Oś NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 reguluje polaryzację makrofagów i stan zapalny w modelach sepsy

Podsumowanie

Protokół ten integruje próbki kliniczne, hodowlane makrofagi oraz model myszy z podwiązywaniem i punkcją cekalu (CLP), aby zbadać, jak oś NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 reguluje polaryzację i stan zapalny makrofagów w sepsie, zapewniając krok po kroku wskazówki, które można dostosować do innych szlaków odpornościowych pośredniczonych przez lncRNA.

Streszczenie

Sepsa charakteryzuje się zaburzeniami odporności gospodarza i pozostaje główną przyczyną śmiertelności na całym świecie. Długie niekodujące RNA NEAT1 było powiązane z chorobami zapalnymi, jednak jego specyficzna rola w polaryzacji makrofagów podczas sepsy nie została w pełni zdefiniowana. Systematycznie analizujemy oś NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 na próbkach klinicznych, hodowanych makrofagach oraz modelu myszy CLP. Do potwierdzenia konkurencyjnej interakcji endogennego RNA (ceRNA) między NEAT1, miR-181a-5p i HMGB1 stosuje się eksperymenty z ilościowym PCR, western blotting, testy reportera z podwójną lucyferazą oraz RNA pull-down. Testy funkcjonalne, w tym immunofluorescencja, migracja przejścia oraz barwienie TUNEL (TUNEL) przez deoksynukleotydynazę dUTP (nick end) (TUNEL). In vivo, model CLP w połączeniu z ELISA i histopatologią potwierdza wpływ knockdownu NEAT1 na profile cytokin i uszkodzenia narządów. NEAT1 i HMGB1 są podwyższone, natomiast miR-181a-5p obniżone, u pacjentów z sepsą oraz u makrofagów stymulowanych lipopolisacharydami. Wyciszanie NEAT1 sprzyja polaryzacji makrofagów M2, zmniejsza liczbę cytokin prozapalnych, hamuje migrację makrofagów oraz łagodzi uszkodzenia tkanek u myszy septycznych za pomocą osi miR-181a-5p/HMGB1. Z naszej wiedzy jest to pierwszy zintegrowany protokół charakteryzujący obwód regulacyjny lncRNA-mikroRNA-HMGB1 w sepsie, stosując zharmonizowane podejścia kliniczne, in vitro oraz in vivo. Zapewnia ramy metodologiczne do celowania w sieci ceRNA powiązanych z NEAT1 jako potencjalnych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Sepsa definiowana jest jako zagrażająca życiu dysfunkcja narządów spowodowana zaburzeniami reakcji gospodarza na infekcję¹. Pomimo postępów w leczeniu klinicznym, śmiertelność pozostaje wysoka, a mechanizmy molekularne leżące u podstaw nierównowagi immunologicznej nie są w pełni poznane ^2,3. Wśród regulatorów odporności długie niekodujące RNA (lncRNA) wyłoniły się jako ważne modulatory sygnalizacji zapalnej i funkcji makrofagów ^4,5. NEAT1, jądrowy bogaty transkrypt, jest strukturalnym składnikiem paraplamek i został powiązany z odpowiedziami immunologicznymi oraz uszkodzeniami tkanek ^6,7. Wcześniejsze badania łączyły NEAT1 z zapaleniem jelit, niedokrwieniem/urazem reperfuzyjnym oraz ostrym zespołem niedogodności oddechowej ^8,9,10.

