Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Podsumowanie

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Streszczenie

Perycyty, jako kluczowy komponent jednostki neuronaczyniowej, odgrywają istotną rolę w utrzymaniu integralności bariery krew-mózg i regulacji homeostazy hemodynamicznej mózgu poprzez modulacje tonusu mikrokrążenia. Dysfunkcja perycytów została związana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi. Aby zbadać heterogeniczność perycytów i wyjaśnić ich mechanizmy w chorobach neuronaczyniowych na poziomie pojedynczych komórek, opracowałyśmy zoptymalizowany i powtarzalny protokół izolacji perycytów mózgowych myszy, nadający się do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq). Metoda ta opiera się na ustalonej strategii sortowania CD13⁺/CD31^-, ale zawiera kluczowe ulepszenia dostosowane specjalnie do zastosowań scRNA-seq. W skrócie, mózgi zostały zebrane z trzech dorosłych myszy C57BL/6. Tkanki mózgowe zostały mechanicznie rozdrobnione i poddane enzymatycznej dysocjacji, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Po sekwencyjnej wirowanianiu końcowy pelet komórek został resuspendowany w 20% roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA), co jest kluczowy krokiem, który wprowadziliśmy, aby zminimalizować stres i agregację, a tym samym maksymalizować żywotność i jakość RNA do sekwencjonowania. Zatem zoptymalizowane podejście oparte na FACS umożliwia trwałe izolację żywych perycytów mózgowych myszy spełniających rygorystyczne wymagania dla scRNA-seq, oferując potężne narzędzie do analizy heterogeniczności perycytów i ich patologicznych ról w chorobach neuronaczyniowych.

Wprowadzenie

Perycyty są ważnym typem komórek zlokalizowanych wzdłuż mikronaczyń, zazwyczaj osadzone w błonie podstawnej naczyń włosowatych i otulają komórki śródbłonka¹. W mózgu perycyty, razem z komórkami śródbłonka, astrocytami i innymi typami komórek, tworzą jednostkę neurovaskularną i są integralne dla struktury i funkcji bariery krew-mózg (BBB). Perycyty odgrywają zasadniczą rolę w regulacji przepływu krwi mózgowej, remodelacji naczyń i utrzymaniu homeostazy naczyniowej. Zachowują integralność BBB poprzez bliskie fizyczne interakcje i parakrynowe sygnałowanie z sąsiednimi komórkami²; dynamicznie regulują transport transendotelialny poprzez endocytozę i ekspresję specyficznych białek transporterów; i przyczyniają się do stabilności hemodynamicznej mózgu poprzez ich czynności kurczowe i rozkurczowe³. Dysfunkcja perycytów, jak również zmiany ich pokrycia lub gęstości, mogą prowadzić do dysregulacji naczyniowej i niedoborów neurologicznych, ostatecznie powodując patologiczne zmiany związane z różnymi zaburzeniami neurologicznymi⁴. Jednakże, właściwa heterogeniczność perycytów stanowi znaczne wyzwania dla dalszych badań mechanizmowych.

Wraz z rozwojem technologii sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), coraz więcej badań wykorzystuje scRNA-seq do eksploracji heterogeniczności komórkowej i identyfikacji kluczowych celów w patogenezie i progresji chorób. Powszechnie stosowane markery perycytów obejmują receptor PDGF beta (PDGFR-β)⁵, antygen neuron-glejowy 2 (NG2) i alfa-miozynę gładkomięśniową (α-SMA). Jednakże, te markery mają stosunkowo niską specyficzność⁶, ponieważ mogą jednocześnie oznaczyć inne komórki naczyniowe, takie jak komórki mięśni gładkich, i komórki przodkowe neuronów, jak komórki przodkowe oligodendrocytów, co utrudnia odróżnienie perycytów od innych komórek mózgowych. W poszukiwaniu bardziej odpornej alternatywy, zwróciliśmy się ku CD13 (Aminopeptydazie N, APN), markerowi szeroko rozpoznanemu za jego silną i konsekwentną ekspresję w perycytach naczyń krwionośnych w poprzednich badaniach^7,8,9,10. W naszym badaniu przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne na sekcjach tkanki mózgowej, a wyniki potwierdziły ekspresję CD13 w perycytach, demonstrując jego skuteczność w odróżnianiu perycytów od komórek śródbłonka, ponieważ sygnał CD13 był wyłącznie kojarzony z komórkami naczyniowymi i był nieobecny w komórkach śródbłonka CD31⁺. (Rysunek 1A). Jednakże, ważne jest, aby zauważyć, że ekspresja CD13 nie jest całkowicie ograniczona do perycytów; wykrywalne poziomy są również obserwowane w komórkach mięśni gładkich tętniczek i żyłek (Rysunek 1B,C).

