Czy oporność teikoplaniny wykrywana przez zautomatyzowany system w szczepach Staphylococcus spp jest wiarygodna?

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj protokół oceniający niezawodność zautomatyzowanego systemu (VITEK 2) do określania podatności na teikoplaninę w izolatach gronkowca na podstawie porównania z mikrorozcieńczeniem bulionu (BMD), z zastosowaniami w potwierdzaniu oporności i wyznaczaniu odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej.

Streszczenie

W tym badaniu uwzględniono łącznie 467 izolatów gronkowca aureusa (S. aureus) oraz 66 izolatów gronkowca Staphylococcus (CoNS) z koagulazy, zebranych między czerwcem 2022 a grudniem 2024 roku. Testy podatności na teikoplaninę przeprowadzono przy użyciu automatycznego systemu testowania podatności na antybaktery, mikrorozcieńczenia bulionu (BMD) oraz metody testów gradientowych. Oporność na metycylinę wykryto w 71,7% izolatów S. aureus oraz we wszystkich izolatach CoNS. W tym badaniu 13 izolatów S. aureus oraz 4 izolatów CoNS zostało zidentyfikowanych jako odporne na teikoplanynę za pomocą automatycznego systemu testowania podatności. Wszystkie 13 izolatów S. aureus wykazało wrażliwość na teikoplaninę zarówno przez test gradientowy, jak i BMD. Wszystkie cztery izolaty CoNS zostały zidentyfikowane jako podatne na wpływy testu gradientowego, podczas gdy BMD sklasyfikowało dwa izolaty jako podatne i dwa jako oporne. Oporność na teikoplaninę wykryto w czterech szczepach [S. capitis (n = 1) i S. haemolyticus (n = 3)] wśród izolatów CoNS przez BMD. Cztery szczepy CoNS oporne na teikoplaninę zidentyfikowane przez BMD zostały wyizolowane z posiew krwi; trzy pozyskano od pacjentów pediatrycznych, a jeden od pacjenta dorosłego. Ogólnie odsetek S. aureus (MRSA) oporny na metycylinę był stosunkowo wysoki w badaniu, a wszystkie izolaty CoNS były odporne na metycylinę. Ponadto stwierdzono, że zautomatyzowane systemy są niewiarygodne w określaniu oporności teikoplaninowej, a izolaty zidentyfikowane jako oporne powinny być potwierdzane przez BMD. Biorąc pod uwagę, że teikoplanina jest antybiotykiem ostatniej szansy stosowanym w leczeniu patogenów takich jak MRSA i CoNS oporny na metycylinę, jej podatność należy uważnie monitorować.

Wprowadzenie

Gronkowec aureus (S. aureus) jest jednym z najbardziej klinicznie istotnych gatunków gronkowca ze względu na szeroki zakres czynników zjadliwości oraz zdolność do wywoływania poważnych infekcji w różnych tkankach i narządach. Odpowiada za infekcje skóry i tkanek miękkich, głębokie, dróg oddechowych, dróg moczowych oraz infekcje krwiobiegu i pozostaje jednym z najważniejszych patogenów w szpitalach ^1,2. W szczególności S. aureus (MRSA) oporny na metycylinę jest główną przyczyną zakażeń związanych z opieką zdrowotną na całym świecie i nadal jest główną przyczyną zakażeń ran pooperacyjnych ^2,3. Gronkowce koagulazowo-ujemne (CoNS), choć są częścią normalnej flory skóry, w ostatnich latach coraz częściej są powiązane zarówno z infekcjami miejscowymi, jak i ogólnoustrojowymi. Ten wzrost doprowadził do częstszych testów podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, a w konsekwencji do zwiększenia wykrywania oporności na antybiotyki glikopepeptydowe, takie jak teikoplanina⁴.

Ponieważ szczepy S. aureus i CoNS często wykazują oporność na antybiotyki β-laktamowe, antybiotyki glikopeptydowedowe, głównie wankomycyna i teikoplanina, są szeroko stosowane w leczeniu tych infekcji5. Rosnąca częstość opornych Gram-dodatnich patogenów nozokomialnych doprowadziła do rozszerzenia stosowania glikopeptydów, co przyczyniło się do zmniejszenia podatności bakterii na te czynniki ^5,6. Wankomycyna i teikoplanina mają porównywalną skuteczność przeciwdrobnoustrojową; Jednak wiele badań wykazało, że teikoplanina wiąże się z mniejszą liczbą działań niepożądanych, szczególnie ze zmniejszoną nefrotoksycznością ^7,8. Dlatego teikoplanina jest często uważana za odpowiednią alternatywę dla wankomycyny w określonych grupach pacjentów, w tym u osób z neutropenią, bakteriemią lub zaburzeniami funkcji nerek ^9,10.

