Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Podsumowanie

Protokół ten opisuje test hemostazy Nijmegen, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazminy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Celem testu jest poprawa charakterystyki równowagi hemostatycznej w badaniach i środowiskach klinicznych wykraczających poza zakresu konwencjonalnych testów hemostatycznych.

Streszczenie

Trombina i plazmina odgrywają centralną rolę w hemostazie, regulując odpowiednio krzepnięcie i fibrynolię. Konwencjonalne testy hemostatyczne często koncentrują się na izolowanych składnikach lub ograniczonych fazach hemostazy; Na przykład aktywowany czas częściowy tromboplastyny i czas protrombinowy oceniają jedynie inicjację powstawania fibryny, podczas gdy testy aktywności czynnikowej oceniają funkcję poszczególnych czynników krzepnięcia. Chociaż są one cenne, nie zawierają kompleksowego obrazu całego procesu wtórnej hemostazy i fibrynozy, która dynamicznie rozwija się w czasie. Test hemostazy w Nijmegen (NHA) rozwiązuje to ograniczenie, umożliwiając jednoczesne, czasowo rozdzielone pomiary generacji trombiny i plazminy w pojedynczej mikropłytce. Stosując dwa syntetyczne podłoża fluorogenne o odmiennych widmach wzbudzenia i emisji oraz bez reaktywności krzyżowej, test pozwala na dokładne ilościowe określenie obu enzymów równolegle. Hemostaza inicjuje się w osoczu ubogim w płytki krwi przy użyciu czynnika tkankowego, wapnia i aktywatora plazminogenu tkankowego, a fluorescencja jest rejestrowana co 30 sekund przez 70 minut w temperaturze 37 °C. Krzywe aktywności enzymów są generowane na podstawie standardów kalibracyjnych, z których wyprowadzane są parametry takie jak czas opóźnienia, potencjał trombinowy, czas lizy fibryny oraz wysokość szczytu plazminy. Test niezawodnie rejestruje jednoczesną produkcję trombiny i plazminy z dobrą precyzją wewnątrz- i między testami, oraz wykrywa modulację krzepnięcia i fibrynolizy przez efektory takie jak heparyna, aktywowane białko C oraz kwas epsilon-aminokapronowy. W próbkach klinicznych zaobserwowano istotnie zmniejszoną produkcję trombiny u pacjentów z niedoborami czynników krzepnięcia, podczas gdy pacjenci z chorobami fibrynolitycznymi wykazywali podwyższone profile generowania plazmy. Łącząc pomiary generacji trombiny i plazminy, NHA zapewnia kompleksowy wgląd w równowagę hemostatyczną wykraczającą poza konwencjonalne testy. To zintegrowane podejście daje nadzieję na badania i zastosowania kliniczne, takie jak charakteryzacja fenotypów hemostatycznych, ocena ryzyka krwawienia i zakrzepów oraz monitorowanie ukierunkowanych interwencji terapeutycznych. Protokół ten określa procedurę NHA, której celem jest pogłębienie zrozumienia i oceny równowagi hemostatycznej.

Wprowadzenie

Hemostaza jest wynikiem dynamicznej równowagi między krzepnięciem a fibrynozą. Trombina i plazmina są kluczowymi enzymami napędzającymi te procesy: trombina przekształca fibrynogen w fibrynę, natomiast plazmina rozkłada fibrynę, rozpuszczając zakrzepy. Zaburzenie tej równowagi może prowadzić do krwawienia lub epizodów zakrzepowych ^1,2. Jednak testy laboratoryjne stosowane do oceny hemostazy w praktyce klinicznej zazwyczaj koncentrują się na pojedynczych etapach krzepnięcia lub fibrynozy, dostarczając ograniczonego wglądu w ogólną równowagę hemostatyczną. U pacjentów z podejrzeniem skłonności do krwawienia rutynowe testy przesiewowe, takie jak czas protrombinowy (PT) oraz aktywowany czas częściowy tromboplastyny (aPTT), są powszechnie stosowane do wykrywania niedoborów czynników krzepnięcia. Jednak te testy mierzą czas do początkowego powstania fibryny i nie rejestrują powstawania trombiny po rozpoczęciu krzepnięcia, gdzie występuje najbardziej fizjologicznie istotna aktywność trombina ^1,2,3. W konsekwencji mogą one dawać prawidłowe wyniki u pacjentów z łagodnymi niedoborami czynników krzepnięcia 3,4,5,6,7,8. Aby zidentyfikować te konkretne niedobory, stosuje się testy aktywności koagulacyjnej. Chociaż są one pouczające do diagnozy, te testy oceniają poszczególne białka w izolacji i nie odzwierciedlają ogólnej równowagi hemostatycznej. W związku z tym u pacjentów z łagodnymi niedoborami poziomy czynników często słabo korelują z fenotypem krwawienia ^9,10. To komplikuje kliniczną ocenę ryzyka i optymalizację leczenia pacjenta, w tym termin i dawkowanie terapii, a także interwencje w odpowiedzi na zakrzepowe lub ciężkie zdarzenia krwotoczne. Te ograniczenia podkreślają potrzebę testów, które oferują pełniejszy obraz procesu hemostatycznego w czasie i mogą pomóc zniwelować różnicę między wynikami laboratoryjnymi a obrazem klinicznym.

Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) został opracowany, aby zniwelować te ograniczenia poprzez umożliwienie jednoczesnego, czasowo rozdzielonego pomiaru generacji trombiny i plazminy w osoczu ubogim w płytki^{krwi 8,9}. Wykorzystuje dwa syntetyczne podłoża fluorogeniczne o różnych widmach wzbudzenia i emisji do ilościowego określenia obu enzymów w tej samej mikropłytowej jamie bez reaktywności krzyżowej. Krzywe generowania enzymów pozwalają wyprowadzić ilościowe parametry odzwierciedlające dynamikę wtórnej koagulacji i fibrynolizy, w tym czas opóźnienia, wysokość szczytu trombiny, czas lizy fibryny oraz wysokość szczytu plazminy. NHA oferuje kilka przewag w porównaniu z istniejącymi testami generowania trombin, takimi jak Kalibrowany Zautomatyzowany Trombogram (CAT), Ceveron s100 oraz ST Genesia, które dostarczają cennych informacji o dynamice trombin, ale nie oceniają aktywności fibrinolitycznej 10,11,12,13. Testy lizy zakrzepów z kolei wychwytują aspekty fibrynozy, ale nie mają informacji o¹⁴. generacji trombiny. Ogranicza to ich przydatność do oceny złożonych interakcji decydujących o ogólnej równowadze hemostatycznej. Podczas gdy niektóre podejścia opracowane laboratoryjnie łączą pomiary generacji trombiny i plazmy, zazwyczaj wymagają one oddzielnych dołków lub testów równoległych, co ogranicza wyrównanie czasowe i przepustowość¹⁵. Globalne testy, takie jak tromboelastografia (TEG) i rotacyjna tromboelastometria (ROTEM), dostarczają uzupełniających informacji, rejestrując pierwotną hemostazę, wtórną krzepliwość oraz fibrynolizę^16,17. Systemy komór przepływowych stanowią kolejne nowe, a zarazem eksperymentalne podejście do oceny całkowitej hemostazy w warunkach przepływu¹⁸. Chociaż te globalne testy oferują szerszy kontekst fizjologiczny, są one zazwyczaj mniej wrażliwe na łagodne zaburzenia krwawienia 19,20,21. Poprzez jednoczesne pomiary generacji trombiny i plazminy w tej samej reakcyjnej wiertnie, NHA łączy czułość konwencjonalnych TGA z zintegrowanym spojrzeniem na globalne testy, umożliwiając bezpośrednią ocenę wtórnej hemostazy, fibrynolizy i ich interakcji.

