Method Article

Ulepszone mapowanie przestrzenne warstw mięśni żołądka myszy z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Swiss Roll

DOI:

10.3791/69673

⸱

November 25th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa metodę immunobarwienia całego żołądka, zmodyfikowaną na podstawie techniki "Swiss roll" pierwotnie opracowanej dla jelita myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie przestrzennej "omiki" oferują bezprecedensowe możliwości badania biologii i interakcji poszczególnych komórek aparatu nerwowo-mięśniowego żołądka w ich rodzimym środowisku tkankowym. Jednak skuteczne zastosowanie tych podejść oraz ocena różnic strukturalnych i molekularnych w dnie dna, korpusie i antrum wymagają konsekwentnego pobierania próbek i orientacji tkanek. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowaną technikę "Swiss roll" dostosowaną do żołądka myszy, która pozwala na osadzenie i wizualizację wszystkich głównych obszarów anatomicznych w jednej kriosekcji. Podejście to kładzie nacisk na płaską fiksację i staranne pozycjonowanie, aby generować przekroje o powtarzalnej orientacji i jakości. Badanie to zoptymalizowało również warunki barwienia immunofluorescencji, aby zapewnić wysokiej jakości wizualizację markerów komórkowych. Protokół ten umożliwia kompleksowe, równoległe porównania obszarów żołądka, minimalizując jednocześnie utratę tkanek i zmienność eksperymentalną. Poprzez poprawę zachowania tkanek i orientacji przestrzennej, metoda ta stanowi praktyczne i skalowalne narzędzie dla badaczy biologii żołądka zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żołądek to złożony, w kształcie litery J organ, który łączy przełyk z dwunastnicą1. Dzieli się na trzy główne obszary anatomiczne: dno dna, ciało oraz antrum1. Każdy obszar tunica muscularis żołądka odgrywa odrębną rolę fizjologiczną, przyczyniając się do kluczowych funkcji żołądka, takich jak akomodacja, podleganie, trituracja pokarmowa oraz opróżnianie 1,2. Badanie zmian w fizjologii i patologii żołądka wymaga szczegółowej analizy tych obszarów oraz ich architektury komórkowej.

Aby zobrazować duże obszary tkanek, badacze często stosują technikę "Swiss roll", pierwotnie opracowaną dla jelita myszego 3,4,5,6. Badanie to zmodyfikowało technikę rolowania szwajcarskiego do stosowania z żołądkiem myszy, aby ustanowić nowy protokół. Żołądek najpierw dzieli się na części anatomiczne i ustawia w płaską orientację. Tkanka jest następnie starannie zwijana i przetwarzana do kriosekcji. Nieprawidłowe rolowanie może uszkodzić delikatne struktury nabłonka, szczególnie w jelicie, co prowadzi do niskiej jakości tkanek do immunobarwienia. Zachowanie dobrze utrwalonej, prawidłowo ułożonej tkanki z nienaruszoną strukturą komórkową jest niezbędne do obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Prace te przedstawiają nową metodę generowania rolek Swiss obejmujących wszystkie obszary żołądka w jednym kriobloku. Dodatkowo opisano zoptymalizowany protokół barwienia immunofluorescencyjnego dla tunika muscularis żołądka, umożliwiający szczegółową ocenę funkcji żołądka. Protokół ten stanowi kompleksowy przewodnik po uzyskaniu wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez staranne przygotowanie tkanek żołądkowych, obróbkę rolek szwajcarskich oraz barwienie. Zachowując złożoną morfologię tunicy muscularis żołądka, metoda ta ułatwia głębsze zrozumienie jej struktury i funkcji zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono według wytycznych określonych w Przewodniku Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kliniki Mayo (A48315-15). Programy opieki i korzystania ze zwierząt Mayo Clinic oraz placówki zostały zrecenzowane i w pełni akredytowane przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Szwajcarska technika rolowania do kriosekcji żołądka utrwalonych paraformaldehydem (PFA)

