Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Formuła ziołowej lewatywy łagodzi wrzodziejące zapalenie okrężnicy, hamując aktywację gleja jelitowego za pomocą szlaku S100β/RAGE/NF-κB

563 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69571

⸱

28 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Formuła ziołowej lewatywy łącząca Sanguisorba officinalis, Bletilla striata i Acacia catechu została oceniona za pomocą profilowania LC-MS/MS, dokowania S100β, modelu DSS jelitis oraz LPS/IFN-γ-aktywowanego gleju jelitowego. Wzór uwzględnił S100β, zahamował aktywację gleja oraz zmniejszył ekspresję p-NF-κB/iNOS, co wskazuje na poprawę przez oś S100β-RAGE-NF-κB.

Streszczenie

Aktywacja komórek glejowych jelitowych (EGC) przyczynia się do patogenezy wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC). Badanie to sprawdzało, czy Dibai Enema Liquid (DBE) – ziołowa lewatywa łącząca Sanguisorba officinalis, Bletilla striata i Acacia catechu-moduluje stan zapalny wywołany EGC. Profile LC-MS/MS składników DBE i priorytetowych związków zostały zadokowane do S100β. Skuteczność oceniono w przypadku zapalenia wątka myszego wywołanego przez dextran siarczanem sodu (DSS) na podstawie masy ciała, długości jelita grubego, histopatologii oraz poziomów cytokinów (ELISA). Markery aktywacji gleja mierzono za pomocą immunohistochemii, kolokalizacji immunofluorescencji, ilościowej PCR (qPCR) oraz immunoblotowania. Model in vitro wykorzystywał CRL-2690 glej jelitowy aktywowany lipopolisacharydem i interferonem γ, z surowicą szczurów zawierającą DBE (15%) jako interwencją. Dokowanie sugerowało silne przewidywane wiązanie kilku komponentów DBE z S100β. DSS zwiększył poziom TNF-α i IL-1β, zakłócił styki ścisłe oraz podwyższył S100β/GFAP zarówno na poziomie mRNA, jak i białka, co jest zgodne z hiperaktywacją gleja; DBE znacząco cofnęło te zmiany. In vitro DBE zmniejszyło S100β, RAGE, iNOS (NOS2) oraz fosforylowało NF-κB p65. Łącznie DBE wydaje się łagodzić UC poprzez hamowanie aktywacji EGC i obniżanie osi S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, zachowując tym samym integralność błony śluzowej.

Wprowadzenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to główny podtyp zapalnej choroby jelit (IBD), charakteryzujący się przewlekłym zapaleniem błony grubej w obrocie grubym, z rosnącym globalnym obciążeniem od 1990 roku, a UC stanowi znaczną część przypadków IBD 1,2. Typowe objawy to ból brzucha i krwawa biegunka, prowadzące do znacznego cierpienia fizycznego i psychicznego oraz wysokich kosztów leczenia3. Chociaż opcje leczenia się rozszerzyły, długotrwała ekspozycja na immunomodulatory i leki biologiczne tłumiące odporność ogólnoustrojową wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chłoniaka i infekcji oportunistycznych, a część pacjentów pozostaje oporna lub nietolerancyjna4. UC jest powszechnie uważane za schorzenie immunologiczne, w którym zaburzenie homeostazy immunologicznej jest kluczowe dla patofizjologii5. Jednak narastające dowody wskazują, że same mechanizmy immunologiczne są niewystarczające, by wyjaśnić wszystkie cechy IBD; układ nerwowy jelitowy (ENS) przyczynia się do zapalenia jelit, rozszerzając pojęcie choroby na neurozapalenie w ramach poziomu 6 w ramach IBD6.