Rysunek 1: Barwienie immunofluorescencyjne wykazuje ekspresję CD13 w perycytach naczyń krwionośnych mózgu i komórkach mięśni gładkich, bez wykrywalnego sygnału w komórkach śródbłonka. (A) Reprezentatywne obrazowanie immunofluorescencyjne strefy przejścia tętniczek-włosowatych w mikrokrążeniu mózgu. Złączone zdjęcie pokazuje perycyt CD13⁺ (zielony) otulający komórki śródbłonka CD31⁺ (czerwony). Komórki mięśni gładkich α-SMA⁺ (cyjan) zlokalizowanych są w regionie tętniczek i nieobecne w włosowatych. (B) Przekrój tętniczki. Obrazy demonstrują jasną ko-lokalizację perycytów CD13⁺ (zielony) i komórek mięśni gładkich α-SMA⁺ (cyjan) w otaczającej warstwie mięśniowej, potwierdzając ekspresję CD13 w komórkach mięśni gładkich tętniczek. (C) Przekrój żyłki. Podobnie, CD13 (zielony) jest wykrywalny w komórkach mięśni gładkich α-SMA (wskazówki strzałkami) ściany żyłki. Skala: 20 µm (A-C). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby uzyskać perycyty naczyń kory mózgowej myszy spełniające wymagania dla scRNA-seq, przeprowadziliśmy sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie (FACS) z wykorzystaniem oznaczenia przeciwciała CD13⁺/CD31^- do izolację perycytów¹¹. Początkowo, markery CD45 i CD41 zostały użyte do wykluczenia komórek krwiotwórczych z zawiesiny tkanki mózgowej¹². Następnie, perycyty zostały wzbogacone poprzez selekcję komórek CD13⁺, a komórki śródbłonka zostały dalsze wyłączone poprzez wybór populacji CD31^-,

Protokół

W tym badaniu użyto trzech dorosłych myszy C57BL/6J (w wieku 3 miesięcy, 20-25 g). Wszystkie myszy były trzymane w cyklu 12 godzinnym światło/ciemność, w ściśle kontrolowanej temperaturze i wilgotności, z wolnym dostępem do żywności i wody przed eksperymentami. Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi i Etyki Instytutu Mikrokrążenia Chińskiej Akademii Nauk Medycznych i Uniwersytetu Medycznego w Pekinie oraz przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie odczynników

1. 30% (wt/vol) Roztwór glukozy: Rozpuść 15 g glukozy w 50 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH₂O. Aby zapewnić całkowite rozpuszczenie, najpierw dodaj glukozę do 20 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH₂O i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj wodę UltraPure DNase/RNase-free dH₂O do objętości końcowej 50 mL. Przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
2. DNase I (10 mg/mL): Rozpuść 50 mg DNase I w 5 mL sterylnej wody ddH₂O. Roztwór mogą przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.
   UWAGA: Należy ściśle unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec utracie aktywności enzymatycznej. Aby zminimalizować wpływ zamrażania i rozmrażania, przed pierwszym zamrożeniem podziel 150 μL roztworu na sterylne probówki mikrowirówkowe i rozmrażaj pojedyncze alikwoty w miarę potrzeby na potrzeby eksperymentów.
3. 2% (vol/vol) Surowica płodowa bydlęca (FBS) w buforowanym roztworze fosforanowym (PBS): Przygotuj 1x PBS mieszając 5 mL 10x PBS z 45 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH₂O. Dodaj 1 mL FBS do 49 mL 1x PBS i dokładnie wymieszaj.
   UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo w czasie kroku 2.1.2. Przeznacz 15 mL na próbkę tkanki.
4. Roztwór enzymatyczny składnika mieszanego kolagenazy i dispazu (CD): Oddzielnie rozpuść 100 mg dispazu i 100 mg kolagenazy w 1 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH₂O. Połącz roztwory, aby uzyskać końcową objętość 2 mL (stężenie enzymatyczne 100 mg/mL).
   UWAGA: Podziel 500 μL na sterylne probówki mikrowirówkowe i przechowuj w temperaturze -20 °C. Przed użyciem wstrząśnij, aby uniknąć utraty aktywności związanej z wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem. Należy pamiętać, że forma proszku może powodować poważne podrażnienia skóry/oczu i zaburzenia oddychania. Zawsze obsługuj w wyciągu chemicznym, nosząc rękawice nitrylowe i maskę N95. W przypadku kontaktu natychmiast przepłucz obszar narażony obficie wodą i skontaktuj się z lekarzem.
5. Roztwór roboczy enzymatyczny CD: Wymieszaj 1,5 mL roztworu enzymatycznego CD z 43,5 mL 2% (vol/vol) FBS w PBS (z kroku 1.3) przez delikatne odwrócenie.
   UWAGA: Przygotuj bezpośrednio przed dysocjacją tkanki (krok 2.3.4). Ta objętość jest zoptymalizowana dla trzech myszy; dostosuj proporcjonalnie w razie potrzeby.
6. 22% (vol/vol) Roztwór Percoll: Połącz 11 mL Percoll, 5 mL 10x PBS i 34 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH₂O, aby przygotować 50 mL roztworu.
   UWAGA: Przefiltruj przez membranę PES o przepływie 0,22 μm. Można przechowywać w temperaturze 4 °C przez miesiąc bez znacznej utraty stabilności.
7. Bufor do mechanicznej dysocjacji: Dodaj 1 mL DNase I (10 mg/mL) do 10 mL 2% (vol/vol) FBS w PBS (z kroku 1.3). Mieszaj za pomocą pipety.
8. Roztwory BSA: Przygotuj oddzielnie 1%, 20% i 35% (wt/vol) roztwory BSA według poniższego schematu:
   1. 1% (wt/vol) BSA: Rozpuść 0,15 g BSA w 15 mL buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS).
   2. 20% (wt/vol) BSA: Rozpuść 3 g BSA w 15 mL DPBS.
   3. 35% (wt/vol) BSA: Rozpuść 0,7 g BSA w 2 mL DPBS.
      UWAGA: Przed użyciem przefiltruj wszystkie roztwory przez membranę PES o przepływie 0,22 μm.
9. Bufor HBSS/BSA/Glukoza: Dodaj 167 μL 30% (wt/vol) glukozy (z kroku 1.1) i 1,4 mL 35% (wt/vol) BSA (z kroku 1.8) do 50 mL HBSS, delikatnie wymieszaj.
   UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo w warunkach sterylnych w trakcie kroku 2.1.2. Przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
10. Bufor do zbierania tkanek: Uzupełnij 12 mL buforu HBSS/BSA/Glukoza (z kroku 1.9) o 800 μL DNase I (10 mg/mL). Używaj do tymczasowego przechowywania tkanek i spłukiwania pipet.
    UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo w warunkach sterylnych w trakcie kr

