Artykuł metodologiczny

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

DOI:

10.3791/69721

⸱

2 stycznia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie receptorami T receptorami chimerycznego (CAR) wykazały niezwykłą skuteczność w kilku nowotworach hematologicznych, jednak ich skuteczność nie została w pełni powtórzona w guzach litych. Co więcej, nawet w nowotworach hematologicznych, nawrót po infuzji komórek T CAR nadal negatywnie wpływa na długoterminowe wyniki. Te wyzwania podkreślają pilną potrzebę opracowania strategii zwiększających skuteczność, trwałość komórek CAR T, pokonywanie odporności na guzy i mikrośrodowisko. Skupione, regularnie przeplatane platformy przesiewowe oparte na CRISPR i Cas9 zapewniają potężne podejście do systematycznej identyfikacji genów regulujących funkcjonowanie komórek CAR T. Łącząc zaburzenia genetyczne z wynikami fenotypowymi, testy te umożliwiają odkrycie szlaków kontrolujących aktywację, proliferację, formowanie pamięci i cytotoksyczność. Standardowe procesy obejmują transdukcję znacznej liczby komórek z pojedynczą biblioteką przewodnika RNA (sgRNA), edycję pośredniczoną przez Cas9, selekcję edytowanych komórek oraz amplifikację PCR kaset sgRNA z DNA genomowego (gDNA) przed sekwencjonowaniem. Jednak amplifikacja PCR z dużą ilością gDNA stanowi poważne wyzwanie i często nie jest w stanie selektywnie amplifikować oraz odzyskać sgRNA. Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 z powodu knockoutu, który testowaliśmy na podstawowych ludzkich komórkach CAR T. Metoda ta zawiera etap pośredni podczas przygotowania biblioteki sgRNA, który zmniejsza przenoszenie gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i selektywne wyciąganie kasety sgRNA, zwiększając tym samym efektywność pierwszej amplifikacji PCR. Ta modyfikacja pozwoliła nam uzyskać informacje sgRNA z naszych ekranów komórek CAR T, które wcześniej były nieuchwytne w naszych poprzednich próbach przy użyciu tradycyjnych protokołów amplifikacji PCR 1- i 2-krokowej. Podsumowując, ten zoptymalizowany workflow ułatwia przygotowanie biblioteki przesiewowej CRISPR w wymagających próbkach oraz umożliwia identyfikację kluczowych czynników genetycznych, które można skierować w celu poprawy skuteczności terapeutycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoterapia zrewolucjonizowała leczenie raka, oferując nowe strategie wykorzystania i modulacji układu odpornościowego. Wśród nich terapia receptorami antygenowymi (CAR) stała się jednym z najbardziej transformujących podejść. Terapia ta polega na inżynierii genetycznej komórek T pacjenta ex vivo z syntetycznym receptorem zaprojektowanym do rozpoznawania konkretnego antygenu nowotworowego, co zwiększa aktywność przeciwnowotworową1. Limfocyty CAR T wykazały niezwykłe sukcesy w leczeniu nowotworów hematologicznych, z rezultatami od krótkotrwałych remisji po przedłużone przeżycie bez choroby przy minimalnej toksyczności u pacjentów otrzymujących terapie CD19 lub BCMA2. Do tej pory FDA zatwierdziła siedem produktów z limfocytami CAR T dla nowotworów hematologicznych3. Pomimo tych postępów, pozostają istotne ograniczenia. Wyzwania pojawiają się w samym produktie limfocytów T CAR, często wpływanym przez proces produkcji lub przystosowanie komórek T pacjenta, które mogą być upośledzone przez postęp choroby, wcześniejsze terapie lub wiek. Mechanizmy odporności wewnętrznej guza, takie jak obniżenie poziomu antygenu, również mogą osłabiać skuteczność4. Ponadto mikrośrodowisko guza immunosupresyjnego stanowi dodatkową barierę, która poważnie ogranicza trwałość i funkcjonowanie komórek CAR T, szczególnie u pacjentów z guzemlitym 5. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zwiększenia zarówno początkowej, jak i długoterminowej skuteczności terapii komórkami CAR T.

Pojawienie się edycji genów CRISPR-Cas9 dostarczyło potężnych narzędzi do analizy funkcji genów poprzez szeroko zakrojone metody przesiewowe. W tych testach komórki są transdukowane za pomocą biblioteki pojedynczego przewodnikowego RNA (sgRNA), zazwyczaj dostarczanej przez wektory lentiwirusowe, co zapewnia jedno sgRNA na komórkę i stabilną integrację genomową. Po edycji i selekcji komórek transdukowanych przez Cas9, ekstrahowane jest DNA genomowe (gDNA), a kasety sgRNA amplifikowane za pomocą PCR do przygotowania biblioteki. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości umożliwia następnie ilościowe określenie rozkładów sgRNA w różnych fenotypach, identyfikując geny, które pozytywnie lub negatywnie regulują proces objęty badaniem6.