  1. Znieczulenie myszy C57BL/6J (8-10 tygodni) poprzez wdychanie dwutlenkiem węgla (CO₂) przez co najmniej 3 minuty, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić eutanazję (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
  2. Przeciąć przełyk, dwunastnicę oraz brzuszną i grzbietową mezogastrię, aby usunąć żołądek.
  3. Umieść żołądek w naczyniu pokrytym silikonem zawierającym zimną, fosforanową sól fizjologiczną (PBS). Przypnij przełyk, dno dna, ciałko i dwunastnicę, aby służyły jako odniesienia orientacji (Rysunek 1A). Kierunek cięcia jest oznaczony czerwoną przerywaną linią na rysunku 1A.
  4. Ostrożnie usuń przymocowany tłuszcz za pomocą nożyczek do kołków i kleszczy.
  5. Przetnij brzuszną krezkę dwunastnicy i żołądka aż do szpilki w ciele, a następnie delikatnie spłaszcz tkankę (Rysunek 1B).
  6. Użyj pipety transferowej wypełnionej PBS, aby wypłukać resztki jedzenia z lumenu żołądka.
  7. Delikatnie rozciągnij otwarty brzuch, aby uzyskać płaską pozycję (rysunek 1C).
    UWAGA: Unikaj nadmiernego rozciągania (czyli powyżej 110% oryginalnych wymiarów), aby zachować architekturę tkanek.
  8. Zanurz żołądek w zimnym 4% PFA na 2 minuty, aby lekko utrwalić tkankę i ułatwić przewracanie.
  9. Po krótkim stabilizacji ponownie przypiąć tkankę na płasko.
  10. Przytnij brzuch wzdłuż przerywanego konturu, aby uzyskać jednolity kształt odpowiedni do rolowania (rysunek 1C).
  11. Przyciętą tkankę żołądkową umieść na papierze filtrującym nawilżonym przez PBS (rysunek 1D).
  12. Zwiń tkankę w formę Swiss roll i zabezpiecz ją, wkładając wykałaczkę przez środek.
    UWAGA: Upewnij się, że strona śluzowa jest skierowana do góry podczas procesu toczenia. Trzymaj końcówkę dwunastnicy za pomocą kleszczy w jednej ręce, a drugą prowadząc wykałaczkę, po drobnych modyfikacjach opublikowanych metod.
  13. Po zwinięciu należy włożyć igłę 30G, aby ustabilizować jej kształt i wygiąć ją pod kątem 90°, aby ustabilizować zwinięty brzuch (Rysunek 1E).
  14. Utrwal tkankę w 4% PFA w 4 °C przez 6 godzin.
  15. Przenieś ustaloną tkankę do 30% sacharozy w PBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin w celu krioochrony i zapobiegania powstawaniu kryształów lodu.
  16. Delikatnie usuń igłę stabilizującą.
  17. Umieść tkankę w stosie o optimalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) za pomocą jednorazowych form bazowych, a następnie zamrażaj na suchym lodzie (rysunek 1F).
  18. Po całkowitym zamrożeniu przechowuj pleśń w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza w O.C.T., zwłaszcza wokół tkanki, ponieważ utrudniają one sekcjonowanie. Bloki tkanek można przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej rok.
  19. Przed przekrojeniem, wyrównuj blok w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  20. Przecień tkankę o grubości 5 μm za pomocą kriostatu.
    UWAGA: Grubość 5-12 μm jest zazwyczaj odpowiednia dla myszych sekcji żołądka 7,8 i można ją dostosować w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Sekcje można przechowywać w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.

