe etapy są takie same)
    1. Odsłonić serce: Podnieś tkankę skórną szczura lewą ręką, a prawą otwórz jamę piersiową, aby całkowicie odsłonić serce.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem nacięcia torakotomii w ramach zabiegu perfuzji serca należy wywołać głęboką dawkę znieczulenia.
    2. Przygotuj lewą komorę do perfuzji: Wykonaj małe nacięcie w lewej komorze (rozmiar odpowiadający średnicy igły perfuzyjnej) i naciń prawą komorę uszną, aby umożliwić odpływ krwi.
    3. Przekręć sól fizjologiczną: Delikatnie włóż igłę perfuzyjną do lewej komory i powoli perfuzuj 100 mL soli fizjologicznej z przepływem 10 mL/min, aż wypływ prawego przedsionka stanie się czysty.
    4. Perfuzuj utrwalający: Przełącz na 200 mL 4% paraformaldehydu, przepływ: 5 mL/min. Przeinfunduj każdego szczura 100 mL soli fizjologicznej, a następnie 200 mL 4% paradehydu. W tym badaniu zastosowano komercyjnie przygotowany roztwór PFA. Ze względu na niestabilność PFA w roztworze, z istotnym potencjałem zmienności w zależności od przygotowania i świeżości, roztwór cieczy musi być chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze 4 °C. Należy natychmiast użyć otwartej aliquoty, aby zapewnić skuteczność. Jeśli jest przygotowywany z proszku, roztwór powinien być świeżo przygotowany tuż przed użyciem.
      UWAGA: Noś rękawiczki, gogle i fartuch laboratoryjny; Ćwicz w okapie oparowym, ponieważ paraformaldehyd jest toksyczny. Zgodnie z przepisami Centrum Eksperymentalnego Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie, odpady paraformaldehydu są klasyfikowane jako chemiczne odpady biomedyczne (Kod odpadów: 831-004-01). Po użyciu musi być przechowywana w dedykowanym pojemniku na odpady oznaczonym symbolem zagrożenia biologicznego. Centralną utylizację zajmuje się uniwersytet. Pod żadnym pozorem nie może być niewłaściwie odrzucona.
    5. Potwierdzenie sukcesu perfuzji: Sprawdź sztywność kończyny wskazującą na skuteczną fiksację.
    6. Umieść trzustkę w probówce wirówki o pojemności 50 mL zawierającej 30 ml roztworu paradehydu o stężeniu 4%. Napraw tkankę, przechowując rurkę w ciemności przez 2-4 godziny.
    7. Przenieś trzustkę do nowej rurki wirówki o pojemności 50 mL zawierającej 30 ml roztworu etanolu 70%. Utrzymuj rurkę nieruchomą i chronioną przed światłem przez około 20-24 godzinyi 22 godziny.
    8. Osadzanie parafiny: Osadzenie tkanek w wosku parafinowym. Tkanki osadzone przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano sekcje parafinowe. Zmrożone przekroje są ważną alternatywą, ale wydajność przeciwciał musi być wcześniej zweryfikowana dla konkretnego typu sekcji, aby zapewnić optymalne wyniki.

3. Barwienie trzustki w immunohistochemii (IHC)

  1. Protokół podziału i montażu
    1. Przekroje parafinowe: Wycinaj przekroje tkanki o grubości 6 μm za pomocą mikrotomu i montuj na szklanych szkiełkach.
    2. Metoda unoszenia: Upływaj fragmenty w kąpieli do flotacji tkanek o temperaturze 40 °C, aby wygładzić zmarszczki.
    3. Zbieranie tkanek: Przymocuj sekcje na szkiełkach pokrytych klejem (2-3 na preparat) i susz na podgrzewaczu do 80 °C.
    4. Suszenie na szkiełkach: Po pokrojoniu przenosi się szkiełka z zamontowanymi sekcjami do piekarnika o temperaturze 60 °C na noc.
  2. Protokół deparafinizacji i rehydratacji
    1. Umieść slajdy w stojaku na slajdy i zanurz kolejno następująco: ksylen I, 7 min; ksylen II, 7 min; bezwodny etanol, 5 min; 90% etanolu, 5 min; 85% etanolu, 5 min; 75% etanolu, 5 min; woda destylowana, 5 minut; PBS, 5 minut (trzy razy).
