Związek między długością telomerów a tyrotoksiozą: wnioski z badania randomizacji Mendla na dwóch próbkach

Podsumowanie

Protokół ten opisuje dwupróbowy pipeline randomizacji Mendelowskiej, oceniający, czy długość telomerów przyczynowo wpływa na ryzyko tyrotoksiozy, korzystając z publicznych danych genetycznych podsumowań. Obejmuje wybór instrumentów, harmonizację, estymację pierwotną, analizy czułości oraz powtarzalny kod R z gotowymi do ilustracji wynikami, wspierającymi przejrzyste raportowanie.

Streszczenie

Tyrotoksikoza to zaburzenie endokrynologiczne charakteryzujące się nadmiarem hormonów tarczycy, jednak jej etiologiczne powiązania z biologią starzenia się ogólnoustrojowego pozostają niedo do końca zdefiniowane. Długość telomerów (TL) odzwierciedla starzenie się komórkowe i stabilność genomu i była powiązana z wieloma złożonymi chorobami. Przeprowadziliśmy dwupróbne badanie randomizacji Mendelowskiej (MR), aby ocenić przyczynowy wpływ genetycznie przewidywanego TL na ryzyko tyrotoksiozy. Instrumenty genetyczne do TL pochodzą z dużego badania asocjacji genomowej (GWAS) europejskiego pochodzenia (n > 470 000). Statystyki podsumowania dotyczące tyrotoksiozy pochodzą z najnowszego wydania FinnGen (≈4 000 przypadków i >210 000 kontrolnych). Podstawowe analizy ważone odwrotną wariancją wykazały, że dłuższy genetycznie zastępowany TL wiąże się z niższym ryzykiem tyrotoksiozy, a kierunek i wielkość efektu były spójne dla komplementarnych estymatorów (MR-Egger, ważona mediana/maksymalne prawdopodobieństwo, MR-PRESSO i MR-RAPS). Analizy czułości nie wykazały obecności kierunkowej plejotropii, a do oceny heterogeniczności zastosowano metodę Q Cochrana. Test kierunkowości Steigera potwierdził przepływ przyczynowy od TL do tyrotoksiozy.

Z naszej wiedzy, ta praca jest jedną z pierwszych analiz MR, które oceniają związek przyczynowy między ogólnym ryzykiem tyroksysykozy a TL z wykorzystaniem współczesnych zasobów GWAS, rozszerzając wcześniejsze dowody dotyczące fenotypów związanych z nadczynnością tarczycy. Wyniki te sugerują, że procesy starzenia komórkowego indeksowane przez TL mogą przyczyniać się do podatności na tyrotoksikozę i motywować przyszłe badania podłużne i mechanistyczne nad biologią telomerów w zaburzeniach funkcji tarczycy.

Wprowadzenie

Tyrotoksikoza to powszechna choroba endokrynna charakteryzująca się nadmiernym krążeniem hormonów tarczycy. Typowe objawy to utrata masy ciała, tachykardia, drażliwość, lęk i drżenie, przy czym ciężkie przypadki predysponują do arytmii, niewydolności serca i utraty kości¹. Chociaż cechy kliniczne i strategie terapeutyczne są stosunkowo dobrze ugruntowane, mechanizmy biologiczne kształtujące podatność i postęp międzyosobowości pozostają niedo do końca zdefiniowane. Etiologia obejmuje nadorganizmy autoimmunologiczne (np. choroba Gravesa), toksyczne guzki, zapalenie tarczycy, ekspozycję na hormony egzogenne, reakcje lekowe oraz przyczyny związane z nowotworami². W tych jednostkach aktywacja immunologiczna, stres oksydacyjny oraz zmieniona biogeneza mitochondriów powtarzają się jako prawdopodobne motywy mechanistyczne łączące nadmiar hormonów z uszkodzeniami tkanek i powikłaniami ogólnoustrojowymi.

Długość telomerów (TL) – struktura DNA powtarzająca się w tandemie, która pokrywa końce chromosomów – integruje starzenie się komórek, historię replikacji oraz stabilność genomu. TL skraca się wraz z podziałem komórek i jest przyspieszany przez stres oksydacyjny oraz przewlekłe zapalenie, które są również istotne w zaburzeniach funkcji tarczycy ^3,4. Krótki TL był związany z zaburzeniami kardiometabolicznymi, niektórymi nowotworami oraz chorobami neurodegeneracyjnymi⁵, a nowe dane sugerują powiązania z fenotypami endokrynnymi, takimi jak otyłość i cukrzyca typu 2, w których osi hormonalne i immunofiometryczne przecinają się ze stresem replikacyjnym⁶. Biorąc pod uwagę, że hormony tarczycy regulują podstawową przemianę metabolizmu, funkcję mitochondriów oraz sygnalizację proliferacyjną, dynamika TL może być szczególnie istotna w stanach tarczycy, gdzie ogólnoustrojowa hipermetabolizm i zaburzenia odpornościowe mogą zarówno wpływać, jak i być pod wpływem biologii telomerów ^7,8.