Badania CRISPR były szeroko stosowane w badaniach biologii limfocytów T, a ostatnio także w celu poprawy wydajności komórek CAR T. Badania przesiewowe obejmujące cały genom zidentyfikowały regulatory podstawowych procesów limfocytów T, w tym aktywacji, proliferacji i różnicowania. Na przykład FAM49B został zidentyfikowany jako regulator sygnalizacji receptorów limfocytów T7, podczas gdy SOCS1, TCEB2, RASA2 i CBLB okazały się niezbędne do proliferacji po stymulacji8. Poza tymi kluczowymi szlakami, badania CRISPR wyjaśniły także geny zaangażowane w pamięć i wyczerpanie komórek T. Badania in vivo zidentyfikowały Fli1 jako kandydata do wzmocnienia odpowiedzi efektorowych bez zakłócania pamięci lub prekursorów wyczerpania9, a chromatynowy remodeler Arid1a jako regulator, którego utrata zmniejsza wyczerpanie limfocytów T10. Regulatory różnicowania typu pomocniczego typu T 2 (Th2) również zostały scharakteryzowane tym podejściem11. Korzystając z niestandardowej biblioteki sgRNA skierowanej do 25 kinaz, stwierdzono, że p38 sprzyja ekspansji, formowaniu pamięci oraz ochronie przed stresem oksydacyjnym i genomowym12. Podobnie, knockout REGNASE-1 w komórkach CD8+ T zapewnił długotrwały fenotyp efektora, który poprawił kontrolę guza w modelach czerniaka i białaczki13. Dodatkowe badania przesiewowe obejmujące cały genom zidentyfikowały Dhx37 jako regulatora aktywacji limfocytów T i cytotoksyczności14, natomiast LTBR i inne geny zostały zweryfikowane jako wzmacniacze funkcji limfocytów T w komórkach CAR T i γδ T15. Ostatnio przesiewowe badania CRISPR zostały zastosowane bezpośrednio w komórkach CAR T, ujawniając nowe cele, takie jak PRODH2, enzym zaangażowany w metabolizm proliny zwiększający aktywność przeciwnowotworową CAR T16, oraz TLE4 i IKZF2, których inaktywacja poprawiła skuteczność CAR T w modelach glejaka17.

Kluczowym krokiem w badaniach CRISPR jest właśnie selektywna amplifikacja kaset sgRNA z niezwykle dużych ilości gDNA, co jest wyzwaniem trudnym do obejścia ze względu na ogromną liczbę komórek używanych w badaniach CRISPR. Amplifikacja PCR z tak dużych ilości DNA z DNA wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, w tym stłoczeniem molekularnym, które ogranicza fizyczną dyfuzję cząsteczek DNA i polimerazy, przejściowym niespecyficznym wiązaniem starterów i polimerazy z tłem DNA, amplifikacją poza celem skutkującym wyczerpaniem starterów lub sekwestracją Mg2+ przez szkielet fosforanu DNA, między innymi18, 19,20,21. Często skutkują one awarią PCR i/lub błędem błędu. Aby złagodzić te problemy, zaproponowano różne strategie, w tym rozdzielenie amplifikacji sgRNA od dodawania adaptorów na dwa krokiPCR 22, wykorzystanie wzbogacenia celów biotinylowanymi oligoplazmami i magnetycznym przechwytywaniem kulek 23,24 lub projektowanie plazmidów z miejscami restrykcyjnymi po obu stronach kasety sgRNA dla wzbogacenia fragmentów25.

W niniejszym badaniu przedstawiamy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych ludzkich komórek CAR T. Biblioteka CRISPR używana to Brunello Kinome 1, biblioteka zawierająca 3052 unikalne 20nt-długie sgRNA celujące w 763 ludzkie geny kinaz (4 sgRNA na cel). Limfocyty T izolowano poprzez magnetycznie pozytywną selekcję CD4+ i CD8+ z frakcji wzbogaconych o komórki monojądrowe krwi obwodowej (PBMC) w próbkach krwi od zdrowych dawców. Po aktywacji anty-CD3 i anty-CD28, limfocyty T zostały zakażone biblioteką przesiewową CRISPR, a następnie przekształcone lentiwirusem CAR. Komórki były rozszerzane, a następnie nukleofektowane, aby wprowadzić białko Cas9. Komórki zawierające CRISPR zostały wybrane za pomocą puromycyny, a komórki T z CAR-dodatnim zostały usortowane. Po ekstrakcji DNA genomowe zostało strawione enzymami restrykcyjnymi (RE), a fragmenty zawierające sgRNA były ściągane w dół przez wychwyt biotynowej sondy i streptawidyny. Następnie sgRNA zostały selektywnie amplifikowane i indeksowane za pomocą dwóch kolejnych PCR, a powstałe biblioteki zostały sekwencjonowane. Dzięki wprowadzeniu pośredniego kroku zmniejszającego przeniesienie gDNA udało nam się selektywnie odzyskać i amplifikować interesujące nas sgRNA, co pozwala nam badać rolę kinaz w komórkach CAR T.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Universidad de Navarra. Wszyscy badani udzielili pisemnej świadomej zgody. Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja i aktywacja limfocytów T