W kontekście sepsy narastające dowody wskazują, że lncRNA regulują polaryzację makrofagów i sygnalizację zapalną, wpływając tym samym na postęp choroby i wynik^11,12. Na przykład zgłoszono, że lncRNA KCNQ1OT1 i SNHG1 modulują uszkodzenia mięśnia sercowego wywołanego sepsą poprzez szlaki mikroRNA^13,14. Jednak nie zostało systematycznie zdefiniowane, czy NEAT1 reguluje polaryzację makrofagów poprzez oś miR-181a-5p/HMGB1 w sepsie. Aby wypełnić tę lukę, ustanowiliśmy protokół łączący próbki krwi pacjentów, makrofagi RAW264.7 stymulowane lipopolisacharydami oraz model podwiązania i nakłucia na myszy do analizy osi^NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1^. Korzystając z ilościowego PCR, western blottingu, testów reporterowych z podwójną lucyferazą, RNA pull-down oraz funkcjonalnych odczytów polaryzacji, migracji i apoptozy makrofagów M1/M2, protokół ten zapewnia powtarzalne ramy eksperymentalne definiujące NEAT1 jako regulatora funkcji makrofagów w sepsie oraz wspierające rozwój strategii ukierunkowanych na lncRNA^17,18.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem uczestników ludzkich zostały zatwierdzone przez Radę Etyczną Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Hebei (Zatwierdzenie nr HDFY-LL-2021-232). Pisemna świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich uczestników lub, jeśli dotyczy, od ich prawnych pełnomocników. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi regulacjami oraz zostały zatwierdzone przez tę samą komisję etyczną. Zatwierdzony protokół określał szczegóły procedury podwiązywania i nakłucia cekalu (CLP), podawania adenowiwirusów, schematu znieczulenia oraz humanitarnych punktów końcowych.

Pobieranie próbek przez pacjenta

Pacjenci z sepsą byli prospektywnie rekrutowani w Szpitalu Afiliowanym Uniwersytetu Hebei między lutym 2022 a lipcem 2024 roku. Łącznie 50 pacjentów spełniło kryteria włączenia, w tym 26 mężczyzn i 24 kobiety w wieku 24-69 lat (średnio 52,4 ± 10,2 lat). Sepsa została zdiagnozowana według kryteriów Sepsy-3, wymagających podejrzenia lub potwierdzenia infekcji oraz zwiększenia wyniku Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) o ≥ 2 punkty. Dla każdego pacjenta zarejestrowano pierwotne źródło infekcji (takie jak infekcje płuc, brzucha, dróg moczowych lub krwiobiegu) oraz nasilenie choroby (sepsa lub wstrząs septyczny), a rozkład wyników SOFA podsumowano, aby scharakteryzować obciążenie chorobą. Jako grupa kontrolna włączono 39 zdrowych osób bez klinicznych dowodów infekcji lub chorób zapalnych układowych (20 mężczyzn i 19 kobiet w wieku 26-70 lat, średnia 50,7 ± 11,0 lat), i nie stwierdzono istotnych różnic w wieku ani płci między grupami.

Krew żylna obwodowa była pobierana od pacjentów z sepsą przed rozpoczęciem leczenia specyficznego dla sepsy, gdy tylko było to możliwe. Krew (zazwyczaj 5-10 mL) była pobierana do rurek pokrytych kwasem etylendiaminetetraoctowym (EDTA) i delikatnie odwracana kilkakrotnie, aby wymieszać antykoagulant. Próbki zostały przetworzone w ciągu około godziny od pobrania. Plazma była pozyskiwana przez wirowanie w 1 500 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, alicytatowana do oznakowanych mikrorurek i przechowywana w -80 °C do kolejnych pomiarów cytokin. Do ekstrakcji RNA i białek izolowano z części tej samej próbki komórki monojądrowe krwi obwodowej (PBMC) za pomocą pośrednika separacyjnego o gęstości i gradientie, zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki były następnie dwukrotnie myte w PBS, liczone i przechowywane jako granulki komórkowe w temperaturze -80 °C.

Hodowla komórek i transfekcja

Komórki makrofagów myszy RAW264.7 były utrzymywane w medium RPMI-1640, uzupełnionym o 10% surowicę płodową z bydła inaktywowanego przez ciepło, 100 U/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%_CO2. Komórki były przechodzione skrobakiem komórek przed osiągnięciem nadzbiegu, aby zachować stabilny fenotyp.