Komórki glejowate jelitowe (EGC), które przewyższają liczbę neuronów jelitowych u dorosłych ssaków, są obecnie uznawane za kluczowe regulatory homeostazy jelitowej i stanu zapalnego 7,8. EGC modulują funkcję bariery nabłonkowej, uwalniając mediatory takie jak GDNF, TGF-β1, S100β i 15d-PGJ2, wpływając tym samym na przepuszczalność i integralność błony śluzowej9. Wśród tych mediatorów S100β może aktywować kaskady w dalszej fazie – w tym szlak RAGE/NF-κB – prowadząc do uszkodzenia bariery i amplifikacji zapalnej10,11. EGC kształtują również odpowiedzi immunologiczne poprzez regulację fenotypu makrofagów i wrażliwości trzewnej za pomocą koneksyny-43 i M-CSF oraz wywierając działanie hamujące na limfocyty T in vitro, podkreślając aktywację EGC jako łatwy do leczenia cel terapeutyczny w UC12,13.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) jest coraz częściej badana w UC i wykazuje obiecujące korzyści w środowiskach klinicznych i eksperymentalnych14,15. Klasyczne połączenie Sanguisorba officinalis (Diyu) i Bletilla striata (Baiji), wraz z Acacia catechu (Ercha), jest od dawna udokumentowane dla chorób łączkowych w źródłach materia medica i jest wymienione w Chińskiej Farmakopei jako wskazania hemostatyczne, przeciwbólowe i lecznicze rany. Współczesne badania wykazują działanie antybakteryjne, przeciwzapalne, przeciwoksydacyjne i przeciwwrzodowe u tych roślin, podczas gdy A. catechu wykazuje również właściwości neuroprotekcyjne, a katechina jest ważnym składnikiem16,17. W porównaniu do konwencjonalnej systemowej immunosupresji, formuła angażująca szlaki neuroimmunologiczne skoncentrowane na EGC mogłaby oferować skuteczność uzupełniającą się z odrębnym mechanizmem i potencjalnie mniejsze ryzyko układowe związane z układem odpornościowym18,19.

Niniejsze badanie ocenia, czy połączone przygotowanie Diyu, Baiji i Ercha (DBE) łagodzi UC poprzez tłumienie aktywacji EGC. Stosuje się zintegrowane podejście: nieukierunkowane profilowanie LC-MS/MS do priorytetyzacji składników, dokowanie molekularne względem S100β, walidację w modelu dwusiarczanu sodu indukowanego zapaleniem jelita grubego oraz testy mechanistyczne w EGC. Praca podkreśla mechanizm neuroimmunologiczny – bez S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, badany w wcześniejszych terapiach UC, oraz przedstawia praktyczne implikacje dla wyboru dawki, optymalizacji formułowania oraz późniejszych badań translacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie [BUCM-2023-0912] i przeprowadzane zgodnie z instytucjonalnymi oraz krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Nie brało udziału żadnych ludzi.
Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Odczynniki i materiały

Na całym etapie stosowano rozpuszczalniki o jakości analitycznej oraz odczynniki o jakości molekularnej. Wszystkie informacje komercyjne, w tym producenci, numery katalogowe i szczegóły licencji oprogramowania, są dostępne w Tabeli Materiałów (xlsx). Woda do wszystkich przygotowań była dejonizowana i filtrowana. Wszystkie były przygotowywane świeżo lub przechowywane w warunkach określonych poniżej.

2. Sprzęt i konfiguracja oprogramowania

System UPLC-MS/MS sprzężony z kwadrupolowym spektrometrem mas pomiaru czasu lotu; chłodniczą wirówkę z wirnikem typu swing-bucket; inkubator CO₂ utrzymywany na 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności względnej ≥95%; czytnik mikropłyt (450 nm); termocykler PCR w czasie rzeczywistym; aparatury elektroforezy i blottingu; oraz mikroskop fluorescencyjny z filtrami wzbudzo-emisyjnymi. Sterowanie instrumentami i analiza danych były wykonywane w MassLynx v4.2 dla danych chromatograficznych i spektrometrycznych oraz w AutoDock 4.2 z AutoDockTools 1.5.7 do dokowania. Analiza obrazu została przeprowadzona w ImageJ/Fiji v1.53.