Testy generowania trombiny już wykazały znaczne obiecujące zastosowania translacyjne, takie jak indywidualne profilowanie ryzyka krwawienia i zakrzepowego oraz monitorowanie terapii 22,23,24,25. W badaniach klinicznych NHA wykazało zmniejszoną produkcję trombiny u pacjentów z hemofilią A, hemofilią B oraz rzadkimi niedoborami czynników krzepnięcia, a także podwyższoną produkcję plazmy w stanach hiperfibrynolitycznych, takich jak niedobór α2-antyplazminy 26,27,28,29 . Różnice w obu szlakach zaobserwowano również u pacjentów z hipofibrynogenemią, zaburzeniem związanym zarówno z krwawieniem, jak i zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. W tej populacji niższe poziomy fibrynogenu korelowały ze zmniejszoną generacją plazmyny, prawdopodobnie z powodu braku miejsc wiążących plazminogen, podczas gdy pacjenci z wywiadem zakrzepicy wykazywali wzrost³⁰. generacji trombiny. Dodatkowo test wykrywa działanie środków terapeutycznych, w tym antykoagulantów, prokoagulantów i antyfibrynolityków⁸. W poprzednim badaniu zaproponowaliśmy podejście standaryzacyjne i normalizacyjne, aby poprawić powtarzalność i umożliwić porównanie wyników między biegami i laboratoriami, co jest kluczowym krokiem w kierunku wdrożenia klinicznego²⁸. Protokół ten określa pełną procedurę i podejście analityczne NHA do wdrożenia w badaniach klinicznych lub środowiskach translacyjnych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem próbek osocza z ludzi były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez komisję etyki medycznej Arnhem-Nijmegen. Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich dawców.

1. Przygotowanie buforów, odczynników i próbek plazmy

1. Przygotuj roztwory buforowe
   1. Waż 1,2 g Tris (p.a.) i rozpuszczaj w 180 mL 0,9% NaCl.
   2. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl.
   3. Zwiększ końcową objętość do 200 mL z 0,9% NaCl, aby uzyskać 50 mM bufora Tris-150 mM NaCl (TBS).
   4. Zrób TBS w dwóch probówkach po 50 mL.
   5. Wykorzystaj pozostałe 100 ml TBS do przygotowania buforu zawierającego wapń. Rozpuścić 7,34 g CaCl_{2,2H 2}O w 100 mL TBS, aby uzyskać bufor Tris-NaCl-CaCl₂ (TBS-Ca, pH 7,4).
   6. Zrób TBS-Ca w dwóch probówkach po 50 mL.
   7. Przechowuj oba środki w temperaturze 4 °C i użyj w ciągu tygodnia.
2. Przygotuj podłoża fluorogenne
   1. Rozpuszcz 53,2 mg substratu trombinowego (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) w 4 mL buforu Tris-NaCl.
      UWAGA: Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 μL dodanego ludzkiego trombinu w odczynniku 120 μL dawało końcowe stężenie 76 nmol/L.
   2. Zawieraj 100 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.
   3. Rozmroź aliquot fluorogenicznego substratu specyficznego dla trombiny przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wiruj i trzymaj się na lodzie podczas eksperymentu.
   4. Rozpuścić zawartość jednej fiolki substratu plazminy (CBZ-L-Phe-Arg-rodamina) w 1 955 μL DMSO.
      UWAGA: Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 μL dodanej plazminy ludzkiej w odczynniku 120 μL dawało końcowe stężenie 200 nmol/L.
   5. Zawieraj 60 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.
   6. Rozmroz aliquot plazmin-specyficznego podłoża fluorogenicznego przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wiruj i utrzymuj w temperaturze pokojowej podczas eksperymentu.
      UWAGA: Podłoże to rozpuszcza się w dimetylosulfoklenku (DMSO) i nie może być chłodzone, aby uniknąć wytrącenia.
3. Przygotuj odczynniki wyzwalające
   1. Zrekonstytuować liofilizowaną cefalinę, dodając 1 mL wody destylowanej. Wiruj dokładnie, aż całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Cefalina jest rekonstytuowana w celu dostarczenia fosfolipidów, które są niezbędne do katalizowania wielu reakcji krzepnięcia, umożliwiając fizjologicznie istotne krzepnięcie w teście.
   2. Zachowaj 60 μL w rurkach Eppendorfa (wystarczające na 20 otworów) i przechowywać w temperaturze −20 °C.
   3. Rozmroź aliquot przed użyciem i trzymaj na lodzie. Krótko zawiruj przed pipetowaniem.
   4. Rekonfunduj zawartość jednej fiolki z rekombinowanym czynnikiem tkankowym (TF) w 4 mL wody destylowanej.
   5. Zawieraj 60 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.
   6. Rozmroz aliquot TF i wir na krótko.
   7. Przygotuj rozcieńczenie TF w czasie 1:500 przez sekwencyjne rozcieńczenie:
      1. Dodaj 6 μL TF do 54 μL bufora TBS. Vortex.
      2. Weź 6 μL tego rozcieńczenia i dodaj do 54 μL TBS. Wir.
      3. Weź 20 μL tego drugiego rozcieńczenia i dodaj do 80 μL TBS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,28 pM. Vortex.
   8. Rekonstytuuj zawartość jednej fiolki (20 mg) aktywatora plazminogenu tkankowego (tPA) w 20 mL wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 580 000 IU/mL (weryfikuj stężenie specyficzne dla partii).
   9. Zachowaj 50 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.
   10. Rozmroz aliquot tPA i na krótko zawij wir.
   11. Przygotuj rozcieńczenie tPA w stosunku 1:50 przez dodanie 20 μL tPA do 980 μL buforu Tris-NaCl, osiągając końcowe stężenie 11 600 IU/mL. Vortex.
4. Przygotuj próbki plazmy
   1. Pobierz krew żylną do rurek o pojemności cytrynianu 3 mL zawierających cytrynian 3,2%, zapewniając pobranie co najmniej 2,7 mL (90% wypełnienia).
   2. Nie używaj pierwszej rurki po nakłuciu żył; Usuń ją, aby uniknąć aktywacji przez czynnik tkankowy.
   3. Odwróć rurkę co najmniej 10 razy zaraz po pobraniu.
   4. Wirówka w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej, najpierw 2 500 × g przez 5 minut, następnie 10 000 × g przez 10 minut.
   5. Użyj jednorazowej pipety, aby zebrać plazmę tuż powyżej warstwy komórki.
   6. Aliquot plazmę przekształca w oznakowane krioviale, zamraża na bieżąco w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze −80 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że próbka nie zawiera zakrzepów. Używaj tylko świeżej lub raz rozmrożonej plazmy. Jedna rurka CTAD wystarcza do analizy duplikatów.