      UWAGA: Wykonuj kroki z ksylenem w okapu oparowym w rękawiczkach i goglach. Utylizacja odpadów ksylenowych zgodnie z identycznym protokołem określonym dla paraformaldehydu w kroku 2.3.4.
  3. Protokół pobierania antygenów
    1. Przygotowanie roztworu cytrynianu sodu: Przygotuj bufor cytrynianu sodu (pH 6,0). Użyliśmy samodzielnie przygotowanego roztworu buforu cytrynianu sodu, rozpuszczając jedną paczkę proszku w 1 litrze wody.
    2. Podgrzewanie w mikrofalówce kolejno: Włóż szkiełka do szklanego słoika wypełnionego roztworem buforu cytrynianu sodu, aby je przykryć, a następnie umieść słoik w mikrofalówce. Próbki poddawano mikrofalowej obróbce w następującej kolejności: średnie ciepło (600 W) przez 8 minut, następnie stanie bez ogrzewania przez 8 minut, a na końcu niskie ciepło (300 W) przez 7 minut.
    3. Naturalnie schłodzić do temperatury pokojowej: pozwól pojemnikowi naturalnie wychłodzić się do temperatury pokojowej.
    4. PBS: Płukanie w PBS przez 5 minut dwukrotnie.
  4. Inkubacja w piekarniku
    1. H2O2: Nakładaj 3% H2O2 na przekroje tkanek przez 10 minut, aby zablokować endogenną aktywność nadoksydazy. Na każdy preparat należy nałożyć około 50–80 μLH20O2.
    2. PBS: Wash slide w PBS przez 5 minut trzy razy.
    3. Kompleks Strept-Awidyna-Biotyna-Peroksydaza (SABC): Nakładaj SABC kropelo na tkankę i barw przez 30 minut w inkubatorze 37 °C. Na każde szkiełko należy nałożyć około 50 - 80 μL SABC.
    4. PBS: Wash slide w PBS przez 5 minut trzy razy.
  5. Odwzorowanie kolorów
    1. 3,3'-diaminobenzydyna (DAB): Nakładaj roztwór chromogeniczny DAB na przekroje tkanek i monitoruj do momentu pojawienia się brązowo-żółtego zabarwienia. Bejcuj te fragmenty przez około 1-5 minut. Dostosuj czas barwienia w zależności od specyficzności tkanki i temperatury otoczenia. Dla tkanki trzustkowej zaleca się czas barwienia 2 minuty w temperaturze 22 °C.
    2. Płukanie: Płukanie natychmiast przesuwa się pod delikatny strumień wody destylowanej, aby zatrzymać reakcję.
    3. Zanurz: Zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na 5 minut, aby usunąć pozostałości odczynników.
  6. Barwienie hematoksylyną
    1. Hematoksylina: Zanurz w środkach hematoksyliny na 1 minutę. Roztwór hematoksyliny przygotowuje się z czystej wody w proporcji 56 mg/mL.
    2. Płukanie: Płukaj dwa razy w wodzie destylowanej (5 s na płukanie).
    3. Różnicowanie kwasu solnego i alkoholu: Różnicowanie szkiełek w roztworze różnicowania kwasu solnego i alkoholu przez 1 s.
    4. Zanurz: Zanurz szkiełka w wodzie z kranu na 10 minut, aby uzyskać stabilne niebieskie barwienie jądrowe.
  7. Odwodnienie: Susz szkiełki kolejno przez następujące roztwory: 70% etanolu, 80% etanolu, 90% etanolu, bezwodnego etanolu, ksylenu I i ksylenu II, odpowiednio przez 3 minuty w każdym roztworze.
    UWAGA: Wykonuj kroki z ksylenem w okapu oparowym w rękawiczkach i goglach.
  8. Uszczelnianie
    1. Zamocuj sekcje neutralnym balsamem: Nałóż neutralny balsam na suwak za pomocą gumowego zawieszka do żarówek. Przykryj się folią na przykrycie. Unikaj gwałtownego ściskania żarówki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Nałóż około 50 μL neutralnego balsamu na każdy preparat.