Jednak czy TL odgrywa przyczynową rolę w tyrotoksykozie, pozostaje niejasne. Konwencjonalne badania obserwacyjne są podatne na zakłócenia (np. styl życia, choroby współwystępujące) oraz odwrotne przyczynowości (choroba dotykająca TL). Aby złagodzić te ograniczenia, stosujemy dwupróbową randomizację mendelowskią (MR), która wykorzystuje warianty genetyczne linii zarodczej silnie powiązane z TL jako niezakłócone narzędzia do testowania jego wpływu na ryzyko chorób⁹. Badania asocjacyjne na poziomie całego genomu dostarczają obecnie wystarczająco silnych narzędzi TL oraz dużych, dobrze fenotypowanych zbiorów wyników danych, co umożliwia rygorystyczną ocenę przyczynowości¹⁰. Integrując epidemiologię genetyczną z biologią telomerów, badanie ocenia, czy genetycznie zastępczy TL wpływa na ryzyko tyrotoksiozy, tym samym wyjaśniając szlaki mechanistyczne i badając TL jako kandydata na biomarker do stratyfikacji ryzyka i rozwoju przyszłych interwencji.

Z naszej wiedzy wynika, że ta analiza jest jednym z pierwszych badań MR, które analizują ogólne ryzyko tyrotoksikozy w odniesieniu do TL z wykorzystaniem współczesnych zasobów GWAS, rozszerzając wcześniejsze badania koncentrujące się głównie na fenotypach związanych z nadczynnością tarczycy lub autoimmunologicznych chorobach tarczycy¹¹.

Protokół

Badanie to stosuje dwupróbowy projekt randomizacji Mendelowskiej (MR), aby ocenić, czy genetycznie zastępowana długość telomerów (TL) przyczynowo wpływa na ryzyko tyrotoksicy. Stosowano jedynie odprofilowane, publicznie dostępne podsumowania statystyk GWAS i nie uzyskano dostępu do danych na poziomie indywidualnym. Instytucjonalna Komisja Przeglądowa Szpitala Miejskiego w Qingdao uznała, że analiza jest zwolniona z dalszej kontroli, ponieważ opiera się wyłącznie na publicznych danych podsumowujących. Wszystkie współdziałające badania asocjacji na poziomie całego genomu uzyskały świadomą zgodę i etyczne zatwierdzenia zgodnie z oryginalnymi protokołami. Analiza została skonstruowana tak, aby minimalizować zakłócenia i odwracać przyczynowość poprzez wykorzystanie wariantów linii zarodkowych związanych z TL jako niezakłóconych narzędzi oraz poprzez wdrożenie procedur wrażliwości do analizy plejotropii, heterogeniczności i kierunku efektu.

Źródła danych
Zbiór danych ekspozycji dla TL został pozyskany z IEU OpenGWAS pod identyfikatorem ieu-b-4879, obejmujący około 472 174 uczestników pochodzenia europejskiego. Zestaw danych wyników dla tyrotoksiozy pochodzi z konsorcjum FinnGen, wykorzystując końcowy punkt finn-b-thyROTOXICOSIS z 2021 roku, obejmując 4 142 przypadki i 213 693 kontrolne. Zasoby te dostarczają skutecznych szacunków i błędów standardowych niezbędnych do budowy instrumentów na poziomie SNP, harmonizacji alleli oraz szacowania efektów przyczynowych za pomocą ustalonych estymatorów MR.

Środowisko oprogramowania i informatyki
Wszystkie analizy przeprowadzono w języku R (wersja 4.3.1). Głównym pakietem analitycznym był TwoSampleMR (wersja 0.5.7), uzupełniony o ieugwasr do programowego dostępu do zasobów GWAS, MRPRESSO do wykrywania odstających i testowania zniekształceń, mr.raps do solidnego estymowania przy słabych instrumentach i idiosynkratycznej pleiotropii, RadialMR do wizualizacji radialnej oraz pakiety ogólnego przeznaczenia, w tym tidyverse i data.table. Informacje o sesji i wersje pakietów są zapisywane do pliku, aby zapewnić ścisłą powtarzalność.