2. Immunofluorescencyjne barwienie tkanki mięśni żołądka

  1. Za pomocą hydrofobowego długopisu barierowego narysuj barierę odstraszalną na każdy fragment tkanki na szkiełku mikroskopu.
  2. Przemyj przekroje zimnym PBS przez 5 minut, aby rozpuścić pozostałości związku O.C.T.
  3. Blokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując przekroje z 1% surowiczą albuminą bydła (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT; 21-23 °C).
  4. Usuń 1% BSA za pomocą ssania, a następnie przemyj przekroje trzy razy zimnym PBS przez 10 minut w temperaturze RT (21-23 °C).
  5. Dodatkowo blokuj niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację tych fragmentów roztworem blokującym IgG mysz na myszy w PBS przez 1 godzinę w RT (21-23 °C), co zmniejsza wiązanie endogennego IgG i poprawia swoistość przy użyciu przeciwciał myszy IgG.
  6. Usuń roztwór blokujący za pomocą ssania, a następnie przemyj fragmenty trzy razy zimnym PBS przez 10 minut każdy w RT (21-23 °C).
  7. Powtarzaj blokowanie BSA przez 1 godzinę w RT (21-23 °C).
  8. Inkubuj przekroje z pierwotnymi przeciwciałami. Anoctamina-1 (ANO1), KIT, beta-tubulina klasy III (TUBB3) rozcieńczona w zimnej formie 1% BSA z 0,3% Triton X-100. W osobnym eksperymencie zastosowano miozynę ciężką 11 (MYH11), E-kadherynę oraz KIT. Inkubować przez noc (12-16 h) w temperaturze 4 °C.
  9. Usuń główny roztwór przeciwciał za pomocą delikatnego ssania. Przemyj te fragmenty zimnym PBS trzy razy po 10 minut w temperaturze RT (21-23 °C).
  10. Inkubuj przekroje przeciwciałami wtórnymi. Alexa Fluor (AF) 488 anty-rabbit IgG, AF555 anty-myszy IgG oraz AF647 anty-kozy IgG (wszystkie przy 5 μg/mL; 1:400) w 1% BSA przez 1 godzinę w RT (21-23 °C).
  11. Usuń wtórny roztwór przeciwciał za pomocą ssania, a następnie przemyj przekroje trzy razy zimnym PBS przez 10 minut każdy w RT (21-23 °C).
  12. Barw przekroje 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI, w rozcieńczeniu 1:300) przez 1 godzinę w RT (21°-23 °C).
    UWAGA: Jądra neuronalne zazwyczaj wykazują słabsze sygnały DAPI niż inne typy komórek przewodu pokarmowego; Zaleca się minimalną inkubację 1 godzinę dla optymalnej wizualizacji.
  13. Przepłukaj fragmenty raz wodą ultraczystą, aby usunąć resztki soli.
  14. Zamontuj zamki za pomocą Antyfade Mountant.
  15. Uszczelnij rogi pokrywy lakierem do paznokci bez fluorescencji. Usuń nadmiar medium mocującego delikatnym ssaniem. Następnie uszczelnij cały obwód pokrywki.