    2. Suszenie na powietrzu: Umieść zamki w okapie spalinowym na noc, aby żywica neutralna całkowicie wyschła.

4. Analiza Western blottingu (WB)

  1. Rozkład tkanek
    1. Weź 200 mg tkanki trzustki szczura i umieść ją w probówce mielącej 2 mL zawierającej 1 ml buforu lizyzowego i 3 małe stalowe kulki. Bufor lizy składa się z kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy oraz buforu lizy RIPA. Proporcja mieszania to 1 tabletka inhibitora proteazy: 50 mL buforu lizyzowego RIVA.
    2. Mielenie wykonywano za pomocą młyna kulowego o następujących parametrach: częstotliwość: 30/s; czas: 30 s; 10-15 razy. Aż żadne białe cząsteczki nie są widoczne gołym okiem.
    3. Przelej górny białkowy supernatant do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, nie bierz pianki. Wiruj w 16900 x g 30 min, 4 °C.
      UWAGA: Homogenaty do analizy western blotting zostały przygotowane z całej trzustki.
  2. Ilościowa ilościowa identyfikacja białek: Określ stężenie białka za pomocą zestawu Pierce BCA Protein Astest Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Stosunek mieszania dla roztworu roboczego BCA to Roztwór A: Roztwór B = 50:1.
  3. Elektroforeza białek:
    1. Dodaj przygotowane próbki białka trzustki (objętość 6 μL załadowana do każdego toru) do żelu sodowego dodecylowo-poliakrylamidowego – Young PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8, do elektroforezy.
    2. Pracuj na 70 V przez 0,5 godziny, a następnie na 110 V przez godzinę, korzystając z systemu Mini-PROTEAN Tetra. Rozcieńcz elektroforezę MOPS Running Buffer Liquid 20×z czystą wodą do stężenia 1×.
  4. Transfer przez membranę
    1. Rozcieńcz koncentrat transferowy eBlot L2 5× do 1× stężenia roboczego za pomocą czystej wody. Ten bufor transferowy o wartości 1× może być używany ponownie do 3 razy. Rozcieńcz koncentrat równowagi eBlot L2 5× do 1× stężenia roboczego za pomocą czystej wody.
    2. Przetnij membranę PVDF (Immobilon-P Transfer Membrane) do odpowiedniego rozmiaru (np. 7,5 cm × 5,5 cm). Rozmiar porów wynosi 0,45 um.
    3. Wlej około 30 ml metanolu do pudełka inkubacyjnego o pojemności 90 × 60 × 32 mm. Zanurz membranę PVDF w metanolu na 5 sekund, aby ją aktywować.
    4. Wlej około 30 ml przygotowanego roztworu równowagi 1x do innego czystego pudełka inkubacyjnego. Ostrożnie usuń żel z płytek elektroforezy i umieść go w roztworze równowagi.
    5. Przenieś aktywowaną membranę PVDF z metanolu i umieścić ją także w pudełku inkubacyjnym zawierającym roztwór równowagi. Upewnij się, że membrana jest umieszczona pod żelem, aby zapewnić prawidłowy kontakt. Pozwól obu wyrównać.
    6. Zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia do wsiąkowania, umieść "kanapkę" w następującej kolejności od dołu: gąbka, żel, membrana PVDF, gąbka. Upewnij się, że między warstwami nie zostaną uwięzione pęcherzyki powietrza. Prawidłowo umieść złożony stos transferowy w komorze urządzenia do zatłucania. Podłącz zasilacz i przełącz w trybie standardowym przez 15 minut.
  5. Blok
    1. Przygotuj dwa pudełka inkubacyjne, jedno zawierające około 15 mL TBST (Tris-buffered solanka fizjologiczne-Tween20), a drugie około 15 mL 5% roztworu blokującego BSA.
    2. Przygotowanie roztworu TBST: Rozpuścić jedną torebkę Tris Buffered Soline Powder w 2 L czystej wody, a następnie dodać 2 ml Tween 20.
    3. Włóż membranę PVDF do roztworu TBST, dbając o to, by strona stykająca się z żelem była skierowana do góry.
    4. Myj membranę PVDF na shakerze przy 40 obr./min w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut.
    5. Przenieś membranę PVDF do bufora blokującego. Blokuj go na shakerze przy 20 obr./min, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Umyj membranę PVDF w pudełku inkubacyjnym zawierającym TBST, myj membranę trzy razy przez 5 minut na shakerze w temperaturze 40 obr./min w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubuj z pierwotnym przeciwciałem przez noc (14-18 godzin) w temperaturze 4 °C (1:40000, przeciwciało poliklonalne Vinculin) w innym pudełku inkubacyjnym przeciwciał na shakerze o prędkości 20 obr./min.