Do transfekcji komórki RAW264.7 zostały zasiane w ilości 5 ×^{10 komórek na} dołek w płytkach 6-dołkowych w 2 mL kompletnego medium około 24 godzin przed ekspozycją na odczynniki. Gdy hodowle osiągały konfluencję 70-90%, kwasy nukleinowe (takie jak plazmidy ekspresyjne NEAT1 lub HMGB1, konstrukcje short-hairpin, mimiki lub inhibitory miR-181a-5p oraz odpowiadające im kontrole) były kompleksowane z lipidowym odczynnikiem transfekcyjnym w medium wolnym od surowicy zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj 2-3 μg plazmidowego DNA lub 50-100 pmol drobnego RNA mieszano z zalecaną objętością odczynnika, pozwalano na utworzenie kompleksów w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut, a następnie dodawano kroplami do komórek w medium wolnym od antybiotyków. Po 4-6 godzinach podłoże zostało zastąpione świeżym, kompletnym medium, a komórki inkubowano przez kolejne 24-48 godzin przed dalszymi badaniami.

Indukcja polaryzacji makrofagów

Aby wywołać polaryzację makrofagów zapalnych, komórki RAW264.7 mogły przylegać w płytkach 6-dołkowych przez co najmniej 4 godziny w pełnym nośniku. Następnie podłoże zastąpiono DMEM zawierającym 100 ng/mL lipopolisacharydów (LPS), a komórki inkubowano przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5%_CO2. Po stymulacji komórki były natychmiast przetwarzane pod kątem ekstrakcji RNA i białek, barwienia immunofluorescencji, testów migracji lub analizy apoptozy, w zależności od projektu eksperymentu.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Całkowite RNA było ekstrahowane z hodowanych komórek, PBMC lub tkanek myszy za pomocą odczynnika monofazowego na bazie fenol-guanidinu zgodnie ze standardowymi procedurami. Krótko mówiąc, próbki były lizowane w 1 mL odczynnika na 10^{6 komórek} lub 50-100 mg tkanki, inkubowane przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie energicznie mieszane z chloroformem (0,2 mL na 1 mL odczynnika). Po inkubacji trwającej 2-3 minuty lizaty były wirowane w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić fazy. Faza wodna została przeniesiona do nowej rurki, a RNA wytrącono z równą objętością izopropanolu. Mieszanka była następnie inkubowana przez około 10 minut, a następnie ponownie wirowana w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powstały pellet był myty etanolem 75%, wirowany w 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, krótko suszony na powietrzu i rozpuszczany w wodzie wolnej od RNazy. Stężenie i czystość RNA oceniono za pomocą spektrofotometrii UV, a do analiz końcowych użyto próbek o stosunku A₂₆₀/_{A 280} wynoszącym około 1,8-2,0. W razie potrzeby integralność weryfikowano za pomocą elektroforezy żelu agarozowego.

DNA komplementarne (cDNA) zostało zsyntetyzowane z całkowitego RNA przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do transkrypcji odwrotnej, zgodnie z instrukcjami producenta. Dla miR-181a-5p zastosowano zaległości zapalniki specyficzne dla genu lub pętlę pętlową. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym oraz odpowiedniej mieszanki głównej (takiej jak SYBR Green- lub chemia sondowa) w całkowitej objętości reakcji 20 μL zawierającej szablon cDNA oraz 0,2-0,4 μM każdego startera. Typowe warunki cykliczne obejmowały początkową denaturację w 95 °C przez 3 minuty, następnie 40 cykli 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s, z analizą krzywej stopienia, gdy było to stosowne, aby potwierdzić specyficzność amplikonu. Poziomy ekspresji NEAT1 i HMGB1 zostały znormalizowane do GAPDH, a ekspresja miR-181a-5p została znormalizowana do małego jądrowego RNA U6. Ekspresja względna została obliczona metodą 2-ΔΔCt i wyrażona jako zmiana fałdów w porównaniu z grupami kontrolnymi. Sekwencje primerów i rozmiary ampliconów zostały zebrane w osobnym arkuszu kalkulacyjnym do złożenia jako Tabela Uzupełniająca 1.