  1. Izolacja PBMC
    1. Pobieranie próbek krwi od dawców w tubach z kwasem etylendiaminetetraoctowym (EDTA), przelewanie próbek krwi do stożkowych probówek o pojemności 50 mL oraz rozcieńczanie krwi za pomocą PBS (rozcieńczenie 1:1).
    2. Dodaj 15 mL medium gradientowego gęstości na dno stożkowej rurki o pojemności 50 mL (gęstość dla PBMC: 1,07). Następnie ostrożnie dodaj 25 ml rozcieńczonej krwi na warstwę medium gradientu gęstości (najwolniejsza prędkość sterowania pipetem). Wirówka przez 30 minut przy 800 × g bez hamulca.
    3. Zbieraj pierścień/warstwę PBMC pipetą Pasteura do stożkowej rurki o pojemności 50 mL i dodaj PBS do objętości 50 mL do mycia. Wirówka na 650 × g przez 8 minut. Usuń nadmiar.
      UWAGA: Sprawdź mętność supernatantu, aby upewnić się, że nie ma tam komórek. W razie wątpliwości podziel zawieszenie na dwukrotność pierwotnej liczby stożkowych rurek 50 mL, dodaj PBS do 50 mL i ponownie wiruj.
    4. Ponownie zawiesz 50 ml PBS. Licz z akrydyną pomarańczowo-propidium jodkiem (AOPI) w liczniku komórek. Wirówka 650 × g przez 8 minut.
  2. Dobór magnetyczny CD4 i CD8
    1. Przygotuj bufor sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS): PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5% i przefiltruj przez 0,2 μm.
    2. Ponownie zawiesz PBMC w 80 μL buforu FACS sterylnego na 10 ×10 6 komórek oraz dodaj 10 μL mikrogranulek CD4 i 10 μL mikrogranulek CD8 na 10 × 106 komórek . Inkubuj przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Dodaj 10 mL bufora FACS i wiruj przez 8 minut przy 650 × g. Całkowicie wyrzuć nadmiar.
    4. Ponownie zawiesić 500 μL na 1 × 108 komórek buforu FACS w stożkowej rurce o pojemności 15 mL.
      UWAGA: Linia może pomieścić 200 x 106 ogniw.
    5. Użyj programu Possel do izolacji AutoMaców (szybki magnetyczny sorter komórek).
    6. Dodaj do 10 ml PBS, poli z AOPI w liczniku ogniw fluorescencjowych i wiruj na 650 × g przez 8 minut.
    7. Ponownie zawiesz komórki 1 x 106/mL w pożywce wzrostu limfocytów T zawierającej 3% ludzkiej surowicy (HS), 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 625 IU/mL interleukiny (IL)-7, 85 IU/mL IL-15. Dodaj 10 μL odczynnika stymulującego limfocyty T na 1 mL i dobrze wymieszaj. Umieść 2 mL na odwierć w 24-dołowej płycie (p24w) i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.

2. Produkcja komórek T CAR i przesiewanie CRISPR

  1. Zakażenie bibliotek i transdukcja CAR
    1. Dodaj odpowiednią ilość biblioteki CRISPR lentivirusów (np. bibliotekę Brunello Kinome 1. Zobacz Tabelę Uzupełniającą 1), określoną w teście miareczkowym oraz 8 μg/mL polibrenu.
    2. Zakażenie przez wirowanie w 700 x g przez 1 godzinę i 30 minut w 32 °C.
    3. Zamień podłoże świeżym medium wzrostu limfocytów T zawierającym 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (końcowa [komórka]= 106 komórek /mL).
    4. Po 6 godzinach dodaj odpowiednią ilość wektora lentiwirusowego CAR do wielokrotności infekcji (MOI) równej 3 i inkubuj przez 4 dni.
  2. Elektroporacja Cas 9
    1. Zbierz limfocyty CAR T, raz przemyj PBS i policz komórki AOPI w liczniku fluorescencyjnym.
    2. Przygotuj 4 μM Cas9 w buforze elektroporacyjnym.
    3. Ponownie zawiesij komórki T CAR w 50 μL na 5 × 106 komórek. Wymieszaj i ostrożnie dodaj 50 μL zawiesiny komórkowej do każdej dołki paska wielorowkowego cuwette, nie tworząc przy tym pęcherzyków. Następnie, używając końcówki pipety, usuń wszelkie możliwe pęcherzyki i przesuń końcówkę wzdłuż krawędzi dołka.
      UWAGA: Jeśli w kuwecie jakaś studnia pozostaje bez próbki, dodaj tę samą objętość bufora elektroporacyjnego. To kluczowy krok: jeśli maszyna wykryje różnicę w pęcherzyku lub objętości, wyda błąd.
    4. Użyj programu EXPAND T CELL 3 , aby nukleofektować komórki CAR T.
    5. Komórki w kuwetach pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
    6. Ponownie zawiesić komórki z jądrem w pożywce wzrostu limfocytów T zawierającej 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (ostatnia [komórka]= 106 komórek /mL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
  3. Selekcja puromycyny
    1. Licz z AOPI w liczniku fluorescencyjnym.
    2. Dostosuj do 1 x 106 komórek /mL z pożywką wzrostu limfocytów T zawierającą IL7 i IL15.
    3. Dodaj puromycynę (2,5 μg/mL) do podłoża.
    4. Licz komórki co 2 dni przez 6 dni i dostosuj do 1 x 106 komórek /mL z pożywką wzrostową komórek zawierającą 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 oraz 2,5 μg/mL puromycyny.
    5. Sprawdź % CAR.
  4. Sortuj populacje komórek T CAR i przechowuj próbki (suche granulki komórkowe) w temperaturze -80 °C.

