Artykuł metodologiczny

Procedura krok po kroku produkcji chimery linii zarodkowej u kurczaków poprzez pierwotny przeszczep komórek zarodkowych

DOI:

10.3791/69704

⸱

5 grudnia 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ptasie chimery linii zarodkowej, powstające w wyniku przeszczepu pierwotnych komórek zarodkowych (PGC) do zarodków biorców, umożliwiają zastosowanie w transgenezie, edycji genów oraz ochronie gatunków. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury izolacji PGC, ekspansji in vitro , mikroiniekcji oraz weryfikacji dawcy, zapewniając niezawodną platformę do produkcji chimerów linii zarodkowej oraz rozwoju biotechnologii ptaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie chimerów linii zarodkowych u kur poprzez przeszczepianie pierwotnych komórek zarodkowych (PGC) zapewnia solidną i powtarzalną platformę do transgenezy ptaków, edycji genomu oraz ochrony gatunków. Tradycyjne metody wykorzystujące komórki blastodermalne z zarodków EGK stadium X są ograniczone przez niską efektywność transmisji linii zarodkowej spowodowaną wczesną segregacją linii komórkowych. Natomiast strategie pośredniczone przez PGC wykorzystują wewnętrzną kompetencję linii zarodczej tych unipotentnych komórek, umożliwiając niezawodną inkorporację do gonad biorców. Przedstawiamy tutaj stopniowy protokół izolowania PGC z zarodków HH stadium 26-28, ich utrzymania i rozszerzania in vitro oraz przeszczepienia do aorty grzbietowej zarodków biorców HH stadium 14-17. Krótkotrwałe wszczepienie monitoruje się za pomocą markerów fluorescencjących, takich jak PKH26, natomiast długoterminowy wkład linii zarodkowej potwierdza się analizą PCR gonad biorców. Takie podejście zapewnia spójne generowanie chimerów linii germinalnych, jednocześnie zachowując żywotność i kompetencje funkcjonalne dawców PGC. Dodatkowo metoda jest kompatybilna z narzędziami do edycji genomu, takimi jak CRISPR/Cas9 oraz wektorami opartymi na transpozonach, umożliwiając tworzenie modeli ptasich transgenicznych i modyfikowanych genetycznie. Poza badaniami podstawowymi, strategia ta wspiera działania ochronne poprzez międzygatunkowe przekazywanie linii germologicznych oraz ochronę zasobów genetycznych. Ogólnie protokół ten zapewnia kompleksowe i wiarygodne ramy do manipulacji linią germinalną ptaków, oferując wszechstronną platformę zarówno do badań podstawowych, jak i stosowanych w biotechnologii drobiu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna transmisja komórek zarodczych (PGC) za pośrednictwem linii zarodkowej jest najwydajniejszą metodą przekazywania informacji genetycznej kolejnemu pokoleniu u ptaków 1,2,3. Chimery linii zarodkowej, definiowane jako osobniki noszące zarówno komórki genetyczne pochodzące od dawcy, jak i gospodarza, umożliwiają przekazywanie materiału genetycznego dawcy potomstwom, wspierając zastosowania w transgenezie, genomice funkcjonalnej oraz ochronie zagrożonych gatunków 4,5,6,7,8. W przeciwieństwie do podejść opartych na komórkach blastodermalnych, strategie pośredniczone przez PGC zapewniają wyższą efektywność transmisji linii zarodkowej i ich powtarzalność, co czyni je dobrze przystosowanymi do precyzyjnej manipulacji genetycznej.

U gatunków ptaków PGC pochodzą z centralnego regionu pellucida blastodermy w stadium Eyal-Giladi i Kochav (EGK) X9, a następnie migrują do półksiężyca zarodkowego przez stadium4-10 Hamburgera i Hamiltona (HH). Między etapami HH 9 a 12 PGC krążą przez naczynia krwionośne zarodkowe, zanim osiedlą się na grzbiecie gonadalnym 11,12,13. Te wyraźne wzorce migracyjne umożliwiają izolację PGC na wielu etapach, w tym na półksiężycu zarodkowym, krążącej krwi i gonadach14. Warto zauważyć, że PGC pobrane z gonad w stadium HH 26-28 i przeszczepione do zarodków biorcy w stadium HH 14-17 wykazują optymalną kompetencję linii zarodkowej i efektywność wszczepiania, co stanowi praktyczne ramy dla standaryzowanego stosowania tego protokołu.