Western blotting

W przypadku western blottingu komórki były dwukrotnie myte lodowatym PBS i lizowane w odpowiednim buforze radioimmunoprecipitacyjnym (RIPA) wzbogaconym inhibitorami proteazy. Lizaty inkubowano na lodzie przez 15-30 minut z okazjonalnym delikatnym mieszaniem, a następnie wirowano w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Pobrano supernatanty, a stężenia białek określono za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA).

Równe ilości białka (zazwyczaj 40 μg na tor) były mieszane z buforem ładowaniem, gotowano w temperaturze 95 °C przez 5-10 minut w celu denaturacji białek oraz rozdzielano na żelach dodecylosiarczanu sodu (SDS)-poliakrylamidu o odpowiednim stężeniu akryloamidu (na przykład 10-12% dla HMGB1). Białka były przenoszone na membrany z fluorku poliwinylidenu (PVDF) za pomocą mokrego lub półsuchego systemu transferu w warunkach zalecanych dla interesującego zakresu masy cząsteczkowej. Błony były blokowane 5% mlekiem beztłuszczowym lub albuminą surowicy bydłej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko HMGB1 (na przykład rozcieńczenie 1:500) i GAPDH (na przykład rozcieńczenie 1:1 000) rozcieńczone w buforze blokującym. Po trzech płukaniach w TBST membrany były inkubowane odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z nadtlenkiem chrzanu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po kolejnych płukaniach zobrazowano pasma białkowe za pomocą podłoża o wzmocnionej chemiluminescencji i uchwycono cyfrowym systemem obrazowania. Intensywności pasmowe były kwantyfikowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, sygnały HMGB1 zostały znormalizowane do GAPDH, a ekspresja względna porównywana między grupami.

Test reportera z podwójną lucyferazą

Fragmenty typu dzikiego i mutantów NEAT1 oraz obszaru HMGB1 3′-nieprzetłumaczonego (3′-UTR) zawierającego przewidywane miejsca wiązania miR-181a-5p zostały sklonowane do wektora reportera lucyferazy¹⁹. Wszystkie konstrukty zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie Sanger, aby potwierdzić miejsce wszczepienia i mutacji²⁰. Komórki RAW264.7 zostały zasiane w płytkach z 24 dołkami i pozostawione do przylegania przez noc. Komórki były następnie współtransfekowane plazmidami reporterowymi oraz inhibitorami miR-181a-5p, mimikami lub odpowiadającymi im negatywnymi kontrolami za pomocą lipidowego reagenta transfekcyjnego, jak opisano w ogólnej procedurze transfekcji.

Po około 24-48 godzinach inkubacji komórki były myte PBS, lizowane w odpowiednim pasywnym buforze lizowym (np. 20 μL na dołek) i delikatnie mieszane, aby zapewnić pełną lizę. Aktywność lucyferazy mierzono za pomocą zestawu do testów podwójnej lucyferazy oraz luminometru, zgodnie z instrukcjami producenta. Aktywność lucyferazy świetlików została znormalizowana do aktywności lucyferazy Renilla, aby kontrolować efektywność transfekcji, a względna aktywność lucyferazy każdej grupy została porównana z odpowiadającą grupą kontrolną.