3. Przygotowanie płynu do lewatywy Dibai (DBE)

Mieszanka ziołowa składająca się z Diyu (50 g), Baiji (50 g) i Ercha (20 g) była grubo rozdrobnionowana i moczona w 1200 mL dejonizowanej wodzie w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zapewnić pełne nawodnienie. Namoczona mieszanka była gotowana pod intensywnym gotowaniem przez 30 minut, z okazjonalnym mieszaniem, aby zapobiec przyleganiu. Gorący wywar był filtrowany przez sterylną, wielowarstwową gazę medyczną do sterylnego szkła, aby usunąć nierozpuszczalne materiały. Filtrat był skoncentrowany próżniowo w kąpieli wodnej nie przekraczającej 45 °C, aż uzyskano koncentrat odpowiadający końcowemu stężeniu zapasowemu 1,98 g/mL (zapas wysokiej dawki). Roztwory robocze o średnich i niskich dawkach o stężeniach 0,99 g/mL oraz 0,50 g/mL przygotowywano przez rozcieńczenie z wodą zdejonizowaną sterylną do końcowych objętości 100 mL każdy. Każdy roztwór był przepuszczany przez membranę o pojemności 0,22 μm w warunkach sterylnych, podawany do oznakowanych pojemników sterylnych i przechowywany w temperaturze 4 °C przez maksymalnie siedem dni. Przed użyciem roztwory delikatnie mieszał; Akceptowalny wygląd był wyraźny lub lekko opalescyjny bez widocznych cząstek płeczkowych.

4. UPLC - analiza MS/MS DBE

Proszek z każdego składnika leczniczego był dokładnie ważony na 50 mg i ekstrahowany 1,0 mL metanolu 80% (v/v) przez mieszanie ultradźwiękowe przez 30 minut w temperaturze otoczenia. Ekstrakty były wracane do temperatury pokojowej po sonikacji, wirowane w 15 000 × g przez 10 minut w 4 °C, a supernatanty filtrowane przez błony o pojemności 0,22 μm do fiolek autosamplera. Separacja chromatograficzna przeprowadzono na kolumnie odwróconej fazy (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; typ C18 z polar-endcap) utrzymywanej w temperaturze 35 °C; kolumna, marka/model oraz numer katalogowy są podane w Tabeli Materiałów. Faza mobilna A: 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie; faza komórkowa B: acetonitryl. Przepływ: 0,30 mL/min; objętość wtrysku: 10 μL. Gradient: 5% B przez 0-2 minuty; 5→95% B od 2 do 20 min; 95% B przez 20-23 min; 95→5% B od 23,0 do 23,1 min; wyrównuj się przy 5% B do 26 minut (pełna tabela gradientu znajduje się w Tabeli 1).

Spektrometria mas wykorzystywała jonizację elektrosprayową z przełączaniem dodatnim/ujemnym oraz niezależną od danych akwizycją za pomocą skanów niskoenergetycznych i wysokich energii (MSE). Zakres masy: m/z 100-1500; napięcie kapilarne: 2,0 kV; stożek próbki: 20 V; temperatura źródłowa: 120 °C; temperatura rozpuszczalności: 360 °C; gaz stożkowy: 50 L/h; gaz rozpuszczający: 600 L/h. Funkcja wysokoenergetyczna wykorzystywała stopniową energię kolizji 20-50 eV. Dane były przetwarzane w MassLynx v4.2 z korekcją masy blokady oraz standardowymi parametrami detekcji szczytów. Kompleksowa lista 105 zidentyfikowanych składników (wzory molekularne, obserwowane m/z, czasy retencji oraz wskaźniki ufności) znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1.

5. Dokowanie molekularne

Dokowanie przeprowadzono w AutoDock 4.2 według protokołu indukowanego dopasowania. Trójwymiarowa struktura S100β (PDB 3HCM) została przygotowana przez usunięcie cząsteczek wody krystalograficznej, dodanie polarnych wodorów oraz przypisanie ładunków Kollmana. Zbudowano struktury ligandowe reprezentujące charakterystyczne składniki DBE, które były protonowane przy fizjologicznych pH i minimalizowane energicznie. Miejsce wiązania było określone przez współrzędne rodzimego ligandu; pozostałości aminokwasowe w promieniu 6 Å od natywnego ligandu traktowano jako elastyczne podczas dokowania. Siatki obejmowały całą kieszeń z odstępem siatki 0,375 Å. Parametry algorytmów genetycznych Lamarckian to: wielkość populacji 150; do 2,5 × 10⁶ oceny energii; 100 niezależnych biegów na ligand. Ostateczne pozy były klasyfikowane według przewidywanej wolnej energii wiązania i grupowane według RMSD; wzorce interakcji (wiązania wodorowe, kontakty hydrofobowe, interakcje π-π) zostały zwizualizowane pod kątem zgodności ze znanymi kompleksami S100β.