PGC mogą być utrzymywane i rozwijane in vitro, zachowując jednocześnie tożsamość linii zarodczej i zdolność przenoszenia, co umożliwia ich wykorzystanie do stabilnej modyfikacji genetycznej. Produkcja chimery linii zarodkowej za pośrednictwem PGC została wykorzystana do generowania ptaków transgenicznych wyrażających białka rekombinowane, śledzenia linii zarodkowej, manipulowania szlakami determinacji płci oraz zapewnienia odporności na choroby zakaźne 6,15,16,17,18,19. Ponadto przeszczep PGC ułatwia międzygatunkowe przekazywanie linii zarodkowej i ochronę zagrożonego ptasiego materiaługenetycznego 7,8,20,21,22,23, a krioprezerwacja PGC umożliwia długoterminowe zachowanie zasobów genetycznych24,25.

Chociaż inne typy komórek macierzystych, w tym embrionalne komórki macierzyste (ESCs)26,27,28,29, indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPSCs)30,31,32 oraz plemnikowe komórki macierzyste (SSC)33,34, były badane pod kątem modyfikacji linii zarodkowej ptaków, ich efektywność transmisji linii zarodkowej pozostaje niższa niż w systemach opartych na PGC, które są obecnie uważane jest za najbardziej wiarygodne źródło komórek zdolnych do linii zarodkowej.

W badaniach chimery linii zarodkowej wybór rasy dawcy jest kluczowy dla rozróżnienia komórek zarodkowych pochodzących od komórek pochodzących od gospodarza. Koreański kurczak Ogye (KOC) posiada recesywny allel i/i odpowiedzialny za czarną skórę i pióra, który łatwo odróżnić od linii White Leghorn z dominującym allelem I/I 35,36. Ta widoczna różnica pozwala jednoznacznie zidentyfikować potomstwo pochodzące od dawcy podczas analizy transmisji linii zarodkowej, a także wspiera ochronę bioróżnorodności dzięki rodzimej wartości genetycznej KOC.

Ogólnie rzecz biorąc, produkcja chimery linii zarodkowej za pośrednictwem PGC stanowi solidną podstawę dla biotechnologii ptaków (Rysunek 1). Poprzez określenie optymalnych stadij dawcy (HH26-28) i biorcy (HH14-17) oraz uwzględnienie określonych etapów hodowli i walidacji, protokół ten umożliwia efektywne przekazywanie linii zarodkowej i zapewnia praktyczne ramy dla generowania ptaków transgenicznych i edytowanych genomem, a także do zachowania cennych zasobów genetycznych ptaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem kur zostały zatwierdzone przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, Uniwersytet Narodowy w Seulu, Korea Południowa (numer zatwierdzenia IACUC: SNU-250226-4). Zwierzęta były utrzymywane w kontrolowanych i higienicznych warunkach, zapewniając sterylną wodę i paszę. Ponadto wszystkie odpady chemiczne i biologiczne powstałe podczas procedur, w tym roztwory trypsyny/EDTA, komórki znakowane PKH26 oraz tkanki embrionalne lub gonadaliczne, były traktowane i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego dotyczące bezpieczeństwa biologicznego i zarządzania odpadami niebezpiecznymi Uniwersytetu Narodowego w Seulu. Wszystkie odczynniki i urządzenia używane w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Nośniki PGC i odczynniki używane do pobierania próbek gonad oraz hodowli komórek zarodków dawcy muszą być bezpłodne.