Wyniki

Aby osiągnąć precyzyjne izolację perycytów mózgu, komórki dysocjowane z tkanki mózgowej zostały zabarwione za pomocą PE Texas Red-konjugowanego przeciwciała przeciwko CD41/CD45 myszy, FITC-konjugowanego przeciwciała przeciwko CD13 myszy i APC-konjugowanego przeciwciała przeciwko CD31 myszy, co umożliwiło stosowanie wieloetapowej strategii sortowania integrującej markery powierzchniowe i wykrywanie żywotności (Rysunek 2). Wstępne bramy oparte na parametrach rozproszenia przedniego (FSC-A) i r...

Dyskusja

Niniejsze badanie opisuje systematycznie zoptymalizowaną i zweryfikowaną strategię FACS opartą na wielokolorowym oznakowaniu CD13⁺/CD31⁻ do bardzo wydajnego izolowania perycytów naczyń krwionośnych mózgu myszy²⁴. Analizy cytometryczne przepływowe i późniejsze analizy scRNA-seq potwierdziły, że metoda precyzyjnie rozróżnia perycyty od komórek śródbłonka i daje komórki, które konsekwentnie spełniają wszystkie kluczowe metryki kontroli jakości dla scRNA-seq, w tym żywotność, tempo skupiania się, stęż...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	Aliquot and store at -20°C; can be stored at 4°C for up to 1 week after thawing
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)	Life Technologies	70011-044	Dilute before use for cell washing
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	For preparing cell energy buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	Protects cells and prevents adhesion
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	For cell washing and resuspension
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977-015	For preparing nuclease-free reaction systems
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	For tissue digestion and cell dissociation; aliquot and store at -20°C
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	Prevents DNA aggregation; aliquot and store at -20°C
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	For cell separation; store at 4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	Fluorescent conjugate; store protected from light at 4°C for up to 1 month
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	Store protected from light at 4°C for several months
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	Store protected from light at 4°C for several months
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	Store protected from light at 4°C for several months
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	Fluorescence control; store protected from light at 4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	Store protected from light at 4°C for several months
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	Store protected from light at 4°C for several months
RNase AWAY Decontamination Reagent	Ambion	10328011	For eliminating RNase contamination
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Prevent non-specific antibody binding
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	For dead cell exclusion.
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	For the preparation of 1.25% (w/v) Tribromoethanol Solution
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	For the preparation of 1.25% (w/v) Tribromoethanol Solution
C57BL/6 mouse	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
cell cluture dish 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Single-Cell Sequencing Data Analysis Software
Loupe Cell Browser		4.1	Cell Browser
STAR		2.5.1b	RNA Alignment
irlbpy		-	Principal Component Analysis
tsne		0.15	Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) Analysis
k-means		0.17	K-Means Clustering
graph-based clustering		0.17	Graph-Based Clustering
FastQC		v0.11.2	Data Quality Control (QC)