3. Obrazowanie immunofluorescencyjne z użyciem mikroskopu konfokalnego

  1. Konfiguracja wielokanałowego rejestru stosu Z w oprogramowaniu obrazowania konfokalnego, konfigurując lasery i detektory dla DAPI, AF488, AF555 i AF647, zapewniając separację spektralną i unikając nasycenia sygnału.
    UWAGA: Dostosowuj moc lasera i czas ekspozycji indywidualnie dla każdego fluoroforu, aby zapobiec przesłuchom i utrzymać sygnał w zakresie dynamicznym na wszystkich kanałach (Rysunek 2A).
  2. Ustaw parametry ekspozycji w oprogramowaniu obrazowania konfokalnego, aby uniknąć nasycenia pikseli i zachować szczegóły sygnału w obszarach o wysokiej intensywności (Rysunek 2B).
    UWAGA: Upewnij się, że sygnały we wszystkich kanałach mieszczą się w zakresie dynamicznym i nie osiągają nasycenia.
  3. Aby uchwycić cały wałek żołądkowy Szwajcarski, użyj dużego ustawienia akwizycji obrazu (np. 6 × 6 pól) (Rysunek 2C); Jednak to ustawienie należy dostosować w zależności od ogólnego rozmiaru i napięcia tkanki zwiniętej na wałku.
  4. Uzyskaj obrazy 3D za pomocą akwizycji serii Z w oprogramowaniu obrazowania konfokalnego. Szczegółowy proces pozyskiwania N-wymiarowego (ND) został zilustrowany na Rysunku 2D.
  5. Wybierz opcję stosu Z, aby włączyć obrazowanie serii Z.
  6. Zdefiniuj zakres Z, ustawiając górną i dolną pozycję ogniskową, obejmując pełną grubość całego brzucha.
  7. Skup górną część brzucha i kliknij przycisk górny , aby ustawić górny limit Z.
  8. Ustaw ostrość na dole mięśnia żołądka i kliknij przycisk Dolny , aby ustawić dolny limit Z.
  9. Ustaw liczbę kroków stosu Z na 8, aby obejmować pełną głębokość mięśnia żołądka.
  10. Kliknij na Uruchom teraz , aby rozpocząć akwizję obrazu stosem Z.
  11. Generuj projekcje maksymalnej intensywności dla poszczególnych i połączonych kanałów fluorescencyjnych, aby wizualizować dane trójwymiarowe w dwuwymiarowym obrazie.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując nową metodę, mysie przewroty żołądkowe obejmowały wszystkie trzy główne obszary żołądka: dno, ciałko i antrum, wraz z niewielką częścią przełyku i dwunastnicy w jednym przekroju. Włączenie całego żołądka do jednej sekcji pozwala na kompleksową analizę regionalną (Rysunek 1). Barwienie za pomocą hematoksyliny i eozyny (H&E) całych obrazów żołądkowych wałków szwajcarskich wykazało dobrze zachowaną architekturę żołądka we wszystkich regionach, umożliwiając wyraźną wizualizację warstw śluzowych, podśluzkowych i mięśniowych (Rysunek 3). Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne komórek śródmiąższowych Cajal (ICC; komórki rozrusznika serca generujące rytmiczne fale powolne leżące u podstaw fazowej ruchliwości jelit; zidentyfikowane przez KIT i ANO1), neuronów jelitowych (neuronów układu nerwowego jelitowego koordynujących ruchliwość przewodu pokarmowego; zidentyfikowanych przez immunobarwienie TUBB3) oraz jąder (DAPI). W błonie śluzowej żołądka KIT jest również wyrażany w komórkach Panetha i pucharu, jak wcześniej zgłaszano 9,10,11. ANO1 jest również silnie eksprimowany w nabłonku żołądka, szczególnie w komórkach nabłonka kłyszczowatego dna dna, co odpowiada jego roli w transporcie chlorkówi wydzielaniu śluzów. Ponadto TUBB3 jest eksprymowany w niektórych komórkach endokrynnych żołądka oraz komórkach wydzielających śluz, według danych z Human Protein Atlas12,13. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne komórek mięśni gładkich oznaczanych przez MYH11, komórek nabłonka błonkowego żołądka znakowanych przez E-kadherynę oraz ICC znakowanych przez KIT. MYH11 jest również wyrażany w miofibroblastach błony śluzowej żołądka, jak wcześniej zgłaszano,14. Razem te wyniki immunofluorescencji potwierdzają, że nasz protokół zachowuje architekturę tkanek.