Podstawowe założenia randomizacji mendelowskiej
Ramy MR zakładają, że instrumenty genetyczne są silnie powiązane z TL, są niezależne od czynników zakłócających związek między TL a tyrotoksiozą oraz wpływają na tyrotoksikozę wyłącznie poprzez TL, a nie przez alternatywne szlaki. Plan analizy operacjonalizuje te założenia poprzez ilościowe określenie siły dla poszczególnych wariantów, testowanie niezrównoważonej poziomej plejotropii metodami opartymi na przecięciu i przesiewaniu odstających (outreer), ocenę heterogeniczności między wariantami oraz potwierdzając kierunek działania TL-do-tyrotoksiozy za pomocą formalnego testu kierunkowości¹².

Dobór instrumentów i kontrola jakości
Instrumenty genetyczne zostały wybrane z TL GWAS z progiem istotności dla całego genomu p < 5×^10-8. Aby zapewnić niezależność, zaburzenia sprzężenia zostały rozwiązane poprzez zgrupowanie w zakresie r² = 0,001 w oknie 10 000 kb, korzystając z europejskich danych referencyjnych z projektu 1000 genomów; gdzie warianty były skorelowane, zachowywano wariant z mniejszą wartością p dla powiązania z TL. Wytrzymałość instrumentów była podsumowana dla każdego wariantu za pomocą statystyki F_i = \beta_{E,i}^{2}/\mathrm{SE}(\beta_{E,i})^{2} i oceniana według konwencjonalnego F > 10 kryterium^13,14. Tam, gdzie to stosowne, przybliżenie Sandersona-Windmeijera zostało odwołane do opisania łącznej siły instrumentów w wielu wariantach w próbie o rozmiarze N, przy czym instrumenty K wyjaśniały wariancję ekspozycji R^{2}: F_{\mathrm{SW}} = \{[R^{2}/(1-R^{2})]\,(N-K-1)\}/K ¹⁵. Niejednoznaczne warianty palindromiczne z częstotliwością alleli bliską 0,5 zostały wykluczone, chyba że informacje o częstotliwości alleli pozwalały na jednoznaczne dopasowanie.

Harmonizacja
Dla każdego instrumentu wyodrębniono odpowiadające mu powiązanie z tyrotoksikozą z FinnGen i wyrównano go tak, aby rozmiary efektu odzwierciedlały ten sam allel efektu w obu aspektach ekspozycji i wyniku. Harmonizacja usunęła niedopasowania alleli, skorygowała problemy z wątkami oraz wykluczyła palindromiczne SNP z nierozwiązaną niejednoznacznością, tworząc zbiór danych odpowiedni do prawidłowej konstrukcji stosunku Walda.

Pierwotna estymacja przyczynowa
Analiza podstawowa wykorzystała estymator ważony odwrotną wariancją (IVW) do metaanalizy specyficznych dla SNP stosunków Walda w zbiorczym efekcie przyczynowym¹⁶. Szacunki podawane są jako ilorazy szans na jedno odchylenie standardowe wzrostu w TL, z 95% przedziałami ufności wyprowadzonymi według modeli o stałym i losowym efektie. Wybór modelu był prowadzony przez diagnostykę heterogeniczności, a obie specyfikacje zostały przedstawione w celu ułatwienia solidnej interpretacji.

Analizy czułości i kontrole odporności
Odporność oceniano za pomocą regresji MR-Egger z wyrazem przecięcia do testu niezrównoważonej pleiotropii kierunkowej, estymacji maksymalnej wiarygodności w celu poprawy wydajności przy jednoczesnym ograniczeniu błędu pomiarowego, MR-PRESSO do wykonania globalnego testu wartości odstających oraz oszacowania zniekształceń i efektów skorygowanych przez odstające oraz MR-RAPS do oszacowania odporności na słabe instrumenty i idiosynkratyczną pleiotropię¹⁷. Heterogeniczność między wariantami została zmierzona za pomocą statystyki Q Cochrana w ramach IVW¹⁸. Kierunek działania analizowano za pomocą testu Steigera, który porównuje proporcje wariancji wyjaśnionej w narażeniu i wyniku, aby określić, czy dane są bardziej zgodne z TL powodującym tyroksyksykozę niż odwrotnie. Przechwycenie MR-Egger zostało użyte jako formalny test kierunkowej plejotropii. Analizę "wyklucz jeden z nich" został sprawdzony, aby upewnić się, że ogólne powiązanie nie wynika z żadnego pojedynczego wariantu.