Badanie migracji przechodu przejścia

Migracja makrofagów została oceniona za pomocą komór transwell wcześniej pokrytych żelem macierzy zewnątrzkomórkowej odpowiednim do testów inwazji komórek. Żel rozcieńczono w stosunku 1:6 w medium bezsurowicowym na lodzie, a na górną powierzchnię każdej wkładki dodano 50 μL rozcieńczonego roztworu. Płytka była inkubowana w temperaturze 37 °C przez około 4 godziny, aby żel mógł się zastygnąć. Pobrano lub poddano zabiegom przetworzone lub obtraktowane komórki RAW264.7, które ponownie zawieszono w medium bezsurowicowym w ilości 1× 10⁶ komórek/mL, a do górnej komory dodano 100 μL zawiesiny komórkowej (1 × 10^{5 komórek} ). Dolna komora wypełniona była 600 μL kompletnego medium zawierającego 10% surowicy płodowej bydła jako chemioatraktant.

Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 przez 24 godziny. Na końcu inkubacji niemigrujące komórki pozostające na górnej powierzchni błony były delikatnie usuwane patyczkiem. Migrujące komórki przyczepiające się do dolnej powierzchni błony były utrwalane 95% etanolem przez około 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie barwione roztworem 0,5% kryształowego fioletu przez 10-15 minut. Nadmiar barwnika usuwano przez mycie PBS, a membrany suszono na powietrzu. Migrowane komórki badane były pod mikroskopem świetlnym, a komórki w kilku losowo wybranych polach na każdą inserwację liczono w sposób zaślepiony, aby ilościowo określić zdolność migracyjną.

Badanie apoptozy TUNEL

W celu wykrycia apoptozy komórki RAW264.7 zostały wyhodowane na szklanych pokrywkach i poddane wskazanym zabiegom lub transfekcjom. Komórki były utrwalane 4% paradehydem przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej i płukane PBS. Endogenna aktywność nadtlenku była blokowana przez inkubację w 0,3% nadtlenku wodoru przez 20 minut, po czym nastąpiły płukania PBS. Użyto zestawu testowego TUNEL, a mieszanka etykietowa została nałożona do pokrycia komórek. Próbki inkubowano w temperaturze 37 °C przez około 60 minut w nawilżonej komorze, a reakcja została zatrzymana zgodnie z instrukcjami zestawu. Po inkubacji streptawidyną-HRP lub równoważnym odczynnikiem wykrywającym przez 30 minut w temperaturze 37 °C, jądra były wizualizowane za pomocą chromogenicznego substratu, takiego jak 3,3′-diaminobenzydyna (DAB), aż do momentu, gdy pojawiły się brązowo barwione apoptotyczne jądra. Preparaty były impregnowane hematoksyliną, odwodnione przez oczyszczony etanol, czyszczone ksylenem i mocowane za pomocą medium trwałego. Komórki apoptotyczne i jądra całkowite obserwowano pod mikroskopem świetlnym, a indeks apoptotyczny obliczono jako procent komórek TUNEL-dodatnich.

Immunofluorescencja

W przypadku immunofluorescencji fragmenty tkanek osadzonych w parafinie były odwoskowane w ksylenie i nawadniane przez serię stopniowego etanolu do wody. Pobranie antygenów przeprowadzono przy użyciu odpowiedniego buforu (np. bufor cytrynianowy, pH 6,0) oraz pobranie epitopów wywołanych ciepłem w mikrofalówce lub szybkowarze, zgodnie z zaleceniami przeciwciała. Po schłodzeniu i płukaniu sekcje blokowano 5% prawidłową surowicą w PBS przez 1 godzinę w 37 °C, aby zmniejszyć wiązanie niespecyficzne. Tkanki były następnie inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko markerom polaryzacji makrofagów i cytokinom zapalnym, w tym CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, indukowalnym syntazie tlenku azotu (iNOS), IL-4, IL-10 i Arg-1 (zwykle w rozcieńczeniu 1:500), rozcieńczonych w buforze blokującym.

Następnego dnia sekcje były myte w PBS i inkubowane odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforem przez 1 godzinę w 37 °C w ciemności. Jądra były barwione kontrastowo 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) przez 5 minut. Po końcowych płukaniach sekcje były montowane za pomocą medium antyfade i badane pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów. Obrazy były wykonywane z jednolitymi ustawieniami ekspozycji dla różnych grup, a paski skali (na przykład 20 μm) i powiększenia były wskazywane we wszystkich panelach figurowych i legendach.