2. Przygotowanie instrumentów i konfiguracja oprogramowania

1. Przygotuj czytnik płyty fluorescencyjnej
   1. Włącz czytnik tablic i pozwól mu wyrównać temperaturę do 37 °C.
   2. Ustaw następujące podstawowe parametry:
      1. Greiner 96-well, płaskie dno,.
      2. Ustawienia ogólne: Opóźnienie pozycjonowania: 0,1 s; Liczba okien kinetycznych: 1.
      3. Okno kinetyczne: Liczba cykli: 140; Czas rozpoczęcia pomiaru: 0,0 s; Liczba błysków na studnię na cykl: 10; Czas cyklu: 30 s.
      4. Optyka: Górna optyka
      5. Ustawienia filtra: Liczba monochromatyków: 2. Filtr wzbudzenia: 355 nm dla trombiny; 485 nm dla plazminy. Filtr emisyjny: 460 nm dla trombiny, 520 nm dla plazminy. Zysk: 600.
   3. Zdefiniuj układ z maksymalnie 20 otworami na płytę.
   4. Przejdź do Stężenia/Objętości/Wstrząsanie i potwierdź następujące ustawienia. Pompa 1 = 20 μL; Pompa 2 = 0 μL; Prędkość = 420 μL/s.
2. Przygotuj system wtryskowy
   1. Wyjmij i przepłucz igły do wstrzykiwania w pojemniku z buforem.
   2. Ustaw objętość płukania na 2 500 μL i płucz pompy buforem Tris/NaCl o temperaturze 37 °C.
   3. Zresetuj objętość płukania do 500 μL.