Szybkie i dokładne określenie podatności na glikopeptydy jest ważne ze względu na powszechne stosowanie tych środków w infekcjach gronkowcem odpornym na metycylinę oraz rosnące zgłoszenia szczepów opornych na glikopeptydy¹¹. Dostępnych jest kilka metod laboratoryjnych oceny podatności na glikopeptydy u gatunków gronkowców, w tym rozcieńczenie agaru, testy gradientowe, mikrorozcieńczenie bulionu (BMD) oraz zautomatyzowane systemy testowania podatności na antybakteryje⁵. Wcześniejsze badania wykazały rozbieżności między zautomatyzowanymi systemami a metodami referencyjnymi w wykrywaniu zmniejszonej podatności lub oporności na glikopeptydy, szczególnie teikoplaninę, u gronkowca gatunku ^4,11.

Niniejsze badanie miało na celu ocenę wiarygodności automatycznego systemu testowania podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe do określania wrażliwości na teikoplaninę w izolatach gronkowca Staphylococcus , w porównaniu z metodą mikrorozcieńczania bulionu, standardem referencyjnym. Ocena charakterystyki wydajności zautomatyzowanego systemu może pomóc laboratoriom klinicznym ocenić jego przydatność do rutynowego wykrywania podatności na glikopeptydy w praktyce klinicznej.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyki 27 stycznia 2025 roku (numer protokołu: HRU/25.02.03). Badanie przeprowadzono zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

1. Projekt badania

To retrospektywne badanie oceniało skuteczność zautomatyzowanego systemu testowania podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe w określaniu podatności na teikoplaninę u gatunków gronkowców , porównując wyniki z referencyjną metodą mikrorozcieńczenia bulionu (BMD) oraz metodą testu gradientowego.

2. Selekcja izolatów

1. Zbiór izolatów klinicznych
   1. Obejmuje łącznie 467 izolatów S. aureus oraz 66 koagulazowo-ujemnych izolatów gronkowca (CoNS) pobranych z różnych próbek klinicznych między czerwcem 2022 a grudniem 2024.
   2. Przetwarzanie wszystkich próbek klinicznych zgodnie z rutynowymi procedurami mikrobiologicznymi w laboratorium diagnostycznym.
   3. W analizie należy uwzględnić tylko jeden izolat na pacjenta. Wyklucz powtarzające się izolaty uzyskane z różnych próbek tego samego pacjenta.
2. Początkowa identyfikacja i przesiew
   1. Identyfikacja wszystkich izolatów na poziomie gatunkowym za pomocą macierzowej spektrometrii masowej wspomaganej laserowej desorpcją i czasu lotu (MALDI-TOF MS).
   2. Testuj S. aureus i CoNS izolowane pod kątem oporności na metycylinę i teikoplaniny za pomocą kart VITEK 2 AST-P664 z automatycznym systemem testowania podatności.
   3. Zapisz wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) wygenerowane przez zautomatyzowany system testów podatności do dalszego porównania.
3. Przechowywanie izolowane i subkultura
   1. Izolaty przechowywane w temperaturze −80 °C w tryptycznym bulionie sojowym z dodatkiem 20% glicerolu według automatycznego systemu testowania podatności.
   2. Przed testami referencyjnymi rozmraża izolowane w temperaturze pokojowej i podwójnie podhoduje je na agarze z krwi owiec o stężeniu 5%.
   3. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny po każdym przejściu, aby zapewnić czystość i żywotność.

3. Testy podatności na antybakterium

1. Mikrorozcieńczenie bulionu (BMD)
   1. Przygotowanie roztworów teikoplaniny
      1. Przygotuj roztwór zapasowy proszku teikoplaniny w stężeniu 2560 mg/L w bulionie Mueller-Hinton (CAMHB) dostosowanym do kationów.
   2. Procedura mikrorozcieńczania bulionu
      1. Wykonaj testy mikrorozcieńczenia bulionu przy użyciu sterylnych mikropłyt z 96 dołkami na dnie U.
      2. Do każdego dołku należy wydać 100 μL CAMHB. Rozcieńcz roztwór teikoplaniny dziesięciokrotnie i dodaj 100 μL do pierwszego dołku.
      3. Przygotuj podwójne rozcieńczenia seryjne w odwiertach 1–10, aby uzyskać końcowe stężenia antybiotyku w zakresie od 64 do 0,125 μg/mL.
      4. Użyj dołka 11 jako środka kontroli wzrostu zawierającego CAMHB i szczepionkę bakteryjną. Użyj studni 12 jako kontroli ujemnej zawierającej tylko CAMHB¹².
   3. Przygotowanie inokulum i inkubacja
      1. Zawiesz czyste kolonie bakteryjne w sterylnej soli fizjologicznej i dostosuj zawiesinę do mętności odpowiadającej standardowi McFarlanda 0,5.
      2. Przygotuj rozcieńczenie 1:100 w CAMHB i dodaj 100 μL zawiesiny bakteryjnej do studni 1–11, aby uzyskać końcowe stężenie inokulum około 5 ×^10,5 CFU/mL.
      3. Inkubować mikropłytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w warunkach atmosferycznych¹².
   4. Określenie i interpretacja MIC
      1. Zdefiniuj minimalne stężenie hamujące (MIC) jako najniższe stężenie teikoplaniny, które całkowicie hamuje widoczny wzrost bakterii po inkubacji.
      2. Interpretuj wartości MIC zgodnie z wytycznymi Europejskiego Komitetu ds. Testów Wrażliwości Przeciwdrobnoustrojowych (EUCAST) wersja 14.0¹³.