6. Model zwierzęcy zapalenia jelita grubego wywołanego DSS i leczenia DBE

Samce myszy C57BL/6J (8 tygodni, 20-22 g) były aklimatyzowane przez co najmniej 7 dni w temperaturze 22 ± 2 °C, wilgotności względnej 50%-60%, cyklu światła-ciemności 12 godzin, z jedzeniem i wodą ad libitum. Zwierzęta zostały losowo podzielone na sześć grup (n = 10 na grupę): kontrola, model dextran siarczanu sodu (DSS), kontrola pozytywna z sulfasalazyną (SASP) oraz leczenie DBE w niskich, średnich i wysokich dawkach. Personel odpowiedzialny za oceny histologiczne i kwantyfikację obrazów był niewidziany na przydział grup.

Eksperymentalne zapalenie grubości wywoływało 2,0% (w/v) DSS w wodzie pitnej przez 7 dni, następnie 1,0% DSS przez 3 dni, a następnie zwykłą wodą przez 4 dni przed eutanazją. DBE podawano raz dziennie przez lewatywę w dawce 10 mL/kg, przy użyciu elastycznego cewnika wprowadzonego 2,5 cm do odbytnicy; zwierzęta trzymano pionowo przez 30 minut, aby zminimalizować przecieki. Dzienne dawki DBE wynosiły odpowiednio 12,35, 27,4 i 49,4 g/kg dziennie dla grup niskich, średnich i wysokich; SASP podawano w dawce 0,5 g/kg/dzień jako kontrolę pozytywną. Codziennie rejestrowano masę ciała, konsystencję stolca oraz utajoną krew w kału, aby obliczyć wskaźnik aktywności chorobowej. Na końcu myszy zostały znieczulone pentobarbitalem sodowym 50 mg/kg i.p.; Krew pobierano z zatoki retrooczodołowej za użyciem heparynizowanych naczyń włosowatych; zwierzęta były uśpione przez zwichnięcia szyjki macicy. Jelita gruba została wycięta z połączenia kościowo-kościowego do odbytnicy, delikatnie wyprostowana, a długość mierzona przy minimalnym napięciu. Reprezentatywne segmenty były utrwalone w 4% paradehydu; pozostałe tkanki były zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze −80 °C.

7. Przygotowanie surowicy zawierającej leki

Samce szczurów Sprague-Dawley zostały losowo przydzielone do grup kontrolnych i DBE (n = 6/grupa). Grupa DBE otrzymywała 12,34 g/kg/dzień doustnie przez doustne dawki raz dziennie przez 7 dni; sterowanie otrzymywało oczyszczoną wodę o równej objętości. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej dawce zwierzęta zostały znieczulone, a z aorty brzusznej pobrano pełną krew. Serum było oddzielane po zakrzepnięciu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez 10 minut w 1500 × g w 4 °C. Sera była inaktywowana cieplnie w temperaturze 56 °C przez 30 minut i filtrowana przez membrany o pojemności 0,22 μm w warunkach sterylnych przed przechowywaniem. Serum było alicytatowane do jałowych probówek i przechowywane w temperaturze −80 °C. Próbki hemolizowane, zidentyfikowane przez podwyższoną absorpcję około 414 nm, zostały wykluczone.

8. Badanie histologiczne (H&E)

Tkanka gruba utrwalona w 4% paraformaldehydu przez 24 godziny była odwodniona przez oklasowane etanole, oczyszczana w ksylenie i osadzona w parafinie. Fragmenty (5 μm) były cięte, deparafinizowane, nawilżane i barwione hematoksyliną przez 5 minut, zaniebite w bieżącej wodzie przez 5 minut oraz barwione eozyną przez 2 minuty. Preparaty montowano żywicą i badało pod kątem architektury krypt, gęstości komórek pucharowych, ciągłości nabłonka oraz infiltracji zapalnej. Reprezentatywne zmiany będą oznaczane strzałkami/grotami i określone w legendach rysunków; W legendach zostaną określone paski skali (np. 200 μm) oraz zdefiniowane progi wizualne.