Model myszy wywołany przez CLP sepsą

Mężczyźni myszy C57BL/6 (24-32 g) byli aklimatyzowani co najmniej tydzień przed operacją, a następnie losowo przypisywani do grup Sham, CLP, CLP oraz negatywnie kontrolowanych krótkich włosów lub CLP z NEAT1 krótkimi spinkami (n = 6 w grupie). Myszy były znieczulone przez wdychanie eteru w zamkniętej komorze przez około 1-3 minuty, aż do utraty odruchu odruchowego lub innego znieczulenia zatwierdzonego przez instytucję w dawce i czasie ekspozycji, które powodowały utratę odruchu prostowania przy zachowaniu odpowiedniej funkcji oddechowej. Włosy na brzuchu zostały ogolone, a skóra zdezynfekowana odpowiednim środkiem antyseptykiem. Wykonano laparotomię linii środkowej o długości około 1-2 cm, aby odsłonić cekum wraz z przylegającym jelitem.

W przypadku CLP nasyp był delikatnie zezeteriorizowany i podwiązywany sterylnym szwem na około dwóch trzecich długości, przy czym nie zatkał zastawki kościowo-krętoskórowej ani nie osłabił przepływu krwi krezkowej. Podwiązany cekum był przekłuwany dwukrotnie sterylną igłą o skali określonej w zatwierdzonym protokole (na przykład 21 G), a niewielka ilość kału była delikatnie wyciskana, aby zapewnić przechodzliwość miejsc nakłucia. Następnie naczyń był wracany do jamy otrzewnej, a ściana brzucha i skóra zostały zamknięte warstwami za pomocą szwów. Myszy operowane na falę przechodziły tę samą laparotomię i ekspozycję na cekumę bez podwiązania czy nakłucia.

Aby osiągnąć in vivo obniżenie poziomu NEAT1, przygotowano wektor adenowiratowy kodujący shNEAT1 oraz odpowiadający mu wektor kontroli ujemnej przy określonym miacie (na przykład 1 × 10 9 jednostek tworzących^płytki /mL). Stała objętość zawiesiny wirusowej (np. 100 μL na mysz) była podawana przez żyłę ogonową w określonym czasie względem CLP (na przykład 1 godzinę po operacji), zgodnie z projektem eksperymentalnym i zatwierdzonym przez komisję etyczną. Po operacji myszy otrzymywały standardową opiekę pooperacyjną, w tym resuscytację płynem podskórnym, jeśli było to wskazane, oraz monitorowano kliniczne objawy sepsy i niedogodności. W wyznaczonym czasie zwierzęta były uśpione humanitarnie przez przedawkowanie wdychania eteru w zamkniętej komorze, przy użyciu około 5-10 ml eteru w celu szybkiego zatrzymania oddechu, następnie potwierdzenia zgonu, pobrano krew do analizy cytokin, a organy pobrano do histopatologii, immunofluorescencji i badań molekularnych.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna była przeprowadzana przy użyciu SPSS w wersji 23.0 lub równoważnego pakietu oprogramowania statystycznego. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchyleniu standardowym (SD), chyba że zaznaczono inaczej. Do porównań między dwiema grupami zastosowano test t-Studenta niesparowany, gdy dane były zwykle rozłożone z jednorodnymi wariancjami. Do porównań między trzema lub więcej grupami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie odpowiednie testy post hoc dla wielokrotnych porównań, gdy wykryto istotny ogólny efekt. Dwustronna wartość p < 0,05 uznana była za statystycznie istotną. Znaczenie symboli statystycznych (na przykład p < 0,05, *p < 0,01) zostało określone w legendach rysunków, a liczba replikacji biologicznych jest wskazana w odpowiednim tekście lub legendach.