Rysunek 1
Rysunek 1: Przygotowanie "szwajcarskiego rolka" żołądka myszy do kriosekcji. (A) Cały żołądek jest umieszczany w czarnej, silikonowej misce do rozwarstwienia, wypełnionej zimną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) zaraz po usunięciu, aby zachować integralność tkanek. (B) Żołądek jest otwarty wzdłuż środka dwunastnicy. (C) Żołądek jest delikatnie rozciągany i przypinany w naczyniu, aby leżał płasko bez nadmiernego napięcia. Na tkance jest wyznaczona czerwona krewka, aby wskazać, gdzie należy ją przyciąć, aby ułatwić wałkowanie. (D) Otwarty i zamocowany żołądek umieszcza się na papierze filtrującym nawilżonym przez PBS, przygotowując go do zwinięcia w kompaktową konfigurację. Czerwona strzałka pokazuje kierunek przewracania się żołądka. (E) Fragmenty tkanek są osadzane w związanym materiale o temperaturze optymalnej temperatury cięcia (O.C.T.) i zamrażane na suchym lodzie w przygotowaniu do kriosekcji. (F) Bloki zamrożone są przechowywane w temperaturze −80 °C i kriosekcjonowane przy grubości 5 μm do dalszej analizy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Konfiguracja akwizycji ND i wizualizacja nasycenia podczas obrazowania stosu Z. (A) Ustawienia lasera i detektora skonfigurowane w oprogramowaniu obrazowania konfokalnego do wielokanałowego obrazowania widmowego. Stosuje się cztery fluorofory: 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) oraz Alexa Fluor 647 (AF647), każdy w parze z odpowiadającymi laserami wzbudzonymi i detektorami emisyjnymi. Wykres spektralny wyświetla krzywe wzbudzenia i emisji, umożliwiając regulację w celu minimalizacji przesłuchów i optymalizacji wykrywania sygnałów. (B) Ustawienia ekspozycji są dostosowywane indywidualnie dla każdego fluoroforu, aby uniknąć nasycenia pikselami i zachować szczegóły w obszarach o wysokiej intensywności. (C) Duże ustawienie akwizycji obrazu (np. 6 × 6 pól) umożliwia wizualizację całego wałka żołądkowego Szwajcarskiego; Rozmiar pola obrazu należy dostosować do rozmiaru i zwartej tkanki rolowanej. (D) Okno akwizycji ND pokazujące ustawienia parametrów stosu Z. Zakres Z definiuje się poprzez wybór górnej i dolnej pozycji mięśnia żołądka, z ośmioma krokami skonfigurowanymi do uchwycenia pełnej głębokości tkanki do analizy trójwymiarowej (3D). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Obraz żołądka myszy z barwami hematoksyliny i eozyny, w żołądku szwajcarskim. Skanowanie kafelków pokazuje zdolność wizualizacji całej żołądkowej rolki szwajcarskiej u 8-tygodniowej samicy myszy C57BL/6J. Wskazane są główne obszary anatomiczne, w tym przełyk (czerwona linia przerywana), dolny zwieracz przełyku (fioletowa linia przerywana), dno dna (linia przerywana), korpusus (niebieska linia przerywana), antrum (zielona linia przerywana) oraz dwunastnica (pomarańczowa linia przerywana). Skala: 1000 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 4
Rysunek 4: Zdjęcia konfokalne szwajcarskiego zwinięcia żołądka całego myszy: ANO1, KIT, TUBB3. Górne panele: Reprezentatywne, zszyte zdjęcia konfokalne żołądkowego wałka szwajcarskiego od 8-tygodniowej samicy myszy C57BL/6J, pokazujące immunodawizację ANO1 (zielony), KIT (cyjan), TUBB3 (żółty) oraz jąder (niebieski). Wizualizowany jest cały skręcony żołądek, włącznie z dnem dna, ciałkiem i antrum. Paski skalowe: 1000 μm. Dolne panele: Powiększone widoki obszaru wyznaczonego przez białe, przerywane ramki w górnych panelach, podkreślające szczegóły komórkowe komórek śródmiąższowych Cajal (ANO1+ i KIT+; żółte strzałki) oraz neuronów jelitowych (TUBB3⁺; czerwone strzałki). Skala: 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 5
Rysunek 5: Zdjęcia konfokalne szwajcarskiego zwinu całego żołądka myszy: MYH11, KIT, E-kadherina. Górne panele: Reprezentatywne, zszyte zdjęcia konfokalne żołądkowego rolka szwajcarskiego od 8-tygodniowej samicy myszy C57BL/6J, pokazujące immunobarwienie dla MYH11 (zielony), KIT (cyjan), E-kadheryna (żółty) oraz jąder (niebieski). Wizualizowany jest cały skręcony żołądek, włącznie z dnem dna, ciałkiem i antrum. Paski skali: 1000 μm. Dolne panele: Powiększone widoki regionu wyznaczonego przez białe, przerywane ramki w górnych panelach. Białe, przerywane linie wyznaczają nabłonek śluzowy (E-kadheryna) oraz warstwę mięśniową (MYH11). Białe strzałki wskazują komórki śródmiąższowe KIT+ Cajala (ICC). Skala: 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując nowo zoptymalizowaną metodę Swiss-roll żołądka, wszystkie trzy segmenty żołądka (dno, ciałko i antrum), wraz z przełykiem i dwunastnicą, są uwzględnione na jednym szkiełku. To kompleksowe osadzenie pozwala badaczom analizować zmiany strukturalne i molekularne w całym żołądku oraz obniża koszty sekcjonowania i barwienia odczynników (Rysunek 1).