9. Immunohistochemia (IHC)

Sekcje parafiny były pobierane antygenem w buforze cytrynianowym (pH 6,0) przez 15-20 minut w temperaturze 95-98 °C, chłodzone endogenną nadoksydazą 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut oraz blokowane przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 5% normalną surowicą. Przeciwciała pierwotne inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C w nawilżonej komorze. Po umyciu przekroje były przetwarzane za pomocą systemu wykrywania streptawidyny-peroksydazy, opracowanego z DAB przez 2 minuty (monitoring mikroskopowy), następnie kontrumabiowane hematoksyliną, odwodnione i montowane. W każdej partii uwzględniono negatywne kontrole, które nie posiadały pierwotnego przeciwciała.

10. Analiza immunofluorescencji (IF)

Fragmenty osadzone w parafinie zostały deparafinizowane i poddane pobieraniu antygenów w buforze EDTA (pH 8,0). Po schłodzeniu niespecyficzne wiązanie zostało zablokowane za pomocą 3% albuminy surowicy bydłej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sekcje inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko GFAP (1:500) i S100β (1:200), a następnie przez 1 godzinę w ciemności zastosowano przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforem (1:500). Jądra były barwione DAPI, a zamki montowano w medium antyfade. Obrazy były wykonywane identycznymi obiektywami, z stałym czasem naświetlania 100 ms oraz wzmocnieniem detektora 1,0 w różnych grupach. Średnia intensywność fluorescencji została zidentyfikowana w ImageJ/Fiji v1.53 po kalibracji rozmiaru pikseli, odejmowaniu tła (promień kuli toczącej się 50 pikseli) oraz normalizacji do obszaru DAPI-dodatniego. Przeanalizowano co najmniej pięć biologicznych replikacji na grupę oraz trzy niepokrywające się pola na replikację.

11. Hodowla komórek i leczenie

Komórki glejowate szczurów jelitowych (oznaczenie CRL-2690) zostały wyhodowane w DMEM z dodatkiem 10% surowicy wołowej płodu i 1% penicylin-streptomycyny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂. Tożsamość komórek potwierdzono poprzez krótkie powtarzanie powtórzeń tandemowych, a hodowle były wolne od mykoplazmy. Eksperymenty przeprowadzono w fragmentach 5-15. Komórki były zasiewane na płytkach z 6 dołkami o wielkości 2,0 × 10⁵ komórek/dołek w medium 2,0 mL/dołek i pozostawiano do przyczepienia przez 24 godziny. Grupy eksperymentalne to: kontrola nieleczona, kontrola pojazdu, model, surowica DBE oraz inhibitor.

Do indukcji modelu komórki były wystawione na działanie lipopolisacharydu (LPS, 1 μg/mL) oraz IFN-γ (20 ng/mL) przez 24 godziny w pełnym nośniku; odpowiadająca wartość U/mL dla IFN-γ jest podawana w Tabeli Materiałów według mocy danej partii. W leczeniu surowicą DBE komórki otrzymały 15% (v/v) inaktywowane cieplnie (56 °C, 30 min), 0,22 μm-filtrowane surowicę szczurów zawierającą DBE w kompletnym medium przez 24 godziny (zakres dawki 5%-20% stosowany jest w optymalizacji żywotności zgodnie z sekcją CCK-8). Do leczenia inhibitorów stosowano selektywny inhibitor S100β SBI-4211 (10-50 μM; 45 μM dla odczytów kluczy) przez 24 godziny. Sterowanie pojazdem odpowiadało zawartości rozpuszczalnika (0,1% DMSO (v/v)) z identycznym medium. O ile nie zaznaczono inaczej, zabiegi przygotowywano w podgrzanym (37 °C) medium, a komórki płukano 2× PBS przed zastępcą leczenia. Po leczeniu komórki zostały pobrane do ekstrakcji RNA, analizy białek oraz immunofluorescencji, jak opisano w kolejnych sekcjach. Replikacja biologiczna wymagała n ≥ 5 niezależnych hodowli na każde warunki.