3. Izolacja gDNA

UWAGA: Unikaj wszelkich utraty komórek lub gDNA podczas całego procesu, ponieważ może to ograniczyć reprezentatywność sgRNA. Celuj w pokrycie sgRNA co najmniej 500-krotnie.

  1. Wyodrębniaj gDNA z próbek za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA tkanek i tkanek. Elutuj dwa razy, aby zmaksymalizować odzyskanie gDNA.
    UWAGA: Nie używaj więcej niż 4 x 10 komórek6 na kolumnę, aby efektywniej odzyskać gDNA.
  2. Zmierz stężenie gDNA za pomocą zestawu dsDNA do ilościowania.
    UWAGA: Jeśli stężenie jest zbyt niskie na kolejne etapy protokołu, użyj odczynnika oczyszczającego na bazie kulek w fazie stałej (SPRI) do skoncentrowania DNA.

4. Wzbogacenie kasety sgRNA (i eliminacja przeniesienia gDNA)

  1. Trawienie enzymem restrykcyjnym
    1. Strawić maksymalnie 5 μg gDNA z 20 μg enzymu/s (np. dla leniGuide-puro backbone dla biblioteki Brunello Kinome 1 użyj kombinacji NdeI i PspXI) w łącznej objętości 50 μL. Skaluj liczbę reakcji, aby osiągnąć pożądaną reprezentatywność sgRNA.
      UWAGA: Wybierz enzymy restrykcyjne do cięcia w okolicach kasety, ale pamiętaj, że niektóre z sgRNA mogą zawierać miejsce restrykcji. Te sgRNA zostaną utracone w tym etapie i nie pojawią się w sekwencjoningu. Brak tego przewodnika służy jako kontrola trawienia. Tabela uzupełniająca 1 przedstawia listę sgRNA Kinome 1, które są rozszczepiane przez PspXI i NdeI.
    2. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
    3. Wykonaj 2x czyszczenie SPRI.
      1. Przygotuj 10 mL Buforu Elution Buffer (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) oraz 50 mL świeżego etanolu 70%.
      2. Rozwiń kulki i dodaj 100 μL do produktu trawienia.
      3. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 5 minut. Magnetyzuj przez kolejne 5 minut.
      4. Podczas pracy na magnesie dodaj 200 μL 70% etanolu, nie naruszając granulki. Poczekaj 30 sekund, potem odrzuć supernatant.
      5. Powtórz krok 4.1.3.3, co daje łącznie 2 prania. Pozwól koralikom wyschnąć przez 2 minuty.
      6. Usuń z magnesu, dodaj 40 μL bufora elucijnego i ponownie zawiesij kulki przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty.
      7. Namagnesuj przez 2 minuty i przelej supernatant do nowej lampy.
        UWAGA: Podczas pierwszego uruchamiania tego protokołu należy zweryfikować trawienie za pomocą elektroforezy (kapilarnej). Upewnij się, że rozmaz jest obserwowany.
  2. Pulldown kasety sgRNA.
    1. Przygotowanie magnetycznych kulek streptawidyny.
      1. Przygotuj bufor mycia/wiązania 2x: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Rozcieńcz połowę objętości H2O do 1x.
      2. Wiruj koraliki przez 1 minutę.
      3. Przelej pożądaną objętość kulek do tubki (zazwyczaj wystarczy 1 mg), dodaj równą ilość Wash/Binding Buffer 1x, czyli co najmniej 1 mL, i ponownie zawiesij.
      4. Umieść rurkę na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant.
      5. Usuń tubkę z magnesu i ponownie zawiesz umyte koraliki w tej samej objętości 1x buforu mycia/wiązania, co początkowa objętość koralików pobranych z fiolki.
      6. Powtarzam to łącznie 3 prania.
      7. Ponownie zawiesij kulki w 2x Wash/Binding Buffer.
    2. Dodaj 5 μL 10 μM sprężyn pulldown wymienionych w Tabeli 1 do oczyszczonego trawienia od kroku 4.1.3.6.
    3. Inkubuj w suchej kąpieli w 96 °C przez 5 minut, a następnie natychmiast umroź na 5 minut.
    4. Dodaj 1 mg wcześniej umytych peralekt magnetycznych streptawidyny.
      UWAGA: Wiązanie biotyny-streptawidyny działa najlepiej przy 1 M NaCl. Upewnij się, że mieszasz równe ilości koralików i biotinylowanego DNA.
    5. Inkubuj przez 20 minut, zawieszając mieszankę co 4 minuty.
    6. Magnetyzuj przez 5 minut.
    7. Umyj kulki 3 razy z 1× buforem Wash/Binding.
    8. Ponownie zawiesij kulki w 50 μL EB 8.0.
      UWAGA: Kasety sgRNA użyte tutaj są związane z kulkami streptawidyny. Nie wyrzucaj ich.