1. Izolacja PGC dla kurczaków

  1. Inkubuj świeżo zapłodnione jaja kurczaka w stadium X Eyal-Giladi i Kochav (EGK) w temperaturze 37 °C przez 5,5 dnia, aż zarodki osiągną etapy HH 26-28.
    UWAGA: Utrzymuj wilgotność na poziomie 60%-65%, aby zapewnić prawidłowy rozwój embrionalny.
  2. Ostrożnie izoluj zarodki z komórek jajowych na etapach HH 26-28 za pomocą sterylnych kleszczy.
  3. Przemyj zarodki 1× PBS, następnie umieść je na płycie węglowej i zabezpiecz szpilkami owad. Za pomocą stereomikroskopu ostrożnie rozbierz parowane zarodkowe gonady za pomocą naostrzonych kleszczy.
    UWAGA: Delikatnie obchodzić się z tkankami, aby zapobiec uszkodzeniom i zapewnić dokładną izolację gonad. Ze względu na bliskość do nerki mezonefrycznej na stadiach HH 26-28, niewielka ilość tkanki nerkowej może zostać przypadkowo zebrana; jednak staranna sekcja pod stereomikroskopem i warunki selektywnej hodowli sprawiają, że mnożą się tylko PGC, zachowując czystość.
  4. Przenieś parowane gonady zebrane z trzech zarodków do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 500 μL 0,05% trypsyny/EDTA i inkubuj w 37 °C przez 5 minut, aby rozdzielić komórki.
  5. Dodaj 50 μL FBS, aby dezaktywować trypsynę.
  6. Wirówka w 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (około 20-25 °C). Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
  7. Ponownie zawiesij rozłączone komórki gonadalne w 1 mL 1× PBS.

2. Proliferacja in vitro kurczaków PGC

  1. Przygotuj podłoże pośrednie PGC (KO-DMEM uzupełnione 20% FBS, 2% surowicą dla kur, nukleozydami, GlutaMAX, aminokwasami nieistotnymi MEM, 2-merkaptoetanolem, 10 mM pirotrowęglianem sodu, antymikotycznym, 10 ng/mL bFGF) i podgrzej podłoże do 37 °C.
  2. Dodaj rozłączone komórki gonadalne pobrane z trzech zarodków na etapach HH 26-28 (około 100-150 PGC na zarodek37,38) do 1 mL podgrzewanego podłoża hodowlanego na dołek i połóż komórki na płytkę hodowlową z 12 dołkami.
  3. Delikatnie kołysz płytę, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek.
  4. Utrzymuj PGC na poziomie 37 °C z 5% CO₂, codziennie monitoruj morfologię i gęstość komórek. PGC pozostają okrągłe, ogniotrwałe i zazwyczaj unoszące, podczas gdy komórki somatyczne są przyczepne (Rysunek 2A).
    UWAGA: Warunki hodowli selektywnie wspierają proliferację PGC, pozwalając na ich rozszerzanie się, podczas gdy komórki somatyczne są stopniowo eliminowane.
  5. PGC hodowane na 12-dołowej płycie są utrzymywane poprzez zmianę podłoża hodowlanego co 3-4 dni, aby wspierać optymalną proliferację i żywotność (Rysunek 2B).
  6. Opcjonalnie należy użyć markerów specyficznych dla PGC (np. CVH, DAZL, NANOG i POUV) do weryfikacji czystości i przeprowadzenia określania płci za pomocą PCR (Tabela 1).
    1. Przygotuj próbki PGC do ekstrakcji RNA za pomocą systemu RNA Miniprep zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wykonaj RT-PCR (np. CVH, DAZL, NANOG i POUV) lub immunodobarwienie z użyciem markerów specyficznych dla PGC (SSEA1 i DAZL) zgodnie ze standardowymi protokołami39 (rysunek 2C,D).
    3. Wykonaj analizę PCR według standardowych protokołów40 (Rysunek 2E).