12. Badanie żywotności CCK-8

Komórki były zasiewane na płytach 96-dołkowych o pojemności 5 × 10³ komórek/dołek w medium 100 μL i pozostawiano do przylegania przez noc. Medium zostało zastąpione medium zawierającym surowicę obtraktowaną DBE w ilości 5%, 10%, 15% lub 20% (v/v) przez 24 godziny. Dodano odczynnik CCK-8 (10 μL/well), a płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Absorpcja była odczytywana przy 450 nm z odejmowaniem pustych (medium + odczynnik, brak komórek). Żywotność wyrażano jako procent kontroli pojazdu. Każdy stan wykorzystywał n ≥ 5 biologicznych replikatów (niezależnych hodowli) z trzema replikami technicznymi na hodowlę.

13. ELISA dla cytokin tkankowych

Tkanka jelita grubego została ujednolicona na lodzie w PBS (1:9, w/v) zawierającym inhibitory proteazy. Homogenity były klarowane przez 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; supernatanty były badane na IL-1β i TNF-α zgodnie z protokołami zestawu. Standardy i próbki były wykonywane w duplikacie, a krzywe wyposażono w czteroparametrowy model logistyczny (4PL) o R² ≥ 0,99; standardy wstecznie obliczone były akceptowane w granicach 85%-115% nominalnych. Absorpcja była odczytywana przy 450 nm z odniesieniem 620-650 nm, gdy było dostępne. Stężenia cytokin zostały znormalizowane do masy tkanki (pg/mg tkanki). Każda grupa obejmowała n ≥ 5 biologicznych replikacji.

14. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Całkowite RNA z tkanki jelita grubego (lub komórek, w zależności od przypadku) zostało wyizolowane za pomocą zestawu spinowego z błoną krzemionkową. Integralność RNA została potwierdzona przez inspekcję A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1 oraz inspekcję żelowo-agarozową. Pierwsza nić cDNA została zsyntetyzowana z 1 μg RNA poprzez usunięcie DNA genomowego. qPCR używał mieszanki SYBR Green master na skalibrowanym termocyklerze z programem: 95 °C 30 s; 40 cykli 95 °C 5 s, 60 °C 30 s; krzywa topnienia 65-95 °C w 0,5 °C/5 kroków s. GAPDH pełnił funkcję endogennej kontroli. Wyrażenie względne obliczono przez 2⁻ΔΔCt po weryfikacji sprawności sprawności pierwotnej (90%-110%, na podstawie nachyleń krzywej standardowej). Wprowadzono sterowanie bez RT i bez szablonów. Sekwencje pierwsze są wymienione w Tabeli 2. Każda grupa miała n ≥ 5 biologicznych replikacji oraz dwa powtórzenia techniczne na próbkę.

15. Analiza zachodniej plamy

Białka z tkanki jelita grubego (lub komórek) były ekstrahowane w buforze RIPA z inhibitorami proteazy/fosfatazy i ilościowo określane za pomocą testu BCA. Białko o jednakowej wartości (30 μg/linia) zostało denaturowane, rozwiązane na gradientowym SDS-PAGE 4-20% i przeniesione do PVDF (0,45 μm; 0,2 μm dla celów ≤ 20 kDa). Błony były blokowane w mleku odtłuszczonym 5% na 2 godziny w temperaturze pokojowej i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko GFAP (1:1 000), S100β (1:1 000), iNOS (1:1 000), NF-κB p65 (1:1 000), fosfo-NF-κB p65 (Ser536, 1:1 000), Okludynie (1:1 000), Claudin-1 (1:1 000) i GAPDH (1:5 000). Sprzężone z HRP przeciwciała wtórne (1:5 000) były stosowane przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały były rozwijane z użyciem ECL; Czasy ekspozycji były ograniczone do liniowego zakresu dynamicznego (10-90 s). Transfery weryfikowano poprzez odwracalne barwienie błonowe przed zablokowaniem. Intensywność pasm została zmierzona w ImageJ/Fiji v1.53 po odejmowaniu tła i znormalizowana do GAPDH. Oczekiwane masy cząsteczkowe: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Każda analiza zawierała n ≥ 5 biologicznych replikacji.