5. przygotowanie biblioteki sgRNA

  1. PCR1
    1. Przygotuj mieszankę PCR1 z 20 μL buforu Herculazy 5x, 1 μL dNTP (100 mM), 1 μL polimerazy DNA, 2,5 μL 10 μM zapalników PCR1 do przodu i do tyłu wymienionych w Tabeli 1 oraz 23 μL wody o jakości PCR. Pipety mieszają i dodają mieszankę PCR1 do kulek od kroku 4.2.8.
      UWAGA: Tabela 1 zawiera podkłady PCR1 zaprojektowane dla Brunello Kinome Library 1.
    2. Umieść lampy w termocyklerze i uruchom program dla PCR1 opisany w Tabeli 2.
      UWAGA: Upewnij się, że termocykler może wykonywać reakcje 100 μL. W przeciwnym razie aliquot w reakcjach 50 μL. Skaluj w razie potrzeby.
    3. Zgrupuj wszystkie PCR1 z tych samych próbek w jednej probówce.
    4. Czyszczenie PCR1 SPRI przy użyciu 150 μL (1,5x) kulek (postępuj zgodnie z krokami 4.1.3.3-4.1.3.7). Każdą reakcję PCR ponownie zawiesić w 100 μL EB 8.0.
      UWAGA: Jeśli zakładasz ten protokół po raz pierwszy, zweryfikowaj rozmiar i jakość produktu PCR, uruchamiając 2 μL produktu PCR 30-cyklowego w systemie kapilarnej elektroforezy (np. systemy TapeStation firmy Agilent).
  2. PCR2
    1. Przygotować mieszankę PCR2 z 10 μL iloczynu PCR1, 10 μL buforu 5X, 0,5 μL dNTP (100 mM), 1 μL polimerazy DNA, 1,25 μL 10 μM zapalników PCR2 wymienionych w Tabeli 1 (dla każdej próbki używaj innej kombinacji rP7-i7-BC i P5-i5-BC), oraz 26 μL wody o jakości PCR, co daje łączną objętość 50 μL.
      UWAGA: Aby utrzymać reprezentację biblioteki, wykonaj jedną reakcję PCR2 na każde 10–4 konstrukty w bibliotece.
    2. Umieść lampy w termocyklerze i uruchom program dla PCR2 opisany w Tabeli 2.
    3. Czyszczenie PCR2 SPRI przy użyciu 75 μL (1,5x) kulek (postępuj zgodnie z krokami 4.1.3.3-4.1.3.7). Każdą reakcję PCR ponownie zawiesić w 50 μL EB 8.0.
  3. Ilościowo określ PCR2 (czyli bibliotekę sgRNA) za pomocą zestawu dsDNA do kwantyfikacji i zweryfikowaj rozmiar amplikonu za pomocą kapilarnej elektroforezy (np. systemy TapeStation). Zbierz próbki.
  4. Sekwencja na instrumencie Illumina.
    UWAGA: Dla biblioteki 3052 sgRNA Brunello Kinome 1 tutaj głębokość sekwencjonowania 100-200 milionów odczytów na próbkę zazwyczaj wystarcza.