3. Ustawienie testu w formacie mikropłyty

1. Układ mikropłyt wstrząsaczowych
   1. Ustaw mikropłytę na 37 °C i sprawdź temperaturę przed użyciem.
   2. Ustaw intensywność drgań na 1100 obr./min.
   3. Używaj tego shakera do wszystkich etapów mieszania testu, aby zapewnić jednorodny rozkład odczynników i stałą aktywność enzymatyczną.
2. Dodaj odczynniki do studni
   1. Rozmrażaj osocze pacjenta i prawidłowe osoczenie zgromadzone (NPP) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez maksymalnie 10 minut.
   2. Dokładnie wymieszaj i sprawdź całkowite rozmrażenie (bez krioprecypitacji).
   3. Dodaj 80 μL osocza pacjenta lub NPP do wybranych studni. Do każdej próbki używaj świeżej końcówki pipety.
      UWAGA: Uwzględnij próbkę NPP w każdym przebiegu testowym, aby uwzględnić zmienność między przebiegami (patrz dalej w kroku 5.6).
   4. Dodaj 2 μL cefaliny.
   5. Dodaj 2 μL czynnika tkankowego (rozcieńczenie 1:500). Krótko wymieszaj za pomocą shakera do talerzy.
   6. Dodaj 10 μL bufora Tris-NaCl. Krótko wymieszaj za pomocą shakera do talerzy.
   7. Dodaj 4 μL substratu trombinowego.
   8. Dodaj 2 μL substratu plazmowego. Krótko wymieszaj za pomocą shakera do talerzy.
3. Przedinkubacja
   1. Włóż mikropłytkę do czytnika płyt.
   2. Pozwól płytce wyrównać się w temperaturze 37 °C przez kilka minut.

4. Przygotowanie i wstrzyknięcie odczynnika startowego

1. Przygotuj odczynnik do pompy 1
   1. Połącz 672 μL bufora Tris/NaCl, 192 μL bufora Tris/NaCl/CaCl₂ oraz 96 μL tPA (od kroku 1.2.5). Dokładnie przeszukaj wir.
   2. Przebij dwa otwory w koreku rurki odczynnikowej.
   3. Włóż rurkę pompy przez jeden otwór na dno rury.
2. Podstaw i rozpocznij badanie
   1. Użyj oprogramowania, aby zapełnić pompę 500 μL odczynnikiem.
   2. Ponownie włóż igły do wstrzykiwania na wyznaczone miejsca.
   3. Natychmiast rozpocznij pomiar fluorescencji.
3. Ręczne rozpoczęcie testu
   UWAGA: Ta ręczna procedura inicjacji stanowi alternatywę dla zautomatyzowanego workflow iniekcji opisanego w krokach 2.2, 4.1 i 4.2.
   1. Przygotuj odczynnik startowy zgodnie z informacją o 4.1.1 tuż przed użyciem.
   2. Usuń mikropłytkę z czytnika płyt i szybko dodaj 20 μL odczynnika startowego ręcznie do każdego dołka, używając skalibrowanej lub wielokanałowej pipety dla szybszego obsługi.
   3. Natychmiast zwróć płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar fluorescencji bez zwłoki.
      UWAGA: Zminimalizuj czas między dodaniem odczynnika a rozpoczęciem pomiaru (<10 s na rząd), aby zmniejszyć zmienność.
4. Odczyt kinetyczny
   1. Rejestruj fluorescencję co 30 sekund przez 70 minut.
   2. Utrzymuj płytkę w temperaturze 37 °C podczas pomiaru.