16. Analiza statystyczna

Dane zostały przeanalizowane w GraphPad Prism 8.0 i przedstawione jako średnia ± SEM. Do porównań wielogrupowych zastosowano jednokierunkową metodę ANOVA, a następnie test post hoc Tukeya; do porównań parowych zastosowano niesparowane dwustronne testy t-testy Studenta, gdy to było stosowne. Dla projektów czasowo-kursowych lub dwuskładnikowych (np. leczenie × dawki lub leczenia × czasie) stosowano dwukierunkową ANOVA (powtarzane pomiary, gdy dotyczy) z korektą Tukeya lub Dunnetta, zgodnie z określonymi w legendach rysunków. Testy Shapiro-Wilka i Levene'a służyły do badania normalności i homoskedastyczności przed testami parametrycznymi; gdy założenia były naruszane, dane były przekształcane logarytmicznie lub analizowane odpowiednimi testami nieparametrycznymi (Kruskal-Wallis z post hoc Dunna; Mann-Whitney U dla par). Dokładne wartości p i miary wielkości efektu (η² dla ANOVA, d Cohena dla testów t) są podawane w legendach rysunków, jeśli to możliwe. Statystycznie uznano dwustronne p < 0,05. Legendy figur używają następującej notacji znaczenia: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 vs Control; # s<0.05, ## s<0.01, ### p<0.001 kontra DSS; NS, nieistotny.

17. Oczekiwane wyniki i kontrola jakości

Oczekuje się, że DSS skróci długość jelita grubego, podniesie wskaźnik aktywności choroby oraz wywoła uszkodzenia histologiczne (zniekształcenia architektoniczne krypt, wyczerpanie komórek pucharowych, erozja nabłonka). Leczenie DBE powinno zależnie od dawki poprawiać te wskaźniki i zmniejszać aktywację markerów jelita jelitowo-glejowego. Western blomy powinny wykazywać pasma o masach cząsteczkowych wymienionych powyżej, z zwiększonym sygnałem w DSS i tłumieniem w DBE lub SBI-4211; ekspozycje powinny pozostawać w zakresie dynamicznym liniowym. Immunofluorescencja dla GFAP i S100β powinna wykazać podwyższone średnie intensywności w DSS oraz zmniejszenie po leczeniu DBE. Chromatogramy LC-MS/MS powinny wykazywać stabilne czasy retencji (dryf ≤ 0,2 min) oraz dokładność masy w zakresie ± 5 ppm dla jonów referencyjnych, z charakterystycznymi jonami fragmentami dla kluczowych składników. Negatywne kontrole (np. pominięcie przeciwciał pierwotnych) nie powinny dawać żadnego specyficznego sygnału. Parametry pozyskiwania obrazów (obiektywność, ekspozycja, wzmocnienie, gamma) muszą pozostać stałe w różnych grupach, aby umożliwić wiarygodne porównania ilościowe.

18. Notatki dotyczące rozwiązywania problemów

Mętność lub cząstki w roztworach DBE wskazują na niewystarczającą filtrację lub wydzielanie; powtórz filtrację 0,22 μm i potwierdź pH 6,5-7,5. Nadmierna śmiertelność lub poważna utrata masy ciała podczas ekspozycji na DSS sugeruje nadmierne indukcje; zmniejszaj stężenie DSS, weryfikuj masę cząsteczkową partii i codziennie wymieniaj roztwory DSS. Niespójna ilościowa ilościowa immunofluorescencja zazwyczaj odzwierciedla zmienną ekspozycję; Ustalić czas naświetlania i wzmocnienie oraz dołączyć slajd referencyjny do kalibracji wsadowej. Słabe pasma zachodnich blot mogą odzwierciedlać niedociążenie lub nieefektywność transferu; Zweryfikować ilość białka, wybrać odpowiedni procent lub gradient żelu oraz potwierdzyć transfer poprzez odwracalne barwienie błonowe. Słabe dopasowanie ELISA (R² < 0,99 lub standardowe obliczenia wsteczne powyżej 85-115%) uzasadniają powtórzenie krzywej standardowej i ponowne badanie rozcieńczonych próbek. Dla prac qPCR z wydajnością podkładową powyżej 90-110% ponownie zoptymalizuj temperaturę wyżarzania lub stężenie podkładu przed analizą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Identyfikacja składników DBE i surowicy zawierającej leki