    3. Upewnij się, że przeciwciało jest rozcieńczone 5% roztworem blokującym BSA, przygotowanym zgodnie z proporcją podaną w sekcji.
  7. Wtórna inkubacja przeciwciał
    1. Umieść membranę PVDF w pudełku inkubacyjnym zawierającym 15 mL roztworu TBST. Myj membranę trzy razy przez 5 minut na shakerze w temperaturze pokojowej, mieszając przy 40 obr./min.
    2. Przygotuj przeciwciało wtórne, rozcieńczając przeciwciało IgG, powiązane z HRP w stosunku 1:2000 w buforze blokującym 5% BSA.
    3. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na shakerze przy 20 obr./min.
    4. Przemyj membranę PVDF trzy razy roztworem TBST przez 5 minut każdy, stosując opisaną powyżej metodę.
  8. Wykrywanie
    1. Roztwór roboczego podłoża przygotuj, mieszając AccuWest ECL Plus, Raegent A oraz AccuWest ECL Plus, Raegent B w proporcji objętościowej 1:1 bezpośrednio w pudełku inkubacyjnym. Wykonaj wszystkie kolejne kroki chronione przed światłem.
    2. Inkubuj membranę PVDF w roztworze przez 5-10 sekund, a następnie natychmiast wykrywaj pasma immunoreaktywne za pomocą odczynników o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) – Vilber Fusion FX6 MINI. Typowy czas naświetlania wynosi od 5 do 10 sekund.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy powtarzalny protokół umożliwiający ustanowienie prostego modelu otyłości, który niezawodnie wykazuje stłuszczenie trzustki (Rysunek 1). Cały proces, od karmienia zwierząt i pobierania tkanek po późniejszą walidację molekularną, jest schematycznie podsumowany na Rysunku 1. Tygodniowe zmiany wagi grupy modelowej (n = 5) i grupy kontrolnej (n = 5) zostały zarejestrowane i nie stwierdzono istotnej różnicy w masie obu grup przed karmieniem HFD. Chociaż waga...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako główny czynnik wywołujący zespół metaboliczny, niepowikłana otyłość stanowi początkowy przejaw systemowej dysregulacji metabolizmu lipidów. Bez interwencji może przekształcić się w T2DM i ciężkie powikłania cukrzycowe, co podkreśla konieczność wczesnej korekty metabolicznej30. Steatoza trzustki (stłuszczona trzustka), wczesny marker odkładania lipidów pozamacicznych w otyłości, redefiniuje trzustkę jako nieklasyczny narząd tłuszczowy, kwestionując konwencjonalny paradygmat osi tłuszczowo-tłus...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Projekt Dziedziców i Instruktorów ds. Dziedziczenia Doświadczenia Akademickiego siódmej grupy uznanych krajowych ekspertów medycyny chińskiej; Projekt Funduszu Młodych Naukowców Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin [grant numer 82305376]; Projekt wspierający młode talenty naukowe i technologiczne w prowincji Jiangsu w 2024 roku [numer grantu JSTJ -2024-380].