Wyniki

Wykrywanie ekspresji NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 oraz interakcji w sepsie

W surowicy u pacjentów z sepsą poziomy NEAT1 i HMGB1 były istotnie wyższe niż u zdrowych grup kontrolnych, podczas gdy miR-181a-5p był wyraźnie obniżony. Podobne wzorce ekspresji zaobserwowano w PBMC oraz w makrofagach RAW264.7 stymulowanych lipopolisacharydem, co wskazuje, że ta oś jest konsekwentnie zmieniana w sepse i stanach zapalnych podobnych do sepsy (Rysunek 1A-C...

Dyskusja

Sepsa charakteryzuje się głęboką i często długotrwałą dysregulacją odporności, w której fazy hiperzapalenia i immunosupresji współistnieją i wspólnie przyczyniają się do niewydolności narządów oraz złych wyników^21,22. Rosnące dowody wskazują, że długie niekodujące RNA (lncRNA) uczestniczą w tych procesach poprzez modulację sygnalizacji zapalnej i polaryzacji makrofagów^23,24. Na przykład lncRNA-MAAMT zgłas...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wektor adenowiryczny (shNEAT1)	10692-V5	Vigene Biosciences	Adenowirus stosowany do obniżania ekspresji NEAT1 in vivo oraz in vitro.
Zestaw do testowania białek BCA	23227	Thermo Fisher	Kit używany do ilościowego określenia stężenia białek w lizatach komórkowych.
Zestaw do testowania reportera z podwójną lucyferazą	E1910	Promega	Zestaw używany do testów reportera z podwójną lucyferazą do pomiaru interakcji miR-181a-5p.
Zestawy ELISA (cytokiny)	Nie ma	R& D Systems	Zestawy używane do pomiaru poziomu cytokiny w próbkach surowicy i tkanek.
Serum bydła płodu (FBS)	16000-044	Gibco	Suplement stosowany w podłożu hodowlanym do wzrostu komórek.
Przeciwciało GAPDH	2118 S	Technologia sygnalizacji komórkowej	Główne przeciwciało przeciwko GAPDH stosowane jako kontrola obciążenia w western blot.
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	Nie ma	Thermo Fisher	Zestaw używany do histologicznego barwienia przekrojów tkanek w celu analizy patologicznej.
Przeciwciała immunofluorescencyjne (CD206)	14693-1-AP	Proteintech	Przeciwciała używane do wykrywania markera makrofagów M2 CD206 w przekrojach tkanek.
Lipopolisacharyd (LPS)	L2630	Sigma-Aldrich	LPS używany do indukowania polaryzacji makrofagów zapalnych w komórkach RAW264.7.
miR-181a-5p Mimic	Nie ma	Nie ma	Syntetyczny mimik miR-181a-5p używany do modulacji poziomów miR-181a-5p.
Plazmid ekspresji NEAT1	Nie ma	Nie ma	Plazmid używany do nadekspresji NEAT1 w makrofagach RAW264.7.
Komórki makrofagów RAW264.7	TIB-71	ATCC	Linia komórek makrofagów myszy wykorzystywana do eksperymentów in vitro.
Bufor lizy RIPA	89901	Thermo Fisher	Bufor używany do lizowania komórek w celu wydobycia białka całkowitego.
RPMI-1640 Medium	11875-093	Gibco	Podłoże hodowlane dla makrofagów RAW264.7.
SYBR Green Master Mix	4385612	Thermo Fisher	Odczynnik używany do ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym.
Komory do testowania migracji transwella	3422	Corning	Komory używane do testów migracji przejściowych do oceny migracji makrofagów.
Zestaw do badania apoptozy TUNEL	ab66110	Abcam	Zestaw używany do wykrywania apoptozy w komórkach RAW264.7 za pomocą barwienia TUNEL.
Zachodnie przeciwciała blotyczne (HMGB1)	ab18256	Abcam	Główne przeciwciało przeciwko HMGB1 stosowane w western blotting.