3. Walidacja kompetencji linii zarodkowej hodowanych PGC z wykorzystaniem oznakowania PKH26

  1. Zbiera się PGC, gdy osiągną fazę wzrostu logowego, zazwyczaj z gęstością około 1-5 × 105 komórek na odwiert w płytce z 12 dołkami.
  2. Rozpyl komórki przez wirowanie w 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (około 20-25 °C), następnie ponownie zawiesij w 1× PBS i oceniaj żywotność za pomocą trypanowego niebieskiego.
  3. Przygotuj rozcieńczacznik C z zestawu PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit do ogólnego oznaczania błony komórkowej i wyrównuj go do temperatury pokojowej (około 20-25 °C).
  4. Rekonstytucja barwnika PKH26 i przygotowanie roztworu roboczego w rozcieńczalniku C przy końcowym stężeniu około 1-2 μM.
  5. Ponownie zawiesij pellet PGC w 1 mL rozcieńczalnika C. Szybko dodaj 1 ml roztworu PKH26 (stosunek 1:1), delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej (około 20-25 °C).
  6. Szybko dodaj 1 mL roztworu roboczego PKH26 do zawiesiny ogniwa (stosunek 1:1), delikatnie wymieszaj pipetowanie i inkubuj w temperaturze pokojowej (około 20-25 °C) przez 2-5 minut.
    UWAGA: Nie przekraczaj zalecanego czasu inkubacji.
  7. Zatrzymaj plamy, dodając 2-4 razy większą objętość niż FBS lub 1%-5% BSA w PBS.
  8. Wirówka przy 200 × g, 5 minut w temperaturze pokojowej (około 20-25 °C); mycie trzy razy podłożem PGC lub 1× PBS + 0,1% BSA.
  9. Ponownie zawiesijcie komórki w buforze do wstrzykiwania (pośrednik PGC lub 1× PBS + 0,1% BSA) w stężeniu 1-5 × 104 do 1 × 105 komórek/μL. Trzymać je na krótko w lodzie, aby zachować żywotność.
  10. Przed podkłuceniem zweryfikowaj oznakowanie pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek 3A).
  11. Wstrzyknąć ponad 3 000 żywotnych oznakowanych PGC, zliczonych za pomocą trypanowego niebieskiego, do zarodków HH stadium 14-17 i inkubować do 6. dnia (rysunek 3B).
  12. Potwierdź kolonizację gonad odbiorczych do 6. dnia (rysunek 3C).

4. Przeszczep PGC dawcy do naczynia krwionośnego embrionalnego biorcy

  1. Inkubuj jaja biorców do poziomu HH 14-17 (37 °C, wilgotność 60-70%, kołysząc się o 45° co godzinę).
  2. Przygotuj mikropipetę kapilarną szklaną z użyciem rurek borokrzemowych (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,5-0,75 mm). Pobieraj kapilarę za pomocą mikropipety i wypoleruj jej czubek do średnicy wewnętrznej około 10-20 μm.
  3. Stwórz małe okienko (około 0,5 cm × 0,5 cm) na końcu komórki jajowej, aby umożliwić dostęp do mikrozastrzyków, minimalizując zakłócenia zarodka.
    UWAGA: Przed otwarciem okna sterylizuj powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  4. Wstrzyknąć 2 μL zawiesiny zawierającej ponad 3 000 pśw. 1× PBS lub HBSS do aorty grzbietowej pod stereomikroskopem.
    UWAGA: Wykonaj zastrzyk pod stereomikroskopem, aby uniknąć uszkodzenia zarodka lub naczyń krwionośnych, i ostrożnie manipuluj igłą mikrowstrzykową, aby zapobiec urazom.
  5. Zamknąć okno jajka filmem parafinowym; Umieść jajko na ostrym końcu w dół i wysiadaj do wyklucia w temperaturze 37,5 °C, wilgotności 60-70%, kołysząc się co godzinę o 45°.
    UWAGA: Utrzymuj odpowiednią temperaturę i wilgotność, aby zapewnić żywotność zarodka i pomyślny rozwój.