6. Analiza

  1. Demultipleksowanie próbek za pomocą bcl2fastq.
  2. Sprawdź jakość plików fastq generowanych za pomocą FastQC.
  3. Wyodrębnij sekwencję sgRNA, używając jako wzoru sekwencje kasetowe flankujące sgRNA oraz długość przewodnika (20 nt).
  4. Wyrównaj sekwencję wyodrębnioną z referencją biblioteki za pomocą Bowtie2, aby sprawdzić, ile z hipotetycznych przewodników to autentyczne sgRNA z biblioteki. Użyj samtools, aby przekonwertować plik SAM z informacjami o wyrównaniu na format BAM i wygenerować pliki podsumowujące.
  5. Licz i normalizuj liczbę odczytów dla każdego sgRNA w edytowanych i kontrolnych próbkach za pomocą funkcji liczenia z oprogramowania MAGecK.
  6. Porównaj liczby z funkcją testową MAGecK, aby uzyskać wyniki RRA oraz listę genów kandydatów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano w sekcji protokołu, komórki CAR T zostały wygenerowane zgodnie z naszym ustalonym protokołem26. Do badań CRISPR dostosowaliśmy workflow opracowany przez Wanga i in.17 (Rysunek 1A). Krótko mówiąc, limfocyty T od dwóch niezależnych dawców zostały wyizolowane i aktywowane przez 24 godziny przed kolejną transdukcją zarówno za pomocą biblioteki CRISPR sgRNA, jak i lentiwirusowego wektora CAR, osiągając 67 i 72% komórek CAR dodatnich w 5. dniu. Część komórek została nukleofektowana białkiem Cas9 w celu wywołania knockoutów, podczas gdy pozostałe komórki służyły jako punkt odniesienia dla reprezentacji sgRNA. Komórki transdukowane zostały wybrane antybiotykami, a następnie posegregowano różne populacje według badanych fenotypów. Proliferacja komórek T CAR była monitorowana w całym przesiewowym testie za pomocą liczenia komórek opartych na AOPI i wyrażana jako zmiana fałdów (Rysunek 1B). Po suplementacji puromycyną w dniach 8, 10 i 12 potwierdziliśmy pomyślne wzbogacenie komórek CAR T przetworzonych za pomocą biblioteki CRISPR u obu dawców, co potwierdza dalsze przeżywalność i proliferacja. Nieprzekształcone limfocyty T (UTD) oraz CAR T bez transdukcji biblioteki CRISPR zostały użyte jako kontrolne przy selekcji antybiotykowej.

Po ekstrakcji genomowej DNA biblioteki sgRNA zostały przygotowane za pomocą amplifikacji PCR. Aby przezwyciężyć problemy wynikające z nadmiernego przenoszenia gDNA, wdrożyliśmy protokół obejmujący trawienie enzymów restrykcyjnych oraz pulldown kasety sgRNA z biotyną i streptawidyną (Rysunek 2A,B). gDNA zostało przystrawione za pomocą enzymów restrykcyjnych NdeI i PspXI celujących w miejsca celujące po obu stronach kasety sgRNA (Rysunek 2C). Biotinylowane oligo, zaprojektowane do wiązania przed miejscami wyżarzania primerów PCR1, były używane do wychwytywania fragmentów kaset sgRNA, a następnie ściągane w dół za pomocą kropelek streptawidyny w celu eliminacji przekazywanego gDNA. Fragmenty zawierające sgRNA były następnie selektywnie amplifikowane (rysunek 2D) i indeksowane przez dwa kolejne PCR.

Biblioteki z każdej próbki były sekwencjonowane za pomocą Next Generation Sequencing (NGS). Po demultipleksowaniu, kontroli jakości i identyfikacji sgRNA dane zostały przeanalizowane za pomocą pipeline'u MAGeCK. Po pierwsze, polecenie liczenia kwantyfikowało i znormalizowało liczby odczytów sgRNA w próbkach kontrolnych (bazalnych) i edytowanych przez Cas9 (Rysunek 3A,B). Korelacje Pearsona i Spearmana wskazują, że reprezentatywność sgRNA została zachowana podczas eksperymentu (dawca gDNA) w porównaniu z biblioteką plazmidową (rysunek 3C). Następnie komenda testowa porównała oba warunki, przypisując każdemu genowi solidne wyniki agregacji rankingów (RRA) (rysunek 3D). Istotnie wzbogacone lub wyczerpane geny zidentyfikowano przy użyciu progów p < 0,05 oraz log fold change (LFC) > 0,5 (Rysunek 3E). Na koniec przeprowadzono analizę wzbogacenia szlaków genów kandydatów za pomocą Metascape, ujawniając najlepsze terminy ontologii genowej związane z zidentyfikowanymi regulatorami (rysunek 3F).