4. Kontrola jakości

1. Stosuj Staphylococcus aureus ATCC 29213, z zakresem referencyjnym MIC teicoplaninu 0,25–1 mg/L, jako szczep kontroli jakości.

5. Analiza statystyczna

1. Porównanie metod
   1. Porównaj wyniki MIC teikoplaniny uzyskane za pomocą zautomatyzowanego systemu testowania podatności z tymi uzyskanymi metodą referencyjną BMD.
   2. Zdefiniuj zgodność kategoryczną (CA) jako zgodne, podatne lub oporne wyniki między tymi dwiema metodami.
2. Klasyfikacja błędu
   1. Zdefiniuj bardzo poważne błędy (VME) jako izolaty sklasyfikowane jako podatne na zautomatyzowany system testów podatności, ale odporne na BMD.
   2. Zdefiniuj błędy główne (ME) jako izolaty sklasyfikowane jako odporne przez zautomatyzowany system testów podatności, ale podatne na BMD.
3. Kryteria wydajności
   1. Uznajmy wyniki metody za akceptowalne, gdy zgodność kategorycznych wynosi ≥90%, a wskaźniki VME i ME to ≤3%, zgodnie z opublikowanymi kryteriami oceny^14,15.

Wyniki

Do analizy uwzględniono łącznie 533 izolatów odzyskanych z próbek klinicznych w okresie 2,5 roku. Wszystkie izolaty CoNS (MR-CoNS) oporne na metycylinę oraz 71,7% izolatów S. aureus wykazały oporność na metycylinę. Próbki wymazu z rany były najczęstszymi próbkami klinicznymi zawierającymi izolaty S. aureus , podczas gdy izolaty MR-CoNS najczęściej pozyskiwano z posiew krwi (Rysunek 1).

Dyskusja

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe jest jednym z najważniejszych zagrożeń dla globalnego zdrowia publicznego, przyczyniając się do wzrostu kosztów opieki zdrowotnej, niepowodzenia leczenia i śmiertelności³. Częstość zakażeń zarówno w społeczności, jak i szpitalnych wywołanych przez Staphylococcus aureus nadal rośnie na poziomie krajowym i globalnym. Oporność na metycylinę, w szczególności, wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością; dlatego profile oporu są rutynowo ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion Muellera Hintona skorygowany kationami	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy	CM0405B	Dla wzrostu bakterii w metodzie mikrorozcieńczania bulionu
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMé Rieux, Francja	410893	Do identyfikacji bakterii
Standard McFarlanda	bioMé Rieux, Francja	95060-958	Standaryzacja szczepienia bakteryjnego
Szalki Petriego	RTA, Tü rkiye	2102	Do przygotowania podłoża i uprawy bakterii
Końcówka Pippette 20 - 200 i mu; L	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy	Z740105	Dla rozkładu skorygowanego o kationy Mueller– Bulion Hinton (CAMHB) do mikropłyt z dnem U i przygotowanie seryjnego rozcieńczenia
Agar z krwi owczej	RTA, Tü rkiye	2001	Izolacja i hodowla mikroorganizmów
Staphylococcus aureus	Kolekcja Amerykańskiej Kultury Typowej	29213	Referencyjne odkształcenie użyte w tym badaniu
Proszek teikoplaninowy	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy	T0578	Antybiotyki
Tryptyczny bulion sojowy	Merck, Niemcy	1,054,590,500	Izolacja i hodowla mikroorganizmów
Płyta dolna studni U	Thermo Fisher Scientific	163320	Do testów podatności na substancje przeciwdrobnoustrojowe metodą mikrorozcieńczania bulionu
VITEK 2 karty AST-P664	bioMé Rieux, Francja	414197	Do testów podatności na antybakteryje
VITEK2 Compact	bioMé Rieux, Francja	4700030	Do testów podatności na antybakteryje