5. Walidacja chimery linii zarodkowej

  1. Po wykluciu pobierz jądro lub jajnik od pisklęcia G0.
  2. Ekstrakt genomowego DNA z zebranych tkanek gonad, aby potwierdzić powstawanie chimery linii zarodkowej. Przeprowadz ekstrakcję DNA genomową z zebranych tkanek gonadalnych w następujący sposób:
    1. Pobierz jądra lub tkankę jajnika, ujednolic je w 300 μl buforu lizycznego (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS) zawierającego 1,5 μL proteinazy K, i inkubuj w temperaturze 60 °C przez h, aby zapewnić pełną lizę.
    2. Dodaj 100 μL roztworu wytrącenia białka (7 M octana amonu), dokładnie wymieszaj i wiruj w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przelej supernatant (fazę wodną) do nowej rurki, dodaj 500 μL izopropanolu w celu wytrącenia DNA i wiruj w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usuń supernatant, dodaj 1 ml 70% etanolu i wiruj w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Wyjmij etanol, susz granulkę DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    6. Elokuj DNA za pomocą 50 μL wody wolnej od RNazy i mierz stężenie oraz czystość DNA za pomocą spektrofotometru (A260/A 280 ≈ 1.8).
    7. Dostosuj DNA do 10-5 ng na reakcję PCR.
  3. Wykonaj amplifikację PCR przy użyciu zapalników specyficznych dla gatunku (Tabela 1) zaprojektowanych w następujących warunkach: 94 °C przez 3 minuty, następnie 35 cykli 94 °C przez 30 s, 68 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, plus końcowe rozszerzenie przy 72 °C przez 5 minut (Rysunek 4A).
  4. Pobieranie nasienia od płciowo dojrzałych samców G0, ekstrakcja DNA plemników według tego samego protokołu oraz wykonanie PCR przy użyciu primerów specyficznych dla gatunku (rysunek 4B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferacja in vitro i charakterystyka PGC kurczaków
Całe komórki gonadalne zawierające PGC zostały wyizolowane z zarodków w stadiach HH 26-28 i hodowane w określonych warunkach hodowli PGC. Z czasem komórki stromalne gonadalne albo przylegały do powierzchni hodowli, albo ulegały degradacji, podczas gdy PGC pozostawały w zawiesie i zaczęły aktywnie się rozmnażać (Rysunek 2A). Po około dwóch tygodniach hodowli populacja PGC powiększyła się do pon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczepienie hodowanych pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) do zarodków biorców stanowi niezawodną metodę produkcji chimerów linii zarodkowej u kur. Protokół ten wykorzystuje wewnętrzny potencjał linii zarodkowej PGC i poprawia spójność eksperymentów w porównaniu z tradycyjnymi systemami opartymi na blastodermie, które są podatne na mozaicizm i zmienność rozwojową. Kluczową zaletą tej metody jest selektywna ekspansja in vitro PGC w określonych warunkach hodowlanych, co zachowuje ich tożsamość linii germlino...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) [RS-2024-00418297] oraz Program Współpracy Badawczej na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolnictwa [RS-2025-02213489] z Koreańskiej Administracji Rozwoju Obszarów Wiejskich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBS HiklonSH30256
2-MerkaptoetanolGibco21985023
Antybiotykowy roztwór przeciwmykotyczny (100X)Gibco15240062
Przeciwciało anty-DAZLAbcamab215718
Serum z kurczaka sterylneRocklandD102-00-0500
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydłaSigma Aldrich9003-98-9
Drummond Microcaps Jednorazowe mikropipety  Drummond Scientific Company1-000-0500
Nukleozydy EmbryoMax (100X)MerckES-008-D
FBS (Charakteryzowany Seurm płodu bydłego, pochodzący z USA, 500 ml)HiklonSH30919
Suplement GlutaMAXGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
Roztwór nieistotnych aminokwasów MEMGibco11140050
Film laboratoryjny Parafilm MAmcorPM996 
PKH26 Zestaw Linker Czerwonych Fluorescencyjnych Komórek do ogólnego znakowania błony komórkowejSigma AldrichPKH26GL-1KT
Oczyszczone przeciwciało przeciw myszom i człowiekowi CD15 (SSEA-1)Biolegenda125602
Rekombinowane ludzkie białko FGF zasadowe/FGF2/bFGF (146 aa);R& Układy D  233-FB
ReliaPrep RNA Miniprep SystemyPromegaZ6011
Pirowinian sodu (100 mM)Gibco11360070
Roztwór trypanowego niebieskiegoSigmaT8154-100ML
Trypsyna-EDTA (0,5%), brak fenolu czerwonegoGibco &hand;15400054

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pierwotne kom rki p ciowetransplantacja PGCtransgeneza ptak wedycja genomuzarodki kurczakami dzygatunkowa transmisja linii zarodkowejCRISPR Cas9markery fluorescencyjneanaliza PCR gonad

Powiązane artykuły