5. Analiza danych

1. Przygotuj dane do analizy
   1. Eksportuj dane fluorescencji kinetycznej z czytnika płyt jako tabelę z punktami czasu i wartościami fluorescencji na studnię.
   2. Przekształc surowe dane fluorescencyjne na krzywe generujące enzymy, obliczając pierwszą pochodną za pomocą Excela lub innego programu.
   3. Narysuj krzywe generowania enzymów dla każdego dołka, aby zobrazować reakcję enzymatyczną.
      UWAGA: Te krzywe reprezentują tempo generowania trombiny lub plazminy w czasie i odpowiadają graficznym wynikom przedstawionym na rysunkach.
2. Analizuj krzywe generowania trombin
   1. Zidentyfikuj następujące parametry z krzywej generowania trombin (patrz Rysunek 1):
      1. Czas opóźnienia: Punkt czasowy, w którym krzywa generacji trombiny rośnie równomiernie i osiąga 8% szczytowej wysokości trombiny.
      2. Szczytowa wysokość trombiny: Maksymalna wartość sygnału na osi y (czyli maksymalna szybkość generowania trombiny).
      3. Czas szczytu trombiny: Czas od rozpoczęcia testu do szczytu trombiny.
      4. Potencjał trombinowy (powierzchnia pod krzywą generowania trombiny): Obszar pod krzywą od czasu opóźnienia do powrotu sygnału trombinowego do poziomu wyjściowego.
         UWAGA: Potencjał trombinowy odzwierciedla całkowitą zdolność próbki generującej trombinę w warunkach testowych.
3. Analizuj krzywe generowania plazminy
   1. Zidentyfikuj następujące parametry z krzywej generowania plazminy (patrz Rysunek 2):
      1. Czas lizy fibryny: Czas od rozpoczęcia generacji plazminy (czyli punktu, w którym krzywa generowania plazminy rośnie równomiernie i osiąga 8% wysokości szczytu plazminy) do momentu, w którym osiąga się szczyt plazminy.
      2. Wysokość szczytu plazminy: Pierwszy wyraźny maksimum na krzywej, odpowiadający początkowemu wybuchu generacji plazmy, jest wyznaczane w momencie, gdy druga pochodna krzywej generacji plazminy (oparta na trzyminutowej średniej kroczącej) osiąga zero po rozpoczęciu generacji plazminy.
      3. Potencjał plazminy (powierzchnia pod krzywą generowania plazminy): Obszar pod krzywą od początku generacji plazminy do momentu szczytu plazminy.
         UWAGA: Fluktuacje sygnału występują po początkowym szczycie plazminy i nie są uwzględniane w analizie parametrów generowania plazmy.
4. Ekstrakcja parametrów ręcznie lub za pomocą niestandardowego oprogramowania
   1. Użyj Microsoft Excela, GraphPad Prism lub niestandardowego skryptu (np. w Pythonie lub R) do wyodrębniania parametrów kinetycznych.
   2. Zachowaj surowe dane, wykresy krzywe i obliczone parametry w uporządkowanym formacie do archiwizacji i przyszłego wykorzystania.
      UWAGA: Jeśli używasz makr, sprawdź poprawność wszystkich parametrów wizualnie i ręcznie, zanim będziesz polegać na automatycznym wyjściu. Nasze makro do konwersji danych jest dostępne na żądanie.
5. Standaryzacja i normalizacja
   1. Ustalić odniesienie fizjologiczne, mierząc 40 indywidualnych próbek od zdrowych dawców równolegle z próbką NPP używaną do normalizacji. Wykonaj ten krok raz na każdą partię elektrowni jądrowej.
   2. Oblicz średnie wartości parametrów generowania trombiny i plazminy zdrowych dawców oraz określ ich stosunek do odpowiadających wartości NPP uzyskanych w tym samym przebiegu.
   3. Dla każdej próbki pacjenta w danym cyklu najpierw normalizuj parametr generowania trombiny lub plazminy do wartości NPP zmierzonej w tym samym cyklu.
   4. Podziel ten wynik przez zdrowy stosunek dawców do NPP wcześniej ustalony dla tej samej partii NPP (patrz krok 5.6.2). Daje to wartość względną znormalizowaną do przeciętnej zdrowej osoby, ze standaryzacją zmienności między biegami przy użyciu NPP.
   5. Wartości parametrów wyrażamy w procentach względem średniej wartości zdrowych osobników (zdefiniowanej jako 100%). Przedstawiaj wyniki próbek pacjentom odpowiednio.
      UWAGA: Względne wartości parametrów dla każdej pojedynczej próbki pacjenta oblicza się według następującego wzoru: run a oznacza cykl pomiarowy próbki pacjenta, a run b to run referencyjny, w którym próbki zdrowego dawcy były mierzone równolegle z tą samą partią NPP. Nasz plik Excel zawierający obliczenia normalizacji danych jest dostępny na żądanie.
      