LC-MS/MS zidentyfikował 105 unikalnych składników chemicznych w DBE, z błędem masowym < 10 ppm. Identyfikację potwierdzono wzorem molekularnym, wzorem izotopowym oraz dopasowaniem fragmentów. Główne klasy obejmowały triterpeny, flawonoidy, bifenantreny oraz kwasy organiczne. Serum zawierające lek ujawniło 59 składników pochodzących z DBE po odejmowaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to przewlekła zapalna choroba jelit o wieloczynnikowej patogenezie. Oprócz zaburzeń odpowiedzi immunologicznej, dysfunkcja bariery nabłonkowej jelitowej oraz dysbioza mikrobioty jelitowej są dobrze znanymi czynnikami, a nieprawidłowości układu nerwowego jelitowego (ENS) są coraz częściej identyfikowane jako kluczowy czynnik postępu UC23. Konkretnie, zarówno strukturalne, jak i funkcjonalne zaburzenia regulacji ENS mogą nasilać stan zapalny śluzówki i nasi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały wsparte przez Projekt Budowania Wysokopoziomowych Kluczowych Dyscyplin Medycznych Narodowej Administracji Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (ZYYSZX-2023256).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AutoDock 4.2Oprogramowanie dokujące molekularne-Instytut Badawczy Scripps
Dekran-siarczan sodu (DSS)Substancja chemiczna wywołująca zapalenie jelita grubego u myszy9011-18-1Sigma-Aldrich
Płyn do lewatywy Dibai (DBE)Mieszanka ziołowa do leczenia wrzodziejącego zapalenia jelita grubego-Uniwersytet Medycyny Chińskiej w Pekinie
DMEM (Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco)Pożywka hodowla komórkowa11965-092Thermo Fisher
Serum bydła płodu (FBS)Suplement do hodowli komórkowej16000-044Thermo Fisher
Mikroskop fluorescencyjnyInstrument do obrazowania immunofluorescencyjnego-Olympus
LC-MS/MS SystemSpektrometr mas do analizy LC-MS-Waters Corporation
Lipopolisacharyd (LPS)Wywoływacz stanu zapalnego w hodowli komórkowejL2630Sigma-Aldrich
PCR Termiczny CyklerWyposażenie do qPCRT100Bio-Rad
Przeciwciało pierwotne (S100)Przeciwciało do wykrywania białka S100ABC1234Abcam
Zestaw do testowania białek (BCA)Zestaw do ilościowania białek23225Thermo Fisher
Rekombinowany interferon (IFN)Cytokina do aktywacji EGC w hodowli komórkowej-Sigma-Aldrich
Przeciwciało wtórne (sprzężone z HRP)Przeciwciało wtórne dla immunohistochemiiXYZ5678Thermo Fisher
Sulfazalazyna (SASP)Pozytywna kontrola wrzodziejącego zapalenia jelita grubego-Sigma-Aldrich
Western blot EquipmentSystem elektroforezy do analizy białek-Bio-Rad

Bibliografia

  1. Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
  2. Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
  3. Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
  4. Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
  5. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
  6. Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
  7. Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
  8. Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
  9. Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
  10. Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
  11. Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
  12. Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
  13. Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
  14. Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
  15. Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
  16. Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
  17. Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
  18. He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
  19. Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
  20. Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
  21. Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
  22. Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
  23. Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
  24. Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
  25. Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
  26. Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
  27. Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
  28. Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
  29. Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
  30. Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
  31. Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
  32. Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
  33. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
  34. Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
  35. Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
  36. Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enteryczne kom rki glejoweszlak S100sygnalizacja RAGEaktywacja NF Bmodel zapalenia jelita grubego indukowanego DSSimmunohistochemiapoziomy cytokinpo czenia cis e
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.