Jednoczesne wystawianie wszystkich obszarów żołądka tym samym roztworom barwienia podczas immunodbarwienia zapewnia spójność i poprawia dokładność. Immunobarwienie w żołądkowych rolkach wyraźnie ujawnia wyraźne warstwy ściany żołądka. Jak pokazano na Rysunku 4 i 5, metoda ta umożliwia wizualizację różnic morfologicznych między segmentami żołądka oraz umożliwia wykrywanie ICC (KIT i ANO1)10, neuronów (TUBB3)15, komórek mięśni gładkich (MYH11), komórek nabłonka śluzowego (E-kadheryna) oraz jąder.

Drobne modyfikacje mogą być wprowadzane w zależności od stanu tkanek i celów badawczych. Na przykład usunięcie nadmiaru przylegającego tłuszczu może pomóc utrzymać kształt wałka podczas stabilizacji. Regulacja grubości przekroju może również pomóc zachować strukturę tkanki lub poprawić przyczepność do szkiełka. Kolejną potencjalną udoskonaleniem jest użycie metalowej formy do bardziej spójnego cięcia, jak to ma miejsce w przypadku bułek Szwajcarskich16 jelitowych. Chociaż protokół ten koncentruje się na kriosekcjach, może być dostosowany do tkanek osadzonych w parafinie. Podczas gdy osadzanie parafiny zachowuje integralność strukturalną tkanek, kriosekcja umożliwia szybsze przetwarzanie i lepszą ochronę antygenów, co czyni ją bardziej odpowiednią do immunofluorescencji.

Ta metoda ma swoje ograniczenia. Powiększony, włóknisty lub zwapniały żołądek, często występujący w stanach takich jak stan zapalny, otyłość, cukrzyca czy starzenie się, może być trudniejszy do rolowania i stanowić wyzwanie dla optymalnego barwienia 17,18,19,20. Pomimo tego ograniczenia, technika ta oferuje znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnym osadzeniem specyficznym dla regionu. Przetwarzanie wszystkich obszarów żołądka w identycznych warunkach poprawia spójność, zmniejsza zmienność oraz oszczędza zarówno czas, jak i odczynniki.