6. Generowanie krzywych kalibracyjnych

1. Przygotuj krzywą kalibracyjną trombiny
   1. Odtworzenie liofilizowanej ludzkiej α-trombiny zgodnie z instrukcjami w układzie katalogowym producenta.
      UWAGA: Na przykład, jeśli karta katalogowa określa rekonstrukcję w wodzie o pojemności 100 μL, aby uzyskać 3,34 mg/mL, odpowiada to 0,334 mg w 100 μL.
   2. Rozcieńcz zrekonstytuowany trombin 1:10 w buforze Tris/NaCl.
      UWAGA: Daje to stężenie stockowe około 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), na podstawie masy cząsteczkowej 36 700 g/mol.
   3. Przygotuj serię rozcieńczeń w buforze Tris/NaCl, aby uzyskać końcowe stężenia trombiny w badaniu w zakresie od 0 do 152 nmol/L.
   4. Pipeta włóż trombinę do wybranych studni już zawierających bufor, osiągając całkowitą objętość 100 μL na odwiert.
   5. Przygotuj roztwór podłoża dla pompy 1, mieszając 300 μL bufora Tris/NaCl z 200 μL substratu trombinowego od etapu 1.2.2.
   6. Dalej rozcieńcz ten roztwór, łącząc 400 μL mieszaniny z 360 μL buforu Tris/NaCl.
   7. Dodaj 20 μL tej mieszanki do każdego dołka kalibracyjnego, co daje całkowitą objętość testu 120 μL.
   8. Delikatnie wymieszaj płytkę i włóż ją do czytnika płyt. Prowadź test kinetyczny przez 25 cykli, stosując te same ustawienia fluorescencji opisane w sekcji 2.
   9. Eksportuj surowe dane fluorescencji i określaj początkowy nachylenie (tempo wzrostu fluorescencji na cykl) dla każdego stężenia trombiny za pomocą GraphPad Prism lub odpowiedniego oprogramowania.
   10. Generuj standardową krzywą, rysując początkowe nachylenie względem stężenia trombiny.
       UWAGA: Upewnij się, że wszystkie bufory są wstępnie podgrzane do 37 °C i obsługują enzymy na lodzie. Zawsze przygotowuj świeże rozcieńczenia i dokładnie wymieszaj. Powstała krzywa standardowa służy do obliczenia względnej aktywności trombiny w nieznanych próbkach za pomocą makro opisanego w sekcji 5.
2. Przygotowanie krzywej kalibracji plazmy
   1. Rekonstytuacja plazminy liofilizowanej w wodzie destylowanej (np. 0,543 mL) zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Plazmina ma masę cząsteczkową 75 400 g/mol. Uzyskane stężenie zapasowe wynosi około 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), zakładając 1 mg w 0,543 mL.
   2. Przygotuj serię rozcieńczeń w buforze Tris/NaCl, aby uzyskać końcowe stężenia plazminy w teście w zakresie od 66 do 532 nmol/L.
   3. Plazminę pipetę wprowadzać do studni zawierających bufor Tris/NaCl, aby osiągnąć końcową objętość 100 μL na odwiert.
   4. Przygotuj roztwór podłoża dla pompy 1, mieszając 680 μL buforu Tris/NaCl z 80 μL podłoża plazmin/rodaminy (wstępnie rozcieńczonego 1:1, jeśli jest potrzebne) od etapu 1.2.5.
   5. Dodaj 20 μL tego roztworu substratowego do każdej studni kalibracyjnej, co daje całkowitą objętość 120 μL.
   6. Delikatnie wymieszaj płytkę i włóż ją do czytnika płyt. Prowadź test kinetyczny przez 25 cykli, używając tych samych ustawień fluorescencji, co opisane w Sekcji 2.
   7. Eksportuj surowe dane fluorescencji i określaj początkowy nachylenie wzrostu fluorescencji dla każdego stężenia plazmy, stosując regresję liniową do fazy liniowej krzywej kinetycznej za pomocą oprogramowania GraphPad Prism lub równoważnego.
   8. Generuj standardową krzywą, rysując początkowy nachylenie względem stężenia plazminy.
      UWAGA: Ze względu na różnice aktywności plazminy w poszczególnych partiach, kalibracja powinna być powtarzana przy każdej nowej partii. Jeśli zaobserwuje się niespodziewanie wysoką aktywność, zaleca się rozcieńczenie zapasu w stosunku 1:2 przed przygotowaniem serii kalibracyjnej.
3. Użyj krzywej kalibracyjnej do kwantyfikacji
   1. Wykorzystaj krzywe kalibracyjne wygenerowane w Sekcji 6, aby przekształcić wartości nachylenia fluorescencji na względną aktywność enzymów.
   2. Do interpolacji nieznanych próbek używaj wyłącznie liniowej części krzywej kalibracyjnej.