Odwrotna randomizacja mendelowska
Aby zbadać potencjalną odwrotną przyczynowość, powtarzano proces analityczny z tyroksykozą jako narażeniem i TL jako wynikiem. Zastosowano te same kryteria wyboru instrumentów, procedury harmonizacji, pierwotny estymator IVW oraz analizy wrażliwości, dzięki czemu wnioski dotyczące kierunkowości są wyciągane w identycznym kontekście przyczynowym.

Wielokrotne testowanie, zasilanie i raportowanie
Główny test hipotez dotyczy estymatora IVW dotyczącego wpływu TL na tyrotoksiozę. Estymatory czułości i testy diagnostyczne interpretowane są jako dowody wspierające; wartości p są podawane w notacji naukowej dla jasności, a wnioski kładą nacisk na spójność między metodami, a nie na izolowane progi istotności. Podsumowania siły instrumentów oraz wyjaśniony udział wariancji dostarczają przybliżonej mocy według standardowych formuł niecentralnych, uznając, że moc zależy od wielkości próby, siły instrumentu oraz rzeczywistej wielkości efektu.

Powtarzalność obliczeniowa i polecenia dokładne
Powtarzalność jest zapewniona poprzez dostarczanie pełnej sekwencji poleceń R, które odtwarzają wybór instrumentów, ekstrakcję wyników, harmonizację, analizy pierwotne i czułości, odwróconą MR, wyniki diagnostyczne oraz eksport plików gotowych do analizy. Skrypt zapisuje stabilne, czytelne dla człowieka pliki CSV odpowiadające liście instrumentów, zharmonizowanemu zbiorowi danych oraz podsumowaniu szacunków MR i diagnostyki.

# R 4.3.1; TwoSampleMR 0.5.7
# Instalacja opcjonalna:
# install.packages(c("TwoSampleMR", "ieugwasr", "MRPRESSO", "mr.raps",
"RadialMR", "tidyverse", "data.table"))

library(TwoSampleMR)
Biblioteka (ieugwasr)
biblioteka (MRPRESSO)
Biblioteka (Mr.Raps)
biblioteka (RadialMR)
Library(Tidyverse)
library(data.table)

# Ekspozycja: długość telomerów (IEU OpenGWAS)
exposure_id <- "Ieu-B-4879"

# Wynik: Końcowy punkt FinnGen 2021 dotyczący tyrotoksiozy użyty w raportowanych analizach
outcome_id <- "finn-b-thyROTOKSYKOZA"

# Dobór instrumentów z progiem całego genomu i ścisłym zlepianiem LD
exp <- extract_instruments (wyniki = exposure_id, p1 = 5e-8, clump = TRUE, r2 = 0,001, kb = 10000)
exp$F_stat <- (exp$beta.exposure^2) / (exp$se.exposure^2)
fwrite(exp, "S1_instruments_TL.csv")

# Ekstrakcja i harmonizacja wyników
Out <- extract_outcome_data(snps = exp$SNP, wyniki = outcome_id)
dat <- harmonise_data(exp, out, akcja = 2)
fwrite(dat, "S2_harmonised_TL_vs_thyrotoxicosis.csv")

# Pierwotne MR i estymatory czułości
Res <- Mr(dat, method_list = C("mr_ivw","mr_ivw_fe","mr_egger_regression",
"mr_weighted_median","mr_raps","mr_maxlik"))

het <- mr_heterogeneity(dat) # Q Cochrana
pleio <- mr_pleiotropy_test(dat) # Przechwycenie Eggera
steiger <- directionality_test(dat) # Kierunkowość Steigera

# Globalne i odstające, skorygowane szacunki MR-PRESSO
mrpresso <- mr_presso(BetaOutcome = "beta.outcome", BetaExposure = "beta.exposure",
SdOutcome = "se.outcome", SdExposure = "se.exposure",
OUTLIERtest = PRAWDA, DISTORTIONtest = PRAWDA,
data = dat, NbDistribution = 1000, SignifThreshold = 0,05) #

# Odwrotny MR: tyrotoksikoza (ekspozycja) -> TL (wynik)
rev_exp <- extract_instruments(wyniki = outcome_id, p1 = 5e-8, zgrupowanie = PRAWDZIWE, r2 = 0,001, kb = 10000)
rev_out <- extract_outcome_data(SNPS = rev_exp$SNP, wyniki = exposure_id)
rev_dat <- harmonise_data(rev_exp, rev_out, akcja = 2)

rev_res <- mr(rev_dat, method_list = c("mr_ivw", "mr_ivw_fe", "mr_egger_regression",