Schematy blokowe zostały opracowane za pomocą FigDraw, Biorender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
materiałowy
1,5 mL rurki mikrowirówkiBiosharp Bioengineering Co. LtdBS-15-MWB
2ml probówka zamrażającaLABSELECTCV-002-200-EXWB
2 ml rurka mielnaWuhan Servicebio Technology Co., LtdHT-200-MWB
3% H2O2Booster Electronics Technology Co., Ltd.20A23CIHC
4% paraformaldehyduBiosharp Bioengineering Co. LtdBL539AOperacja przecięcia trzustki perfuzyjnej
Rozwiązanie 5% BSABiofroxx4240GR100IHC
50 mL rurki wirówkowej i nie do rozmów;Biosharp Bioengineering Co. LtdBS-500-MZachowanie tkanek
AccuWest ECL Plus, Raegent ANanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
AccuWest ECL Plus, Raegent BNanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
Bezwodny etanolShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
Przeciwciało IgG przeciw królikom i HRPCell Signaling Technology.Inc,7074WB
Koktajl inhibitorów proteazy cOmpleteHoffmann-La Roche Ltd 82256300WB
Slip pokrywowyCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
Chromogeniczny roztwór DABBooster Electronics Technology Co., Ltd.AR2017-1IHC
KleszczeShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.SP0007-Msekcja szczura SD
szklane slajdy CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
Szklany słoik do bejcowaniaShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.FG010IHC
HematoksylynaShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST2067-20gIHC
Dieta wysokotłuszczowaSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabela1Żywienie na zwierzętach doświadczalnych
Alkohol kwasu solnegoShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0163MIHC
izofluranShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10Znieczulone szczury
metanol Biofroxx67-56-1WB
MOPS Biegnie z płynem buforowym 20 razy;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C36842504WB
Neutralny balsamPekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590IHC
Żywica neutralnaShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
Rozwiązanie PBSJiangsu Keygen Biotech Corp., LtdKGL2206-500Zachowanie tkanek
Pierce BCA Protein Astest Kit & nbsp;Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA.ZB382867
Pierce BCA Protein Astest Kit & nbsp;hermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USAZB382867WB
Koktajl inhibitorów proteazyHoffmann-La Roche Ltd 82256300
Błona PVDF (Immobilon-P Transfer Membrane, Millipore, 0000380346)  Merck Millipore0000380346WB
Bufor lizy RIPABiosharp Bioengineering Co. LtdBL504A, 70096436WB
SABCBooster Electronics Technology Co., Ltd.20C03AIHC
sól fizjologicznaSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. 270071460Zachowanie tkanek
SD samce szczurówJiangsu GemPharmatech Co., Ltd. D000017szczury
Cytrynian soduMerck Life ScienceS1804IHC
Standardowy podnośnik konserwacyjnySuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabela 2Żywienie na zwierzętach doświadczalnych
koncentrat balansowy eBlot L2 5& razy;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97212410 WB
koncentrat transferowy eBlot L2 5&razy;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97211504WB
Tris Buffered solanka, proszek i nie do pracy;Biosharp Bioengineering Co. LtdBL602AWB
Tween 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
UrethanSigma-Aldrich Co., Ltd.U2500-100GZnieczulone szczury
Przeciwciało poliklonalne na winkulinieProteintech Group, Inc,26520-1-APWB
ksylenKorporacja Reagentowa NankińskaC0430530223IHC
Young PAGE, Bis-Tirs, 10& razy; 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C33152505WB
Sprzęt
Aparat do znieczuleniaShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.Model R5805Znieczulone szczury
Ball Mill Retsch Technology GmbH - MicrotracMM400WB
WirówkiEppendorf SE5418RWB
Komputerowa biologiczna suszarka tkanekZhejiang Jinhua Kedi Instrument Co.SC2013-G-KITIHC
odczynniki z rozszerzoną chemiluminescencją (ECL );OBRAZOWANIE BIOGRAFICZNE VILBERA00170961WB
mikrotom Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA.HM325IHC
MikrofalówkaShanghai Boxun Industry Co., Ltd. 97000IHC
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
piekarnikShanghai Jinghong Scientific Co., Ltd.DNP-9082IHC
Czysta wodaSyczuan UPT Ultra-Pure Technology Co., Ltd.ULUP-TEZIHC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, G., et al. Comparative effectiveness of massage combined with lifestyle intervention and lifestyle intervention alone for simple obesity: a systematic review and meta-analysis. Medicine. 104 (2), e41074(2025).
  2. World Obesity Federation. World Obesity Atlas 2024. , World Obesity Federation. London. (2024).
  3. Kromrey, M. L., et al. Pancreatic steatosis is associated with impaired exocrine pancreatic function. Invest Radiol. 54 (7), 403(2019).
  4. Miyake, H., et al. Association of fatty pancreas with pancreatic endocrine and exocrine function. PLoS One. 13 (12), e0209448(2018).
  5. López-Bermudo, L., et al. Contribution of liver and pancreatic islet crosstalk to β-cell function/dysfunction in the presence of fatty liver. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 892672(2022).
  6. Vilas-Boas, E. A., Almeida, D. C., Roma, L. P., Ortis, F., Carpinelli, A. R. Lipotoxicity and β-cell failure in type 2 diabetes: oxidative stress linked to NADPH oxidase and ER stress. Cells. 10 (12), 3328(2021).
  7. Martínez, M. S., et al. The role of the α cell in the pathogenesis of diabetes: a world beyond the mirror. Int J Mol Sci. 22 (17), 9504(2021).