figure-results-1
Rysunek 1: Przesiewowe badania CRISPR w komórkach CAR T. (A) Schemat przesiewania CRISPR w komórkach CAR T. (B) Selekcja komórek transdukowanych z puromycyną (P). Biblioteki plazmidowe obejmują gen oporności na puromycynę dla selekcji pozytywnej. Antybiotyk został dodany 8. dnia do podłoża w nietransdukowanych próbkach komórek T nieprzekształconych (UTD) i CAR oraz transdukowanych limfocytów CAR T. Próbki bez puromycyny były stosowane jako środek kontrolny proliferacji. Przedstawiono dane od dwóch niezależnych darczyńców. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Przygotowanie biblioteki do analizy wzbogacania sgRNA. (A) Schemat protokołu przygotowania biblioteki. (B) Schemat względnej lokalizacji rozmiarów cięcia enzymu restrykcyjnego (nożyczek) oraz obszarów wyżarzających sprymaczy PCR1 (strzałka) i biotynylowanych sprężyn (strzałka z zieloną kropką). (C) Elektroforeza gDNA przed i po trawieniu RE. (D) Selektywne wzbogacenie kaset sgRNA po PCR1. Przedstawiono dane od dwóch niezależnych dawców z próbek bazalnych i Cas9 obu fenotypów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Prowadź analizę wzbogacenia za pomocą MAGeCK. (A) Podsumowanie wyników funkcji liczenia MAGeCK. (B) Rozkład liczby odczytów. (C) Współczynniki Pearsona i Spearmana do korelacji między gDNA dawcy a liczbą bibliotek plazmidów. (D) Potencjalnie wzbogacone/wyczerpane geny uszeregowane według zmodyfikowanej agregacji stabilnej rankingowej (wynik RRA). (E) Wykres wulkanu pokazujący istotne geny (wartość p < 0,05, LFC > 0,5) na czerwono. (F) Terminy z Ontologii Genów (GO) po analizie szlaków Metascape wzbogaconych istotnych genów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Sekwencja zapalników. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Warunki PCR. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Lista sgRNA w bibliotece Kinome 1 oraz sgRNA utraconych podczas trawienia za pomocą NdeI i PspXI. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Screening CRISPR opiera się na zasadzie perturbacji pojedynczego przewodnika, co oznacza, że na komórkę należy integrować tylko jedno sgRNA. Aby to osiągnąć, sgRNA są zazwyczaj dostarczane za pomocą wektorów lentiwirusowych, a wielokrotność zakażeń (MOI) musi być starannie kontrolowana. A MOI ca. Zalecane jest stężenie 0,3, co skutkuje transdukcją od 25% do 30% komórek pojedynczą cząstką wirusa6. Dokładna miareczka jest zatem niezbędna do określenia objętości potrzebnych cząstek wirusa. Kolejnym kluczowym krokiem jest utrata pokrycia sgRNA podczas protokołu. Utrata komórek podczas pobierania, nieefektywności podczas ekstrakcji gDNA (czyli przeciążenie kolumny i niepełne wydzielanie DNA) lub nadmierna utrata podczas amplifikacji PCR mogą przyczyniać się do tej utraty, co zniekształca naszą analizę sgRNA. Jeśli chodzi o biotinylowane oligo, najlepiej jest je oczyścić HPLC, aby zapobiec nasyceniu kulek streptawidyny przez wolną biotynę używaną w syntezie. Ponadto zaleca się stosowanie amino-modyfikatora 3' w celu zapobiegania amplifikacji przez biotinylowane primery w kolejnych testach PCR. Ponadto, projektując te oligometryki, unikaj nakładania się z zapalnikami PCR1, aby zapobiec konkurencji podczas amplifikacji. Ponadto analiza bioinformatyczna wymaga szczególnej uwagi: wzorce ekstrakcji sgRNA zależą od szkieletu plazmidu (np. lentiGuide-puro lub lentiCRISPR v2), a rygorystyczne dopasowanie może wahać się od dokładnego dopasowania do pewnej tolerancji niedopasowania. Ponadto, ponieważ protokół ten zawiera etap trawienia, niektóre sgRNA zawierające miejsca restrykcyjne mogą zostać utracone, co wymaga dostosowania biblioteki referencyjnej.

W tym badaniu proponujemy zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki przesiewowej CRISPR, który wzbogaca fragmenty zawierające sgRNA poprzez trawienie, a co ważniejsze, poprzez proces pulldown. Trawienie enzymów restrykcyjnych było wcześniej sugerowane jako strategia redukcji wpływu gDNA i wzbogacenia dla kaset sgRNA27. Podobnie, sondy biotynylowane były szeroko stosowane w biologii molekularnej do wykrywania specyficznych kwasów nukleinowych lub kompleksów białko-nukleinowych 28,29,30,31.