Wyniki

Reprezentatywne krzywe generowania trombiny i plazminy uzyskane za pomocą testu hemostazy Nijmegen (NHA) przedstawiono na Rysunku 3. Intensywność sygnału każdej krzywej wyraża się jako procent w stosunku do równocześnie mierzonej normalnej próbki plazmy (NPP). Próbka z NPP jest dołączana do każdego testu jako wewnętrzna kontrola mająca na celu weryfikację ważności testu i zapewnienie porównywalności między seriami.

Rysunek 3A,...

Dyskusja

Badanie hemostazy Nijmegen (NHA) to dwuenzymowy test fluorogenny, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazmy w osoczu ubogim w płytki krwi. Dzięki uchwyceniu obu procesów w jednym dołku, metoda umożliwia wysokorozdzielczą analizę kinetyczną wtórnej hemostazy i fibrynolizy. Ten podwójny odczyt oferuje wyraźne przewagi metodologiczne w porównaniu z konwencjonalnymi testami i został z powodzeniem stosowany w badaniach niedoborów czynników koagulacyjnych, schorzeń hiperfibrinolityczn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały
Chlorohydrat wapnia (CaCl2,2H2O)	Merck	1.02382
Cefalina (zestaw odczynnikowy C.K. Prest 5 APTT)	Stago	00847	Stabilna przez 6 miesięcy przy -20 stopień i stopień C
Woda destylowana			Zarejestruj datę otwarcia. Użyj w ciągu 1 dnia od pierwszego otwarcia.
Dimetylosiarkowotlenek (DMSO)	Merck	1.02950.0500
Ludzki alfa-trombina	Laboratoria Badań Enzymów	HT 1002a	Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 i mikro; L dodanej ludzkiej trombiny w 120 i mikro; Odczynnik L daje końcowe stężenie 76 nmol/L.
Plazma ludzka	Laboratoria Badań Enzymów	HPlas	Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 i mikro; L dodanych ludzkiej plazminy w 120 i mikro; Odczynnik L daje końcowe stężenie 200 nmol/L.
Normalna plazma zgromadzona	Przygotowanie wewnętrzne	Nie dotyczy	Stabilne przez 3 godziny po rozmrożeniu, jeśli trzyma się na lodzie.
Osocze pacjenta	Nie dotyczy	Nie dotyczy
Substrat plazminowy (CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid)-rodamina-morfolinomocz	Symeres		Stabilny przez 6 miesięcy przy -80 °C
Rekombinowany czynnik tkankowy ludzki (TF): Innovin	Dade Behring	B4212	Stabilny przez 6 miesięcy przy -80 °C
Rekombinowany aktywator plazminogenu tkankowego typu (tPA): Alteplaza/Aktyliza	Boehringer Ingelheim		Stabilna przez 12 miesięcy przy -80 °C
Tris(hydroksylmetylo)aminometan (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Bufor Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)	Przygotowanie wewnętrzne	Nie dotyczy
Bufor Tris-NaCl-CaCl2 bufor, pH 7,4 (TBS-Ca)	Przygotowanie wewnętrzne	Nie dotyczy
Substrat trombinowy Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-metylokoumaryna	Symeres		Stabilny przez 6 miesięcy przy -80 °C
Sprzęt
Fluorimetr / czytnik mikropłyt Fluostar Optima z kontrolą temperatury i wtryskiwaczami odczynników	BMG Labtech
96-dołkowa płytka mikromiareczkowa, polistyren, płaskie dno,, średnia powierzchnia wiązania (odpowiednik mikrolonów)	Greiner BIO-ONE	655076
Waga analityczna (waga obciążająca od góry)
Niebieskie końcówki pipet (dla 100-1000 i mikro; L)
Probówki do pobierania krwi z cytrynianem 3mL (3,2% cytrynian)	BD Vacutainer
Wiadro z lodem
Maszyna do lodu
Inkubator / mikropłyta wstrząsająca
Mieszadła magnetyczna
Stojak rur mikrowirówek
Rurki mikrowirówkowe, zamykalne
pH-metr
Końcówki pipety 0,1-10 & mikro; L, niesterylna
Pipety (2, 10, 20, 100 i 1000 & mikro; L)
Śrubokręt (używany jako sonda)
Mieszalnik rurowy
Kąpiel wodna
Żółte końcówki pipety (dla 20-200 i mikro; L)