  8. Catanzaro, R., Cuffari, B., Italia, A., Marotta, F. Exploring the metabolic syndrome: nonalcoholic fatty pancreas disease. World J Gastroenterol. 22 (34), 7660-7675 (2016).
  9. Pinnick, K. E., et al. Pancreatic ectopic fat is characterized by adipocyte infiltration and altered lipid composition. Obesity. 16 (3), 522-530 (2008).
  10. Wang, Y. D., et al. New insight of obesity-associated NAFLD: dysregulated "crosstalk" between multi-organ and the liver. Genes Dis. 10 (3), 799-812 (2023).
  11. Savage, D. B., Petersen, K. F., Shulman, G. I. Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance. Physiol Rev. 87 (2), 507-520 (2007).
  12. Shah, N., Rocha, J. P., Bhutiani, N., Omer, E. Nonalcoholic fatty pancreas disease. Nutr Clin Pract. 34 (S1), S49-S56 (2019).
  13. Chang, M. L. Fatty pancreas-centered metabolic basis of pancreatic adenocarcinoma: from obesity, diabetes and pancreatitis to oncogenesis. Biomedicines. 10 (3), 692(2022).
  14. Ou, H. Y., Wang, C. Y., Yang, Y. C., Chen, M. F., Chang, C. J. The association between nonalcoholic fatty pancreas disease and diabetes. PLoS One. 8 (5), e62561(2013).
  15. Yu, T. Y., Wang, C. Y. Impact of non-alcoholic fatty pancreas disease on glucose metabolism. J Diabetes Investig. 8 (6), 735-747 (2017).
  16. Petrov, M. S. Post-pancreatitis diabetes mellitus and excess intra-pancreatic fat deposition as harbingers of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 27 (17), 1936-1942 (2021).
  17. Mihoc, T., et al. Pancreatic morphology, immunology, and the pathogenesis of acute pancreatitis. Biomedicines. 12 (11), 2627(2024).
  18. Robinson-Junker, A. L., O'Hara, B. F., Gaskill, B. N. Out like a light? the effects of a diurnal husbandry schedule on mouse sleep and behavior. J Am Assoc Lab Anim Sci. 57 (2), 124-133 (2018).
  19. Virgilio, T., et al. Impact of prolonged isoflurane or ketamine-xylazine anesthesia with or without buprenorphine and oxygen on mouse vitals and immune responses. Lab Anim. 54, 1-8 (2025).
  20. Oh, S., Ahn, B., Lee, B. J., Nam, S. Y. Effect of humidity on postmortem changes in rats. J Vet Sci. 25 (3), e24(2024).
  21. Wu, C. T., et al. SARS-CoV-2 infects human pancreatic β cells and elicits β cell impairment. Cell Metab. 33 (8), 1565-1576.e5 (2021).
  22. Tremblay, C., Moullé, V., Zarrouki, B., Ghislain, J., Poitout, V. Immunofluorescent staining of pancreatic sections. protocols.io. , (2022).
  23. Liu, Y., et al. Electroacupuncture at ST25 mediated glial cells pruning of pancreatic TRPV1 neural synapse responds to neuropathy-associated beta cell dysfunction. Chin Med. 20 (1), 65(2025).
  24. Lu, M., et al. Electroacupuncture stimulation regulates adipose lipolysis via catecholamine signaling mediated by NLRP3 suppression in obese rats. Front Endocrinol. 12, 773127(2022).
  25. Lu, M., et al. Remodelling the inguinal adipose sensory system to switch on the furnace: electroacupuncture stimulation induces brown adipose thermogenesis. Diabetes Obes Metab. 26 (4), 1430-1442 (2024).
  26. Otsuka, N., Shimizu, K., Taniai, M., Tokushige, K. Risk factors for fatty pancreas and effects of fatty infiltration on pancreatic cancer. Front Physiol. 14, 1243983(2023).
  27. Zhang, X., Cui, Y., Fang, L., Li, F. Chronic high-fat diets induce oxide injuries and fibrogenesis of pancreatic cells in rats. Pancreas. 37 (3), e31(2008).
  28. Liu, Y., et al. Electroacupuncture at ST25 mediated glial cells pruning of pancreatic TRPV1 neural synapse responds to neuropathy-associated beta cell dysfunction. Chin Med. 20 (1), 65(2025).