To podejście jest szczególnie przydatne w badaniach zmian specyficznych dla regionu. Obsługuje również analizę przestrzenną wielu typów komórek i może być łączona z ilościową metodą obrazową. Ogólnie rzecz biorąc, ta nowo zoptymalizowana metoda przewrotów żołądkowych Swiss-roll stanowi praktyczną i skalowalną platformę do kompleksowej analizy tkanek żołądkowych w zdrowiu i chorobach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były częściowo wspierane grantami National Institutes of Health R01 DK057061 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.) oraz P30 DK084567 (Epigenomics and Spatial Biology Core, Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology). Agencje finansujące nie miały żadnej roli w projektowaniu badań, analizie danych ani przygotowywaniu manuskryptów. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów. Dziękujemy dr Darrenowi J. Bakerowi oraz członkom Laboratorium dr. Bakera (Wydział Biochemii i Biologii Molekularnej, Mayo Clinic, Rochester, MN) za udostępnienie zasobów laboratoryjnych i wsparcia technicznego w zakresie barwienia H&E.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#5SF KleszczeNARZĘDZIA DO NAUKI WYSOKIEJ JAKOŚCI11252-00
Albumina w surowicy bydlęcej  SIGMA-ALDRICHA7906
Źródło LED ColdVision MC-LSSCHOTTMC-LS
Oprogramowanie konfokalne NikonOprogramowanie do obrazowania Nikon NIS-Elements
Cryoseal XYLEpredida9312-4
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol, dylaktan)Thermo Fisher ScientificD3571
Duże naczynia do sekcjiSystemy żywe  InstrumentacjaSKU: DD-90
Przeciwkozłowy AF647 pAb przeciwkozłowyTechnologie życiaA21447Lot: 1739289 RRID:AB_2535864
Donkey anty-mouse AF555 pAbTechnologie życiaA31570Lot: 1774719 RRID:AB_2536180
Osioł przeciwkróliczy AF488 pAbTechnologie życiaA21206Lot: 2668665 RRID:AB_2535792
E-kadharyna (rozcieńczenie 1:400)BD Bioscience610181lot: 25510 RRID:AB_397580
EosinELITechGroup$SS-071C
Kleszcze powlekane epoksydemNARZĘDZIA DO NAUKI WYSOKIEJ JAKOŚCI11210-10
EtanolSIGMA-ALDRICH459828-4L
FLEX TUBE 1,5 mLEppendorf22364111
Gąbki gazoweFisherscientific22-362-178
Utwardzone nożyczki cienkieNARZĘDZIA DO NAUKI WYSOKIEJ JAKOŚCI14090-09
HematoksylynaEpredia7211
KIT (0.2 & micro; g/mL; 1:1000 rozcieńczenia)R& D SystemsAF1356Lot: IEO0217101 RRID: AB_354750
ROZTWÓR DO CZYSZCZENIA SOCZEWEK 1OZ BUTELKA ZE SPRYSKIWACZEMNikon77013066
Szkło osłonowe mikroskopuFisher Scientific12541016
Szkiełka mikroskopoweCardinalHealthM6133A
Drobne szpilkiNARZĘDZIA DO NAUKI WYSOKIEJ JAKOŚCI26002-20
MYH11 (rozcieńczenie 1:400)Technologie biomedyczneBT-562RRID:AB_10013421
Lakier do paznokciGRZESZNE KOLORY7.33855E+11
Igła 30 G x 1/2 cala.BD Bioscience305106
ParaformaldehydSIGMA-ALDRICH158127-500G
Jednokratyczne ostrza PersonnaFirma Razor Blade Co.76247-652
Rozwiązanie blokujące IgG mysz na myszy ReadyProbes (30x)Thermo Fisher ScientificR37621Lot: 3226230
SlowFade Diamond Antifade Mountant (nośnik montażowy)Thermo Fisher ScientificS36972
System barwienia szkiełek StainTray 10Simport ScientificM918-2
Mikroskop stereo 0,8x-5xNikonSMZ645
Sucrose SIGMA-ALDRICHS9378-1KG
Wzmacniacze powierzchniowe X-100 (Triton X)Thermo Fisher Scientific28314
TMEM16A (ANO1: rozcieńczenie 1:400)Abcamab53212 Lot: GP3295656-1 RRID: AB_883075
Transfer PipetFalcon357575
TUBB3 (rozcieńczenie 1:400)Technologia sygnalizacji komórkowej4466Lot: 5 RRID: AB_1904176
Xyleny Fisher ScientificX3P-1GALDUŻO 206238

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Swiss Roll TechniqueGastric Muscle LayersSpatial OmicsImmunofluorescence StainingMouse StomachTissue OrientationCryosection EmbeddingGastric RegionsInterstitial CellsSmooth Muscle Cells

Related Articles