"mr_weighted_median","mr_raps","mr_maxlik"))
rev_het <- mr_heterogeneity(rev_dat)
rev_pleio <- mr_pleiotropy_test(rev_dat)
rev_steiger <- directionality_test(rev_dat)

# Eksporty do archiwizacji i generowania figure/tabel
write.csv(bind_rows(res), "S3_mr_results_primary.csv", row.names = FALSE)
write.csv(het, "S3_mr_heterogeneity.csv", row.names = FALSE)
write.csv(pleio, "S3_mr_pleiotropy_egger.csv",row.names = FAŁSZYWE)
write.csv(steiger, "S3_mr_steiger.csv", row.names = FAŁSZYWE)
write.csv(bind_rows(rev_res), "S3_reverse_mr_results.csv", row.names = FALSE)
write.csv(rev_het, "S3_reverse_heterogeneity.csv", row.names = FAŁSZYWE)
write.csv(rev_pleio, "S3_reverse_pleiotropy_egger.csv", row.names = FAŁSZYWE)
write.csv(rev_steiger, "S3_reverse_steiger.csv", row.names = NIEPRAWDA)

Wyniki

Charakterystyka instrumentów i kontrole założeń
Z GWAS o długości telomerów zachowano 129 instrumentów istotnych o całym genomie, niezależnych od LD (p < 5×^10-8; r² < 0,001; okno 10 000 kb). Statystyki F-na na SNP przekroczyły konwencjonalny próg dla zdecydowanej większości wariantów, co wskazuje na ograniczone ryzyko błędu słabych instrumentów. Harmonizacja usunęła niejednoznaczne warianty palindromowe i wyrównane allele, tak że ekspozycja i efekty efektu odnoszą się do te...

Dyskusja

To badanie randomizacji Mendelowskiej (MR) dostarcza dowodów na to, że dłuższe genetycznie przewidywane telomery zmniejszają ryzyko tyrotoksiozy¹⁹. Kierunkowo zgodne szacunki dla IVW, MR-Egger, maksymalnego prawdopodobieństwa, MR-PRESSO i MR-RAPS wskazują na silne powiązanie ochronne, a kontrole kierunkowości wspierają szlak TL → tyreotoksykozy, a nie odwrotną²⁰. Biologiczna wiarygodność jest zgodna z rolą telomerów w zachowaniu integralności chromosomów i modulacji długośc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Projekt 1000 Genomów	Dane referencyjne dotyczące zlepiania się w związku nierównowagowym (LD).	Projekt 1000 Genomów	-
Cochran' Statystyka s Q	Metoda statystyczna stosowana do testowania heterogeniczności w MR.	Nie ma	-
FinnGen dataset	Podsumowanie statystyk GWAS dla tyrotoksiozy (przypadki i kontrole).	Konsorcjum FinnGen	Wydanie 2021, finn-b-thyROTOXICOSIS
Zbiór danych OpenGWAS IEU	Statystyki GWAS dotyczące długości telomerów.	IEU OpenGWAS	Dataset ID: ieu-b-4879
Pakiet ieugwasr	Pakiet R używany do programowego dostępu do danych GWAS.	CRAN	Wersja 0.1.5
Pakiet pana rapsa	Pakiet R do odpornej estymacji w randomizacji mendelowskiej przy słabych instrumentach.	CRAN	Wersja 0.1.2
Regresja MR-Eggera	Metoda analizy czułości do testowania kierunkowej plejotropii.	Nie ma	-
Test odstających MR-PRESSO	Test statystyczny używany do identyfikacji i korygowania wartości odstających w analizach MR.	Nie ma	-
Pakiet MRPRESSO	Pakiet R używany do wykrywania wartości odstających i testowania zniekształceń w analizie MR.	CRAN	Wersja 1.0
Oprogramowanie R	Środowisko obliczeń statystycznych i graficznych wykorzystywane do wszystkich analiz.	R Foundation for Statistical Computing	Wersja 4.3.1
Pakiet RadialMR	Pakiet R do radialnej wizualizacji wyników MR.	CRAN	Wersja 1.1.2
Pakiet TwoSampleMR	Pakiet R używany do analiz randomizacji Mendelowskiej.	CRAN	Wersja 0.5.7