Nasz protokół opiera się na tych zasadach i dostosowuje je do przesiewowego badania CRISPR w pierwotnych komórkach CAR T, choć należy uwzględnić kilka ograniczeń. Po pierwsze, pierwotne komórki CAR T nakładają ograniczenia na skalę przesiewania, ponieważ ich zdolność ekspansji jest ograniczona. Aby utrzymać odpowiednią pokrywę i reprezentację sgRNA, potrzebna jest duża liczba komórek startowych. Gdy nie jest to możliwe, można użyć mniejszych bibliotek niestandardowych12, choć ogranicza to zakres badań genetycznych. Zmienność biologiczna to kolejne wyzwanie; Różnice między dawcami są spodziewane, a nakładanie się znaczących trafień jest często niewielkie17. Po drugie, strategia wzbogacania opiera się na obecności i położeniu miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych. W rzadkich przypadkach takie miejsca mogą występować w sekwencjach sgRNA, co jest bardziej problematyczne dla małych bibliotek o ograniczonej redundancji. Jednak większość bibliotek, szczególnie tych obejmujących cały genom, zawiera wiele sgRNA na cel, minimalizując ogólny wpływ utraty przewodnika. Wreszcie, alternatywne strategie wzbogacania oparte na fragmentacji, takie jak sonakacja połączona z przechwytywaniem sondy24, mogą zapewnić pewną elastyczność w przypadkach, gdy trawienie enzymów restrykcyjnych nie jest odpowiednie.

Ogólnie kaseta sgRNA reprezentuje niewielką część całkowitego DNA genomowego w komórkach edytowanych przez CRISPR, co czyni efektywne wzbogacenie kluczowe dla pomyślnego przygotowania biblioteki. W porównaniu ze standardowymi protokołami, nasz zoptymalizowany workflow ogranicza przenoszenie gDNA i sprzyja amplifikacji PCR interesującego sgRNA. Chociaż połączenie fragmentacji gDNA i biotinylowanego pulldownu sondy z kulkami streptawidyny nie jest koncepcyjnie nowe, jego integracja z przesiewem CRISPR eliminuje typowe pułapki PCR i zwiększa powtarzalność ekranu CRISPR. Ponadto wprowadzenie standaryzowanych metryk kontroli jakości na każdym kluczowym etapie (takich jak czystość komórek T po sortowaniu, udział komórek opornych na puromycynę, integralność gDNA oraz efektywność transdukcji CAR) dodatkowo zwiększyłoby odporność i powtarzalność przepływu pracy. Podsumowując, choć opracowany w kontekście pierwotnych komórek CAR T i z udziałem tylko dwóch dawców (co może stanowić ograniczenie, choć użyto kilku próbek od każdego dawcy), ten zoptymalizowany protokół może być szeroko stosowany w innych badaniach CRISPR i workflowach NGS z dużym przenosem gDNA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez projekt PID2022-137914OB-I00 finansowany przez MICIU/AEI /10.13039/501100011033 oraz przez FEDER, UE. Badanie to zostało wsparte przez Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) poprzez Red de Terapias Avanzadas TERAV i TERAV+ (RD21/0017/0009 oraz RD24/0014/0010) oraz przez Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489). Badanie to zostało poparte przez Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 i GN2024/04) oraz Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 oraz 0011-1411-2023-000074). Rysunek 1B i Rysunek 2A zostały stworzone z BioRender.com

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4200 TapeStationAgilentG2991A
Acridine OrangeInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
autoMACS NEO SeparatorMiltenyi130-120-327Szybki magnetyczny sorter komórek
Biotynoylowane oligomorfozeIDT
BSASigmaA9647
Licznik fluorescencyjnych ogniw cellometru K2RevvityCMT-K2-MX-150Licznik ogniw fluorescencjonalnych
Komory liczące CHT4RevvityCHT4-SD100-002
Nanokulki CytoSinct CD4GenScriptL00863-1
Nanokulki CytoSinct CD8GenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
magnes DynaMag-2Invitrogen12321D
EDTA 0,5 M pH 8,0Invitrogen15575-038
EtanolMerck1,00,98,31,000
ExPERT Atx ElektroporatorMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 & micro; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Herculase Buffer 5XAgilent600675-52Bufor 5X
Enzym fuzyjny Herkulazy IIAgilent600679-51Polimeraza DNA
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
Bufor elektroporacyjny MaxCyteCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Tkanka nukleospinowaMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolibreneMerckTR-1003-6
SpłonyThermoFisher
Jod propidiumSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromycynaGibcoA11138-03
Qubit 3.0 FluorometrInvitrogenQ33216
Test DNA Qubit HSInvitrogenQ32851
Zespół do przetwarzania studni sterylnej R-50x3MaxCyteLM243882
T Cell TransAct HumanMiltenyi130-111-160Reagent stymulujący limfocyty T
Stacja taśmowa HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196Medium wzrostu limfocytów T
Tris Buffer, 1,0 M, pH 8,0, klasa biologii molekularnejEMD Milipore648314
Woda, dla biologii molekularnej, DNAse, RNAse i protease wolneThermoScientific327390010

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiew CRISPRedycja Cas9biblioteka sgRNAcytometria przep ywowaekstrakcja genomowego DNAtrawienie enzymami restrykcyjnymiwzbogacenie szlak wontologia gen w

Powiązane artykuły