  29. Liu, Y., et al. Neurophysiological mechanisms of electroacupuncture in regulating pancreatic function and adipose tissue expansion. World J Diabetes. 16 (5), 101354(2025).
  30. Jirawat, N., Srisuk, A. Obesity, metabolic syndrome, and cardiovascular disease: pathophysiological connections. Sci Acad J. 7 (1), 1-12 (2024).
  31. Fan, Y. H., et al. Inter-organ metabolic interaction networks in non-alcoholic fatty liver disease. Front Endocrinol. 15, 1494560(2025).
  32. Wang, Y. D., et al. New insight of obesity-associated NAFLD: dysregulated "crosstalk" between multi-organ and the liver. Genes Dis. 10 (3), 799-812 (2023).
  33. Zhang, X., Ji, X., Wang, Q., Li, J. Z. New insight into inter-organ crosstalk contributing to the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Protein Cell. 9 (2), 164-177 (2018).
  34. Zhang, C. L., Wang, J. J., Li, J. N., Yang, Y. Nonalcoholic fatty pancreas disease: an emerging clinical challenge. World J Clin Cases. 9 (23), 6624-6638 (2021).
  35. Corte, C. D., et al. Nonalcoholic fatty pancreas disease and nonalcoholic fatty liver disease: more than ectopic fat. Clin Endocrinol. 83 (5), 656-662 (2015).
  36. Saloman, J. L., et al. Animal models: challenges and opportunities to determine optimal experimental models of pancreatitis and pancreatic cancer. Pancreas. 48 (6), 759(2019).
  37. Hariri, N., Thibault, L. High-fat diet-induced obesity in animal models. Nutr Res Rev. 23 (2), 270-299 (2010).
  38. Lee, H. -Y., Min, K. -J. Dietary restriction and lipid metabolism: unveiling pathways to extended healthspan. Nutrients. 16 (24), 4424(2024).
  39. Rosini, T. C., Ramos da Silva, A. S., de Moraes, C. Diet-induced obesity: rodent model for the study of obesity-related disorders. Rev Assoc Med Bras (Engl Ed). 58 (3), 383-387 (2012).
  40. Uc, A., et al. Chronic pancreatitis in the 21st century - research challenges and opportunities: summary of a national institute of diabetes and digestive and kidney diseases workshop. Pancreas. 45 (10), 1365(2016).
  41. Fisher, W. E., et al. Standard operating procedures for biospecimen collection, processing, and storage: from the consortium for the study of chronic pancreatitis, diabetes, and pancreatic cancer. Pancreas. 47 (10), 1213(2018).
  42. Alexander, J., Chang, G. Q., Dourmashkin, J. T., Leibowitz, S. F. Distinct phenotypes of obesity-prone AKR/J, DBA2J and C57BL/6J mice compared to control strains. Int J Obes (Lond). 30 (1), 50-59 (2006).
  43. Nishikawa, S., Yasoshima, A., Doi, K., Nakayama, H., Uetsuka, K. Involvement of sex, strain and age factors in high-fat diet-induced obesity in C57BL/6J and BALB/cA mice. Exp Anim. 56 (4), 263-272 (2007).
  44. Levin, B. E., Dunn-Meynell, A. A., Balkan, B., Keesey, R. E. Selective breeding for diet-induced obesity and resistance in Sprague-Dawley rats. Am J Physiol. 273 (2 Pt 2), R725-R730 (1997).
  45. Kautzky-Willer, A., Harreiter, J., Pacini, G. Sex and gender differences in risk, pathophysiology and complications of type 2 diabetes mellitus. Endocr Rev. 37 (3), 278-316 (2016).
  46. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Mol Aspects Med. 34 (1), 1-11 (2013).
  47. Geer, E. B., Shen, W. Gender differences in insulin resistance, body composition, and energy balance. Gender Med. 6 Suppl 1 (Suppl 1), 60-75 (2009).
  48. Nadal-Casellas, A., Proenza, A. M., Lladó, I., Gianotti, M. Sex-dependent differences in rat hepatic lipid accumulation and insulin sensitivity in response to diet-induced obesity. Biochem Cell Biol. 90 (2), 164-172 (2012).
  49. Stubbins, R. E., Holcomb, V. B., Hong, J., Núñez, N. P. Estrogen modulates abdominal adiposity and protects female mice from obesity and impaired glucose tolerance. Eur J Nutr. 51 (7), 861-870 (2012).
  50. Liu, Y., et al. Neuromechanical dimorphism of hypoglycemic effect of electroacupuncture. Neuroendocrinology. 113 (7), 679-691 (2023).
  51. Xu, T. C., Liu, Y., Yu, Z., Xu, B. Gut-targeted therapies for type 2 diabetes mellitus: a review. World J Clin Cases. 12 (1), 1-8 (2024).
  52. Xu, T., et al. Hypoglycemic effect of electroacupuncture at ST25 through neural regulation of the pancreatic intrinsic nervous system. Mol Neurobiol. 59 (1), 703-716 (2022).
  53. Feng, X., et al. Ferroptosis enhanced diabetic renal tubular injury via HIF-1α/HO-1 pathway in db/db mice. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 626390(2021).
  54. Fang, X., et al. Beinaglutide shows significantly beneficial effects in diabetes/obesity-induced nonalcoholic steatohepatitis in ob/ob mouse model. Life Sci. 270, 118966(2021).
  55. Mao, T., et al. Semaglutide alters gut microbiota and improves NAFLD in db/db mice. Biochem Biophys Res Commun. 710, 149882(2024).
  56. Zeng, Z., et al. Bacillus amyloliquefaciens SC06 alleviates the obesity of ob/ob mice and improves their intestinal microbiota and bile acid metabolism. Food Funct. 13 (9), 5381-5395 (2022).
  57. Suriano, F., et al. Novel insights into the genetically obese (ob/ob) and diabetic (db/db) mice: two sides of the same coin. Microbiome. 9 (1), 147(2021).
  58. Owada, Y., et al. Novel non-alcoholic steatohepatitis model with histopathological and insulin-resistant features. Pathol Int. 68 (1), 12-22 (2018).
  59. Flessa, C. M., et al. Genetic and diet-induced animal models for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) research. Int J Mol Sci. 23 (24), 15791(2022).
  60. Liu, Y., et al. Electroacupuncture at ST25 mediated glial cells pruning of pancreatic TRPV1 neural synapse responds to neuropathy-associated beta cell dysfunction. Chin Med. 20 (1), 65(2025).
  61. Xu, T., et al. Hypoglycemic effect of electroacupuncture at ST25 through neural regulation of the pancreatic intrinsic nervous system. Mol Neurobiol. 59 (1), 703-716 (2022).
  62. Vimaleswaran, K. S., et al. Causal relationship between obesity and vitamin D status: bi-directional Mendelian randomization analysis of multiple cohorts. PLoS Med. 10 (2), e1001383(2013).
  63. Alvheim, A. R., et al. Dietary linoleic acid elevates endogenous 2-AG and anandamide and induces obesity. Obesity (Silver Spring). 20 (10), 1984-1994 (2012).
  64. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western diet for preclinical investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  65. D, L. Obesity due to a high-fat diet in the rat and mouse. Nutr Dieta Eur Rev Nutr Diet. 9 (1), 27-42 (1967).
  66. Lemonnier, D., Tremolieres, J. Experimental obesity induced by high-fat diets. Probl Actuels Endocrinol Nutr. 7, 77-85 (1963).
  67. Samuel, V. T., et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. J Biol Chem. 279 (31), 32345-32353 (2004).
  68. Hu, S., et al. Dietary fat, but not protein or carbohydrate, regulates energy intake and causes adiposity in mice. Cell Metab. 28 (3), 415-431.e4 (2018).
  69. Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
  70. Levin, B. E. Factors promoting and ameliorating the development of obesity. Physiol Behav. 86 (5), 633-639 (2005).
  71. Yuan, C. X., et al. Electroacupuncture alleviates diabetic peripheral neuropathy through modulating mitochondrial biogenesis and suppressing oxidative stress. World J Diabetes. 16 (2), 93130(2025).
  72. Liu, Y., et al. Neuromechanical dimorphism of hypoglycemic effect of electroacupuncture. Neuroendocrinology. 113 (7), 679-691 (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Obese Rat ModelsFatty PancreasPancreatic SteatosisHigh Fat DietDiet Induced ObesityLipid DepositionTissue HarvestingWestern BlottingParaformaldehyde FixationMetabolic Dysfunction

Related Articles